材料和试剂

淋巴细胞-M（Cedarlane，目录号：CL5035）
小鼠NK细胞来源：C57Bl/6小鼠（Charles Rivers，菌株代码：027）
NK缺陷小鼠（Jackson Labs，菌株名称：B6.129S4-II2rg tm1Wi1/J，菌株号：003174）
戊二醛
亚铁氰化钾
铁氰化钾
牛血清白蛋白（BSA）
100x非必需氨基酸
胎牛血清（FBS）
丙酮酸钠
脱氧胆酸盐
B16F10lacZ黑素瘤肿瘤细胞，在完全DMEM（Dr.G.Graham，London Regional Health Center，London ON）中生长。
1×无菌PBS（Hyclone，目录号：21-031-CV）
X gal（Bioshop Canada Inc.，目录号：XGA001-1）
运行缓冲液（Miltenyi Biotech，目录号：130-091-221）
洗涤缓冲液（Miltenyi Biotech，目录号：130-092-987）
AutoMACS pro柱（Miltenyi Biotech，目录号：130-021-101）
RPMI 1640（Hyclone，目录号：SH300027.01）
AutoMACS缓冲区（请参阅配方）
完成RPMI（参见配方）
NK细胞培养基（参见配方）
LacZ染色溶液（参见配方）

设备

50ml管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352098）
15ml管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352096）
胰岛素注射器27G1/2"（Terumo Medical Corporation，目录号：SS05M2713）
AutomacsPro Separator（Miltenyi biotech，型号：130-092-545）
培养箱（5％CO 2，37℃）（Sanyo）
离心机（未指定制动器参数时，使用最大加速度和减速度），（Thermo Fisher Scientific，型号：ST40R）
解剖器械（小钳子，剪刀）
光学显微镜（Leica）
细胞过滤器70μm（Thermo Fisher Scientific，目录号：22363548）
DX5（CD49b）微珠（Miltenyi Biotech，目录号：130-052-501）

程序

供体小鼠的治疗 - 小鼠手术应力模型
1. 在收获脾NK细胞以转移到受体小鼠中之前18小时，用腹部左肾切除术（手术应激）处理供体小鼠（6-8周龄，各自重约20g）。
2. 3 C57Bl/6小鼠通常足以获得2.0×10 6个NK细胞。然而，对于可能导致淋巴细胞减少或淋巴细胞迁移到周围的任何体内治疗（即体内病毒感染）需要。
3. 准备解剖器械收获脾细胞
收获供体脾细胞
1. 在开始收获前1小时，从4℃除去淋巴细胞。淋巴细胞需要在室温下使用并保护光线（在生物安全柜下关灯）。
2. 为每个脾准备一个50ml管和两个15ml管。在每个打开的50ml管上放置70μM细胞过滤器。用1ml冷的1×PBS对每个过滤器进行预处理。加入5ml的淋巴细胞到每个15毫升管（保护管从光）。
  注意：1只脾脏需要两根15ml的管，每根管含有5ml的淋巴细胞。
3. 安乐死小鼠颈椎脱位，取出脾脏，并置于70μM滤网上
4. 粉碎1脾在70μM细胞过滤器在50ml管，用10毫升1×PBS冲洗两次（我经常冲洗过滤器的下面，如果可见的脾脏的观察）。如果需要，使用相同的过滤器再次用10ml 1×PBS进行过滤。在500摄氏度下旋转，5分钟，4℃
5. 弃去上清液并将脾细胞沉淀重悬于10ml 1x PBS中。小心地将5mL重悬浮的脾细胞层置于淋巴层上（5ml第一个15ml管，然后剩余5ml上的第二个15ml管））。旋转1,500分钟，室温，15分钟，加速度为1，减速度为2（最小速度）。
6. 小心吸取淋巴细胞层（底部淋巴细胞和顶部PBS之间的模糊界面层），并转移到新的50ml管中。您可以在这里结合小鼠治疗（例如所有相同的治疗）。
7. 用1x PBS填充50ml管（首先洗涤以除去过量的淋巴细胞）。在500℃下旋转5分钟，4℃。
8. 弃去上清液。重悬在10ml AutoMACS缓冲液中的沉淀。如步骤B-7中那样旋转。舍弃上层。
NK细胞分选（用DX5微珠）
1. 重悬脾细胞沉淀在每个脾脏300微升AutoMACS缓冲液（我们通常每管3个脾）。
2. 每个脾脏添加100微升DX5微珠（制造商建议100微升珠体积为1 x 10 8或更少的细胞）并混匀。在4℃孵育15分钟。
3. 加入10毫升AutoMACS缓冲液停止DX5孵化。旋转，如步骤B-7
4. 弃去上清液。在500μlAutoMACS缓冲液/脾（例如对于3个池脾脏1.5ml）中重悬沉淀物。
5. 继续排序。在最后一次旋转期间打开AutoMACS Pro排序器，并在开始之前冲洗。
6. 将管（输入A，阴性部分在B，阳性部分在C）放在架子里。用于分拣的管的尺寸取决于所使用的AutoMACS机架。通常为3支架的标准50毫升管，5支架的15毫升管和5毫升6支架的流式细胞仪管。 "阴性部分"表示分选后的洗脱液，其含有DX5 +非NK细胞。 "阳性分数"表示分选后的洗脱液，其含有DX5 ⁺ NK细胞。
7. 选择程序：在每个管之间快速冲洗（qrinse），并在最后一个管之后冲洗。开始排序。
8. 分选后，计数阳性分份管中的DX5 +细胞数（2ml总体积），并测定细胞浓度。向下旋转。通过流式细胞术测定的NK细胞纯度（DX5 ⁺，TCRb ^-）通常> 90％。
NK细胞转移和肿瘤注射
1. 在无菌1×PBS细胞中重悬1.0×10 6个DX5 + sup/+ NK细胞，并通过尾静脉注射（100μl总体积）注射到NK缺陷小鼠中。
2. 在NK细胞注射后1小时，将3×10 5个B16lacZ肿瘤细胞重悬于100μl无血清DMEM（通过台盼蓝测定大于90％生存力）中，通过尾静脉注射（100μl总计体积）进入相同的NK缺陷小鼠注意：对于手术应激实验的小鼠模型，受体NK缺陷小鼠从手术应激和未治疗的对照供体小鼠接受NK细胞。
3. 允许小鼠在肿瘤细胞注射后存活3天
B16lacZ肺肿瘤定量
1. NK和肿瘤细胞注射后3天，安乐死受体小鼠，并提取所有5个肺叶
2. 为了提取肺，通过穿过皮肤和皮下层沿着小鼠胸腔的腹侧中线切开暴露胸部。接下来，通过每侧的皮肤和组织进行横向切口直到小鼠的颈部。然后，用手术钳轻轻抓住肺，轻轻地摘除肺上方和下方的结缔组织。
3. 在磷酸盐缓冲液（pH 7.3）中冲洗肺。
4. 将肺放入含有5ml冰冷的磷酸盐缓冲液（pH 7.3）的闪烁瓶中。保持冰上直到下一步。
5. 倒出磷酸盐缓冲液，小心不要失去肺。通过加入固定溶液（8ml /瓶）将肺固定20分钟
6. 在洗涤缓冲液（8ml /瓶）中洗涤两次，每次10分钟
7. 在37℃下用Xgal染色过夜（12-18小时-2ml /小瓶）
8. 用洗涤缓冲液洗涤一次（5ml /瓶10分钟），然后加入新鲜的洗涤缓冲液（10ml /瓶）并在4℃下储存过夜。染色将加剧。
9. 吸出洗涤缓冲液，加入15 ml /瓶10％缓冲福尔马林保存。
10. 用光学显微镜定量肺转移。
11. 参见图1：显示了在肿瘤细胞静脉内注射后第3天描绘B16lacZ肺转移的代表性肺图。
  
