材料和试剂

A549非小细胞肺癌细胞（ATCC）
D-MEM培养基（Sigma-Aldrich）
10％血清RPMI培养基（Sigma-Aldrich）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A3912）
荧光EGF-555（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：E35350）
100％乙酸
5 M NaCl溶液
多聚甲醛（Fluka）
磷酸盐缓冲液（PBS）
盖玻片安装溶液（Fluoromonut，Southern Biotech）
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（F.Hoffmann-La Roche）
皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：S4521）
酸洗（见配方）
PBS中的4％PAF（参见配方）

设备

圆形玻璃盖玻片
用于哺乳动物细胞培养的6孔和24孔培养皿（Corning，Costar ）
Lipofectamine 2000（Life Technologies，Invitrogen ^TM）
Leica TCS SP2 AOBS共聚焦激光扫描显微镜（Leica Microsystems）
4°C冰箱
细胞培养箱加湿5％CO 2气氛
pH计

软件

ImageJ软件（可从 http://rsb.info.nih.gov/ij/下载））

程序

第1天
在24孔细胞培养皿中放置的玻璃盖玻片（每孔一个）的顶部上种适当数量的细胞（参见注释2）。或者，如果需要在进行胞吞测定之前转染细胞，将5-6盖玻片顶部的种子细胞置于6孔培养皿的每个孔中。您应该为实验中的每个时间点准备至少一个独立的多孔板，另外两个用于对照（例如四个皿用于对照细胞加两个不同的内吞作用的实验）。
第2天（可选）
根据制造商的方案用Lipofectamine2000进行细胞DNA转染。在内吞测定的当天，将盖玻片与细胞转移到24孔细胞培养皿中。当需要调节假定参与受体内化的蛋白质时，可能需要转染
第3-4天
胞吞作用测定（或第2-3天，如果在测定之前不需要细胞转染），通过以下步骤（参见图1的方案方案）。

图1.实验流程示意图
1. 去除细胞培养基和细胞与400-500微升含有0.3％BSA的无血清DMEM培养基孵育至少1小时（可延长到3小时）在37℃在细胞培养孵化器，以剥夺细胞的血清包含刺激。
2. 用适当稀释的荧光配体EGF（2ng/ml）将细胞培养基更换为400μl的DMEM 0.3％BSA（每孔）。
3. 孵育细胞在冰上1小时，在黑暗中（通过用铝箔覆盖菜）
4. 用冰冷的PBS洗涤两个多孔板三次，并将它们留在冰上（对照条件=没有内吞的配体结合，在4℃下允许结合配体受体，而内化被阻断）。
5. 在上述两个皿中的一个上，通过在冰上用乙酸缓冲液孵育细胞6分钟，进行酸洗涤（以除去非内化配体）。用冰冷的PBS冲洗三次，并放在冰上
6. 转移其他细胞培养皿在37°C引起内吞作用不同的时期（最佳时间点需要设置为特定的细胞模型和配体刺激;在我们的经验，例如，12和25分钟为EGF 2 ng/ml到A549细胞）。
7. 在每次孵育结束时，通过在冰上移动培养皿来阻断内吞作用。
8. 用冰冷的PBS洗涤3次，并如步骤5所述在冰上进行酸洗（以分离在质膜上结合受体的所有配体，并仅允许检测内化配体）。
9. 酸洗后，用冷PBS冲洗每个孔3次
10. 通过在室温下用PBS中的4％PFA孵育10分钟将细胞固定在每个盖玻片上，然后用PBS洗涤3次。固定电池可以在这个阶段在冰箱中存储几天
11. 通过在冰上用0.01％皂苷在PBS 1％BSA中的溶液孵育盖玻片上的固定细胞5-10分钟（可选地，可以使用0.1％Triton的PBS 1％BSA）来透化细胞膜。
12. 用PBS冲洗透化细胞三次
13. （可选）如果计划进行免疫荧光分析（IFA），可以通过用PBS 1％BSA孵育30分钟，然后用特异性抗体免疫染色来阻断非特异性结合。
14. 通过在室温下与DAPI温育5分钟（稀释度为1：10,000的1μg/μl的原液）复染细胞核。
15. 最后，在PBS中清洗一次盖玻片，然后用水冲洗，并通过包括固定介质将它们倒置在显微镜载玻片上。
16. 荧光信号的分析应该使用具有63x放大倍率的共聚焦显微镜，例如Leica TCS SP2 AOBS共聚焦激光扫描显微镜（参见图2的代表性图像）。
17. 定量用ImageJ软件获得的内吞荧光信号
  
