材料和试剂

人胚胎肾HEK293细胞（Health Protection Agency Culture Collections，目录号：96121229）
生物素试剂：EZ-link Sulfo-NHS-LC-LC-生物素（Thermo-Pierce，目录号：21338）
电泳级甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G8898）
固定化/NeutrAvidin Ultralink树脂（Thermo-Pierce，目录号：53150）
Pierce BCA蛋白测定试剂盒（Thermo-Pierce，目录号：23227）
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（GE Healthcare Life Sciences，目录号：RPN303F）
脱脂奶粉（AppliChem GmbH，目录号：A0830）
化学发光底物：超级信号西飞最大灵敏度底物（Thermo Fisher Scientific，目录号：34096）
X射线胶片：Amersham Hyperfilm ECL（GE Healthcare Life Sciences，目录号：28-9068-35）
一抗
1. 兔抗人Na v 1.5抗体（Alomone Labs，目录号：ASC-013）
2. 小鼠抗Na +/+/K ^{+ ATP酶（Abcam，目录号：ab7671）}
二抗
1. 稳定的山羊抗小鼠IgG（H + L），过氧化物酶缀合的（10μg/ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：32430）
2. 稳定的山羊抗兔IgG（H + L），过氧化物酶缀合的（10μg/ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：32460）
蛋白酶抑制剂Cocktail（Roche Tablets，目录号：11 836 170 001）
DPBS与钙和镁（DPBS ⁺）（参见配方）
裂解缓冲液LB1，LB2，LB3（参见配方）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（参见配方）
盐水洗涤液（SWS）（见配方）
3x凝胶加样缓冲液（见配方）
SDS-PAGE凝胶（参见配方）
5x运行缓冲区（参见配方）
10x Western印迹转移缓冲液（参见配方）

设备

35mm皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：153066）
6孔细胞培养板（BD Biosciences，目录号：353046）
细胞刮刀（VWR International，目录号：734-2603）
96孔微量测试板（Sarstedt，目录号：82.1581）
轨道^TM LS低速振荡器（LABNET，目录号：S-2030-LS）
旋转轮（Noria R NR50，Ovan，目录号：10000-00062）
微量离心机R5415（Eppendorf，目录号：022621425）
数字热块（VWR International，目录号：460-3267）
微量板阅读器基准加（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-6936）
Mini-PROTEAN Tetra Cell（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-8000）
Mini Bio-Blot Module（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-3935）
PowerPac HC电源（Bio-Rad Laboratories，目录号：164-5052）