  图1.显示在肿瘤细胞静脉内注射后第3天的B16lacZ肺肿瘤转移的代表性肺图片

食谱

Automacs缓冲液在500 ml
PBS
2.5g牛血清白蛋白
2ml 5mM EDTA
在500 ml完成RPMI
500ml RPMI-1640
50 ml热灭活胎牛血清
5ml青霉素 - 链霉素10,000U/ml/ml
NK细胞培养基
500 ml cRPMI
5 ml 1 M HEPES
5ml 100mM丙酮酸钠 5 ml 100x非必需氨基酸
0.5ml 2-巯基乙醇，最终浓度为5×10 -5 M
LacZ染色工作溶液
1. 0.1M磷酸盐缓冲液，5L pH7.3 15.87g磷酸二氢钠（MW 137.99） 54.67g磷酸二氢钠（MW 141.96）
  溶解到5L dH 2 O中
2. 900 ml固定溶液
  45ml 100mM EGTA（pH7.3）
  1.8ml 1M氯化镁 846ml 0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.3）准备没有戊二醛的储备溶液
  当您准备使用时，将1.8毫升25％的戊二醛分装到223.3毫升的原液中。
  这将允许您准备225毫升新鲜固定溶液。
3. 洗涤缓冲液3.6 L
  7.2ml 1M氯化镁
  36ml 1％脱氧胆酸盐 36ml 2％Nonidet-P40
  3,520.8ml 0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.3）
4. 25mg/ml X gal母体
  1克X gal在40毫升DMSO中的溶液
5. X gal染色在1 L
  40ml 25mg/ml X gal母体
  2.12g氰亚铁酸钾（MW 422.2）
  1.64g氰铁酸钾（MW 329.2）
  960 ml洗涤缓冲液

致谢

该协议改编自以下论文：Kirstein等人（2009）。这项研究由加拿大癌症协会研究所，安大略省区域生物治疗（ORBiT）计划，私人捐助者（D.H.）渥太华医院基金会（R.A. Auer）和魁北克省魁北克省医院（L.-H. Tai和S. Belanger）。

参考文献

Kirstein，J.M.，Graham，K.C.，Mackenzie，L.T.，Johnston，D.E.，Martin，L.J.，Tuck，A.B.，MacDonald，I.C。和Chambers，A.F。抗纤维蛋白溶解疗法对实验性黑色素瘤转移的影响临床转移性转移 26（2）：121-131。