  图2.在A549上的胞吞作用测定的代表性图片。在左边，在4℃下用荧光EGF处理的对照细胞1小时，进行酸洗以清除结合至质膜的所有EGF; 没有来自等离子膜的荧光信号。在右边，细胞在4℃下用荧光EGF处理1小时，进行酸洗和然后转移到37℃（内化）;荧光信号内化EGF。

笔记

我将这个协议安置在A549细胞上，其他细胞系可能需要优化实验条件（例如在37℃下不同的内吞诱导时间）。 A549应在10％血清RPMI培养基中生长
在其最佳培养基中在盖玻片上生长细胞，以在测定当天达到50-80％融合。记住在单独的多孔菜肴中，盖玻片必须经历不同的孵育时间或控制条件
在步骤2（使用0.3％BSA溶液的细胞温育）的同时，考虑每孔（在24孔培养皿中）400-500μl，在DMEM 0.3％BSA中制备所需最终浓度的荧光染料缀合的配体溶液。记住要保持配体溶液总是在黑暗中（用铝箔覆盖）
放置一个塑料盒（足够大，包含所有多孔菜）与一英寸的水在底部，在37℃在您将用于测定的细胞孵化器中预热。这将有助于加速在4°C和37°C之间的温度变化，以允许在不同条件下的内吞的准确时间。
注意不要将酸性洗涤溶液直接放在细胞上，以避免引起其分离，而是轻轻地将其倾倒在孔的侧面。
不要超过6分钟酸性洗涤孵育。酸性洗涤对于盖玻片总是保持在冰上，将提供实验的阴性对照：实际上，在酸性洗涤后，不应检测来自与细胞相关的配体的任何荧光信号。另一方面，在PBS洗涤的细胞上仍然存在未进行酸洗涤的强信号，表明配体与受体的结合确实发生了。
从每个条件获得至少三个独立实验（在共焦显微镜上应用恒定检测参数）获得至少50个不同的微观视野是有利的。然后应该从图像文件中量化场的平均荧光强度（例如通过ImageJ软件）。

食谱

酸洗
0.2M乙酸
0.5 M NaCl（pH 2.8）
对于100毫升
1.2ml 100％乙酸
10ml 5M NaCl
88.8ml H 2 O v/v
4％PFA的PBS溶液
4g多聚甲醛在100ml PBS中的溶液加热PBS（摇动）30分钟，直到它达到60℃
加入多聚甲醛
通过逐滴加入5M NaOH澄清摇晃时冷却温度
将pH调节至7.4（用5M NaOH/6N HCl）
使用PBS
达到最终体积再次摇动解决方案
等分
保持在-20°C

致谢

该方案最初是为了研究Rizzolio等人（2012）开发的。已经用作参考以建立该程序的分析受体内化的以前报道包括：Lanzetti等人（2000）; Sawamiphak等人。（2010）和Popovic等人。（2012）。作者实验室的相关研究活动由都灵大学圣保罗大学，Grant ORTO11RKTW（RETHE）资助。作者感谢Letizia Lanzetti博士（都灵大学）在设立此协议方面的专家支持。

参考文献

Lanzetti，L.，Rybin，V.，Malabarba，M.G.，Christoforidis，S.，Scita，G.，Zerial，M.and Di Fiore，P.P。（2000）。 Eps8蛋白协调EGF 通过Rac的受体信号传导和通过Rab5的运输。 Nature 408（6810）：374-377。
Popovic，D.，Akutsu，M.，Novak，I.，Harper，J.W.，Behrends，C.and Dikic，I。（2012）。自噬中的Rab GTPase激活蛋白：通过直接结合人ATG8修饰因子来调节内吞和自噬途径。 Mol Cell Biol 32（9）：1733-1744。
Rizzolio，S.，Rabinowicz，N.，Rainero，E.，Lanzetti，L.，Serini，G.，Norman，J.，Neufeld，G.and Tamagnone，L。（2012）。神经毡蛋白1依赖性调节EGF受体信号传导。癌症研究 72（22）：5801-5811。
Sawamiphak，S.，Seidel，S.，Essmann，C.L.，Wilkinson，G.A.，Pitulescu，M.E.，Acker，T.and Acker-Palmer，A。（2010）。 Ephrin-B2调节VEGFR2在发育和肿瘤血管生成中的功能。 465（7297）：487-491。