软件

ImageJ软件（可在 http://rsb.info.nih.gov/ij ）（国家卫生研究所，NIH）

程序

生物素化
注意：在冰上进行所有孵育。
1. 从要研究的细胞中取出生长培养基，培养在35 mm平板上注意：我们使用人胚胎肾HEK293细胞作为实验模型。将细胞在37℃和5％CO 2下维持在补充有10％胎牛血清，1％青霉素 - 链霉素和1％Glumtamax的Dulbecco's Modified Eagle's培养基中。
  我们在35mm皿中铺平大约2.1×10 5个HEK293细胞，但是该值可以根据细胞系生长的快慢而变化（这将导致24小时后70％的汇合，这是转染的天）。转染后48小时，我们进行细胞表面蛋白生物素化方案。
2. 用1ml冰冷的DPBS ⁺洗涤细胞两次。
3. 在冰室中在冰上温育细胞30分钟，同时用400μl每板生物素溶液（2.5mg/ml生物素试剂，在DPBS中）轻轻摇动。
4. 在冰箱中，在冰箱中，在温和摇动的情况下，用1ml冷的100mM甘氨酸的DPBS溶液洗涤每个板5分钟，每次3分钟。
5. 用如上所述的DPBS ⁺中的1ml冷的20mM甘氨酸洗涤每个板5分钟两次。
6. 用200μl裂解缓冲液LB3裂解到每个板中，并使用细胞刮刀分离细胞。收集细胞裂解物在1.5毫升管
7. 对于裂解，将管在冷室中以慢速1小时置于旋转轮中
8. 在进行裂解时，制备固定化/NeutrAvidin Ultralink珠：对于每个样品，取40μl50％浆液的NeutrAvidin珠，并用0.5ml DPBS +洗涤珠两次，再用0.5μl ml LB2（用于洗涤，在4℃以3,000xg离心30秒，并除去上清液）。最后一次洗涤后，用20μlLB3重悬沉淀的珠子。
9. 在4℃下以16,000×g（最大速度）旋转裂解物15分钟。
10. 将上清液（溶解的材料）转移到1.5ml管。将每种上清液的10-15％保存在另一个管中，并储存在-80℃（这些是INPUT样品，其余的上清液将称为PULL-DOWN样品）。
11. 将下拉样品与步骤8中制备的40μlNeutrAvidin珠子一起在旋转轮中以低速在冷室中孵育过夜。
12. 以16,000×g离心样品，在4℃下30秒
13. 用LB3洗涤珠一次，用LB2洗两次，用SWS洗两次，用LB1洗一次。每次，加入1ml适当的溶液，并在16,000×g离心，在4℃下30秒。
14. 重悬沉淀的蛋白质在25微升2×凝胶加载缓冲液。
15. 在加热块中将样品在70℃加热10分钟
16. 将下拉样品保持在-20°C，直到SDS-PAGE和Western印迹
蛋白质印迹
1. 使用部分输入样品，使用BCA蛋白测定试剂以及BSA标准品，按照制造商的说明书来定量蛋白质。从每个输入样品，将等量的蛋白质转移到新管中，并与3x凝胶上样缓冲液混合。将样品在70℃加热10分钟。
  注意：可以使用其他蛋白质定量方法，并且同样有效。
2. 在SDS-PAGE凝胶中加载步骤B-1中制备的输入的等分试样和下拉样品（无珠）的总体积。在装载之前，旋转样品以使珠粒沉淀
3. 在40 V运行凝胶，直到样品已经通过堆叠凝胶（大约30分钟）。此时，将电压提高到100 V，直到蓝色染料前沿几乎用完凝胶
4. 准备三明治：浸泡凝胶15分钟在Western印迹转移缓冲液摇动。通过用甲醇浸泡10秒，然后用水漂洗两次并用Western印迹转移缓冲液10分钟来激活聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。此外，湿两张滤纸和两个纤维垫与Western印迹转移缓冲液。用阴极侧的凝胶和阳极侧的膜构建三明治，在每侧有一张滤纸和一个纤维垫。
5. 转移蛋白质在PVDF膜在80伏在寒冷的房间2小时
6. 从夹心中取出膜，用含有0.1％Tween-20的PBS中的5％脱脂牛奶在室温下封闭1小时。
  注意：所有的蛋白质印迹孵育在振荡器中以低速进行。
7. 孵育膜与一抗在4℃过夜。
  注意：我们使用针对人Na v 1.5（感兴趣蛋白;兔多克隆，在含0.1％Tween-20的PBS中的5％脱脂奶中以1:1,000的比率）的抗体和Na （在具有0.1％Tween-20的PBS中的5％脱脂奶中以1:5,000的比率使用作为对照的膜蛋白）/em>
8. 用含有0.1％Tween-20的PBS洗涤三次，以在室温下完全覆盖膜（约20ml），每次10分钟。
9. 在室温下与适当的二抗孵育1小时注意：我们使用过氧化物酶缀合的山羊抗兔或抗小鼠IgG抗体用于Na + 1.5和Na + +/+/+ - ⁺ > ATP酶（在含有0.1％Tween-20的5％脱脂牛奶-PBS中的1:2,000）。
10. 用含有0.1％Tween-20的PBS洗涤两次，以在室温下完全覆盖膜（约20ml），每次10分钟。
11. 对于信号发展，使用化学发光底物，并按照制造商的说明。取出多余的试剂，并用透明塑料包装膜覆盖膜
12. 通过暴露于X射线胶片检测感兴趣的蛋白质（图1）。
  注意：为了标准化目的，膜蛋白也应作为对照。
  
  图1. Na v 1.5和Na ⁺ /K ⁺ ATP酶蛋白在WT和突变细胞的细胞表面生物素化后进行 />
定量
1. 使用透明模式以高分辨率扫描胶片。
2. 使用ImageJ软件进行带定量。按照用户指南说明，确定每个波段的强度值，作为固定区域内的积分密度（像素值之和）。
  注意：当目的是在多个重复中比较WT和突变体条件时，按以下步骤进行：
  1. 确定对应于用作对照的膜蛋白（分别为IC 和IC MUT ）的WT和突变条件的条带的强度值，以及蛋白的WT和突变条件（分别是I sub WT和I sub Mut）。
  2. 计算IC sub WT和IC sub MUT之间的比率以获得归一化因子（N sub）：< br />
    IC _WT/IC _MUT = N _f
  3. 通过在前一步骤中计算的归一化因子乘以I mut以获得校正的突变条件强度值（IC sub）：
    I _Mut x N _f = I C Mut
  4. 通过I sub WT分离IC sub以获得相对于I sub WT的突变条件的表达。
    
