材料和试剂

TaqMan ^® Universal Master Mix II no UNG（Life Technologies，catalogue number：4440039）
TaqMan MGB探针（定制合成）（Life Technologies）
EZ DNA甲基化-Gold ^TM试剂盒（ZymoResearch，目录号：D5006）
甲基化特异性引物和探针序列（参见配方）

设备

PCR室
PCR板
离心机（Sigma-Aldrich）
PCR热循环仪（Life Technologies/Applied Biosystems，型号：9700）
实时PCR仪（Life Technologies/Applied Biosystems，型号：7500FAST）

程序

底漆/探针设计
注意：引物/探针设计对于反应的特异性是非常重要的，即在过量的未甲基化的靶的存在下扩增仅甲基化的亚硫酸氢盐转化的靶。引物应包括3-5个CG二核苷酸。在引物的6个3'末端内包含至少两个这样的CG显着增加了特异性。这是除了引物稳定性，GC含量和二级结构避免的通常规则适用于实时PCR测定设计。
使用EZ DNA甲基化-Gold< sup>试剂盒并根据供应商的方案，但是在50μl洗脱缓冲液（而不是推荐的10μl）中洗脱，通过亚硫酸氢钠将1μgDNA转化。

qMSP反应包含1×TaqMan通用Master Mix II非UNG，250nM探针，300-900nM引物（表1）和2μl来自亚硫酸氢盐处理的DNA样品的洗脱液。
注意：引物浓度是分析灵敏度/特异性的重要决定因素，并且必须通过实验确定。换句话说，分析灵敏度阈值设置为与未甲基化对照反应具有重叠95％置信区间的稀释度。实际上，可以使用的最高灵敏度是总是至少为2ΔCt的灵敏度。低于未甲基化对照。

表1.寡核苷酸混合物的引物探针浓度

引物/探针混合物	最终浓度（nM）
引物/探针混合物	前导	Rev Primer	探头
p16	700	700	250
TERT	250	250	250
RASSF1	700	700	250
TMEFF2	900	900	250
CYGB	300	300	250
RARb	500	500	250
DAPK1	250	250	250
p73	250	250	250
WT1	750	750	250
CDH13	250	250	250
ACTB	900	900	250

将PCR板密封并以4,000×g跨越1分钟，然后置于热循环仪中，以使所有反应体积到底部，并确保从反应混合物中除去气泡。 />

在7500FAST实时循环仪上，在以下热曲线下进行一式两份的反应：95℃10分钟活化步骤，然后是50个循环，包括95℃变性15秒，退火和58℃-100℃延伸， 65℃（表2，取决于测定）1分钟
表2. qMSP优化条件的退火信息

基因	退火温度（℃）	时间（秒）
p16	60	60
RASSF1	60	60
CYGB	64	5
CYGB	61	55
RARB	65	5
RARB	62	55
TERT	65	5
TERT	62.5	55
WT	62	60
WT	62	60
ACTB	58	20
ACTB	60	40
CDH13	64	5
CDH13	61	55
DAPK	65	5
DAPK	62.5	55
P73	65	5
P73	62.5	55
TMEFF	58	20
TMEFF	60	40

食谱

甲基化特异性引物和探针序列列于表3中。在测定开发的初始步骤中，显而易见的是，具有小沟结合部分（Taqman MGB探针）的探针提供了显着更高的测定特异性。此外，由于其尺寸较小，它们允许更灵活的测定设计
表3.甲基化特异性引物和探针的核苷酸序列用于BW筛选中使用的qMSP测定。 ACTB测定甲基化独立作为DNA输入控制

引物/探针名称	顺序5'→3'	修改
p16meth_F	GGAGGGGGTTTTTTCGTTAGTATC
p16meth_R	CTACCTACTCTCCCCCTCTCCG
p16meth_P	AACGCACGCGATCC	FAM-MGB
RASSF1meth_F	GTGGTGTTTTGCGGTCGTC
RASSF1meth_R	AACTAAACGCGCTCTCGCA
RASSF1_P	CGTTGTGGTCGTTCG	FAM-MGB
TMEFF2meth_F	GGAGAGTTAAGGCGTTTCGTAGTTC
TMEFF2meth_R	CGTGGGAAGAGGTAGTCGGG
TMEFF2meth_P	GTTTTTAGTTCGTTCG	FAM-MGB
TERTmeth_F	TTGGGAGTTCGGTTTGGTTTC
TERTmeth_R	CACCCTAAAAACGCGAACGA
TERTmeth_P	AGCGTAGTTGTTTCGG	FAM-MGB
CYGBmeth_F	GTGTAATTTCGTCGTGGTTTGC
CYGBmeth_R	CCGACAAAATAAAAACTACGCG
CYGBmeth_P	TGGGCGGGCGGTAG	FAM-MGB
RARbmeth_F	GATTGGGATGTCGAGAACGC
RARbmeth_R	ACTTACAAAAAACCTTCCGAATACG
RARbmeth_P	AGCGATTCGAGTAGGGT	FAM-MGB
DAPK1meth_F	CGAGCGTCGCGTAGAATTC
DAPK1meth_R	ACCCTACAAACGAACTAACGACG
DAPK1meth_P	AGCGTCGGTTTGGTAG	FAM-MGB
p73meth_F	TTGTTTTTTGGATTTTAAGCGTTTC
p73meth_R	CACCCGAATCTCTCCTAACCG
p73meth_P	TAACGCTAAACTCCTCG	FAM-MGB
WT1meth_F	GAGGAGTTAGGAGGTTCGGTC
WT1meth_R	CACCCCAACTACGAAAACG
WT1meth_P	AGTTCGGTTAGGTAGC	FAM-MGB
CDH13meth_F	CGTGTATGAATGAAAACGTCGTC
CDH13meth_R	CACAAAACGAACGAAATTCTCG
CDH13meth_P	CGTTTTTAGTCGGATAAAA	FAM-MGB
ACTBmgb_F	GGGTGGTGATGGAGGAGGTT
ACTBmgb_R	TAACCACCACCCAACACACAAT
ACTBmgb_P	TGGATTGTGAATTTGTGTTTG	VIC-MGB

通过计算ΔCt= Ct（靶）-Ct（ACTB）来对于每个靶的循环阈值（Ct）值进行标准化。与包括在使用以下类型的所有实验中的校准物（0.5％标准甲基化DNA稀释物）相比，将α样品的值转化为相对量（RQ）：
RQ子样品 = 2 ^-ΔΔCt，其中ΔΔCt=ΔCt样品注意：qMSP是实时PCR的具有挑战性的版本，需要在进行qMSP实验之前获得对后者的非常好的理解。主要的额外挑战是使用质量较低但最重要的是较低复杂性的亚硫酸氢盐DNA。这显着影响该模板在反应中的热力学行为。作者非常乐意在需要时向同事提供帮助;请发送电子邮件至Dr. T Liloglou（ tliloglo@liv.ac.uk ）。

致谢

该协议改编自Nikolaidis等人（2012）。

参考文献

Liloglou，T.，Bediaga，N.G.，Brown，B.R.，Field，J.K.and Davies，M.P。（2012）。肺癌中的表观遗传学生物标志物。 Cancer Lett 342（2）：200-212。
Nikolaidis，G.，Raji，O.Y.，Markopoulou，S.，Gosney，J.R.，Bryan，J.，Warburton，C.，Walshaw，M.，Sheard，J.，Field，J.K.and Liloglou， DNA甲基化生物标志物可提高肺癌的诊断效率。 Cancer Res 72（22）：5692-5701。