材料和试剂

人宫颈上皮癌细胞系Hela（ATCC，目录号：CCL-2 TM）
Eagle's Minimum Essential Medium（ATCC，目录号：30-2003 TM）
胎牛血清（FBS）（ATCC，目录号：30-2020 TM）
5x siRNA缓冲液（GE Healthcare Dharmacon，目录号：B-002000-UB-100）
DharmaFECT 1siRNA转染试剂（GE Healthcare Dharmacon，目录号：T-2001-01）
siGENOME SMARTpool试剂（GE Healthcare Dharmacon）
甘油脱氢-3-磷酸脱氢酶（GAPD）（GE Healthcare Dharmacon，目录号：D-001140-01）
非靶向siRNA对照池（GE Healthcare Dharmacon，目录号：D-001206-13）

设备

12孔聚苯乙烯组织培养板（BD Biosciences，Falcon ，目录号：353043）
细胞培养孵育器：37℃和5％CO 2/h

程序

在含有10％FBS的Eagle's最低必需培养基中携带Hela细胞
胰蛋白酶消化，计数细胞，并重新饲养细胞12-16 h前击倒（见注1）。
在1x siRNA缓冲液中重悬siRNA，使终浓度达到5μM
将5μl5μMsiRNA加入到95μl无血清培养基中的低粘附管1中，轻轻点击试管或上下吹打混匀。
在另一管2中加入0.5〜5μlDharmaFECT 1试剂（见注2）至99μl无血清培养基中，轻轻敲击试管或上下吹打混匀（见注3）。
将步骤4-5中的两个管在室温下孵育5分钟
将步骤4的管1的内容物加入步骤5的管2（siRNA进入DharmaFECT），通过上下吹打轻轻混合，并在室温下再温育20分钟。
向所得的步骤7的混合物中加入800μl完全培养基（最终siRNA浓度为25nM）
从12孔组织培养板中取出培养基。向每个孔中加入步骤8的培养基混合物（总共1ml）（参见注释4）
在mRNA分析前再生长Hela细胞24-48小时，或对于蛋白质分析大于48小时
在整个敲除过程中应始终仔细监测细胞毒性。实验条件应始终由经验确定
每个实验应该具有"对照组"，包括未处理的细胞，阳性对照siRNA（例如，GAPD），阴性对照siRNA（例如，"非靶向"）。至少进行三次实验。

笔记

每种细胞类型的最佳细胞接种密度应始终根据经验确定。对于Hela细胞，在敲除程序开始时细胞密度应达到〜50％汇合
发现1μlDharmaFECT试剂产生良好的击倒结果
对不同的细胞系使用不同的DharmaFECT Transfection试剂。有关详细信息，请访问www.dharmacon.com。
对于步骤8-9：或者，也可以用800μl新鲜的完全培养基补充孔中的原始培养基，然后将步骤7的200μl试剂混合物均匀地"滴加"到每个孔中。

致谢

该方案在美国加利福尼亚州La Jolla的Scripps研究所免疫学系中开发，并改编自Elbashir等人（2001），Hamilton和Baulcombe（1999）和Hannon和Rossi（2004））。这项工作由NIH资助，CA079871和CA114059，加州大学的烟草相关疾病研究计划，15RT-0104给Jiing-Dwan Lee博士[见Chen等人。）]。

参考文献

Chen，Y.，Lu，B.，Yang，Q.，Fearns，C.，Yates，J.R.，3rd和Lee，J.D。（2009）。组合整合素磷蛋白分析和基于小干扰RNA的功能筛选确定了癌细胞粘附的关键调节因子，。 Cancer Res 69（8）：3713-3720。
Elbashir，S.M.，Harborth，J.，Lendeckel，W.，Yalcin，A.，Weber，K.and Tuschl，T。（2001）。 21核苷酸RNA的双链体介导培养的哺乳动物细胞中的RNA干扰。自然 411（6836）：494-498。
Hamilton，A.J.，Baulcombe，D.C。（1999）。植物中转录后基因沉默中的一种小反义RNA。科学 286（5441）：950-952。
Hannon，G.J。和Rossi，J.J。（2004）。使用RNA干扰解锁人类基因组的潜力。自然< em> 431（7006）：371-378。