    IC /I WT =突变体相对表达
  5. 计算所有重复的突变体相对表达值的平均值，并进行统计分析以评估相对于WT的可能差异（图2）。
    
    图2.条形图显示了每个条件获得的强度值的平均值

食谱

注：除非另有说明，所有化学试剂均获自Sigma-Aldrich。

DPBS ⁺（对于2 L）
0.2g CaCl 2·h/v 0.4克KCl
0.4g KH 2 PO 4 sub/
0.2g MgCl 2 6H 2 O
16克NaCl
4.32g Na 2 HPO 4 sub 。 7H O
为了避免形成不溶性沉淀，添加除了CaCl 2 2以外的所有物质，并在冷室中在接近正确体积的情况下搅拌。在搅拌和冷却时，加入CaCl 2，并继续搅拌至少10分钟，直到溶液变澄清。加入milli-Q水至最终体积为2L。
LB1
50mM Tris/HCl（pH7.4） 150mM NaCl 1mM EDTA
LB2
LB1加1％（w/v）Triton X-100 为了充分混合，将溶液在旋转轮中的低温室中缓慢地放置1小时
LB2
对于每10ml溶液LB2，在使用前加入1片蛋白酶抑制剂混合物
1x PBS
8克NaCl
0.2克KCl
1.44g Na 2 HPO 4
0.24g KH 2 PO 4 sub/
SWS
0.1％Triton X-100的PBS（pH7.4）中 350 mM NaCl 5 mM EDTA
3x凝胶上样缓冲液
180mM Tris/HCl（pH6.8）
7.5％SDS
30％甘油 0.051％溴酚蓝
150 mM DTT
SDS-PAGE凝胶（用于2个凝胶，1.5mm厚）
1. 堆叠（4％）
  4.65ml H 2 O x / 1.88ml 0.5M Tris（pH7.4）
  0.75毫升丙烯酰胺：双丙烯酰胺30％溶液37.5：1
  75μl10％SDS
  45μl10％过硫酸铵
  15μlN，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）
2. 解决（4％）
  9.35ml H 2 O x / 3.75ml 1.5M Tris（pH8.8）
  1.46ml丙烯酰胺：30％双丙烯酰胺溶液37.5:1 150μl10％SDS
  69μl过硫酸铵10％
  23.1μlN，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）
5x运行缓冲液（1升）
5克SDS
144 g甘氨酸
30克Tris
10x Western印迹转移缓冲液（对于1L）
10克SDS
24.24克Tris
111.75克甘氨酸使用前，补充1x，加入20％甲醇

致谢

该方案用于：Riuró等人（2013）;和Tarradas等人（2013），但改编自以前发表的论文：Cuartero等人（2012）。在议定书制定时的资金来源包括西班牙部长萨尼迪达和Consumo向M. Verges的赠款（PI07/0895）;从PríncipeFelipe研究中心（CIPF）到Y. Cuartero（PR 01/2007）的奖学金;和Ramóny Cajal合同，从西班牙教育部长到西班牙部长M. Verges。资金实施时包括"La Caixa"基金会到R. Brugada; Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares（CNIC）Translational to R. Brugada（CNIC-03-2008）; Ministry of De Sanidad y Consumo to R. Brugada（PI08/1800）;财政部长奖学金或合同（FI09/00336，CD09/00055，CD10/00275，CD11/00063和PI2008/1800）;大学。的赫罗纳奖学金给H.Riuró（BR2012/47）; Ministeria de Sanidad y Consumo：Red Cooperativa de Insuficiencia Cardiaca（REDINSCOR）RD06/03/0018;和SociedadEspañoladeCardiología（2011，InvestigaciónBásica）。

参考文献

Cuartero，Y.，Mellado，M.，Capell，A.，Alvarez-Dolado，M.and Verges，M。（2012）。 Retromer调节极性Madin-Darby犬肾细胞中β-分泌酶的后内吞分选。交通 13（10）：1393-1410
Riuró，H.，Beltran-Alvarez，P.，Tarradas，A.，Selga，E.，Campuzano，O.，Vergés，M.，Pagans，S.，Iglesias，A.，Brugada，J.and Brugada，P 。（2013）。钠通道β2亚基的错义突变显示SCN2B 为新的brumada综合征的候选基因。 Hum Mutat 34（7）：961-966。
Tarradas，A.，Selga，E.，Beltran-Alvarez，P.，Perez-Serra，A.，Riuro，H.，Pico，F.，Iglesias，A.，Campuzano，O.，Castro-Urda，，Fernandez-Lozano，I.，Perez，GJ，Scornik，FS和Brugada，R。（2013）。在心脏钠通道的孔区域中的新型错义突变I890T引起brugada综合征。 a> PLoS One 8（1）：e53220。