材料和试剂

组织来源：胚胎日13.5小鼠胚胎的胚胎，从怀孕雌性新鲜收获的
Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：41965-039）
胎牛血清（FCS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10437-028）
胰蛋白酶（Life Technologies，Gibco ，目录号：25200056）
不含Ca 2+和Mg 2+的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：14190-144 ）
含有LMP-p53.1224 shRNA构建体的逆转录病毒上清液（Dickins等人，2005）
含有pWZL-HRas V12 cDNA构建体（Serrano等人，1997）的逆转录病毒上清液
潮霉素B（Life Technologies，目录号：10687-010）
嘌呤霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P9620-10ML）
己二胺溴化物/聚凝胺（Sigma-Aldrich，目录号：H9268）
Polybrene（1,000x原料）（参见配方）

设备

组织培养瓶T75（Greiner Bio-One，目录号：658175）
10-cm组织培养皿（BD Biosciences，Falcon ，目录号：353003）
21号针
5ml注射器
37℃，10％CO 2细胞培养箱中
台式离心机

程序

如前所述制备逆转录病毒上清液，滴度为10 6至10 7 sup/>病毒颗粒/ml病毒上清液（Pear et al。，1993）。
注意：不要冷冻/融化上清液，并在6个月内使用。
通过使胚胎体（不包括头，肝和肠）通过21号针和注射器，然后重复吸入10cm组织培养皿（1个胚胎）中，从胚胎第13.5天（E13.5）胚胎产生初级MEF每皿）在1ml含有10％（v/v）FCS（DMEM/FCS）的DME培养基中。在该阶段不需要获得单一细胞悬浮液，因为在较晚阶段的胰蛋白酶化将产生单细胞悬浮液，并且在该阶段的过度操作促进细胞死亡。加入9ml DMEM/FCS并混合混合。
然后将原代MEF在10％CO 2培养箱中在37℃温育2-3天，不受干扰。
MEF在PBS中洗涤一次，胰蛋白酶化，用DMEM/FCS抑制胰蛋白酶，并在485g下沉淀5分钟。
将MEF分裂〜1：2到T75组织培养烧瓶中并在37℃下在10％CO 2培养箱中温育过夜，使得第二天细胞约60-70％汇合。
第二天早上，吸出上清液并用PBS洗涤一次。使用以下配方组合含有LMP-p53.1224 shRNA，DMEM/FCS和聚凝胺的逆转录病毒上清液：
逆转录病毒上清液          1.5ml（，〜1：7稀释） DMEM/FCS                        8.5 ml
Polybrene（1,000x股票）     10μl（4μg/ml）
总计                                   10 ml
在〜7-8小时的感染后，重复步骤6，并将新鲜的逆转录病毒上清液过夜。
第二天，吸出上清液，用PBS洗涤细胞一次，用新鲜的DMEM/FCS替换，并在37℃孵育过夜。
第二天，用含有5μg/ml嘌呤霉素的新鲜DMEM/FCS（LMP-p53.1224 shRNA构建体具有嘌呤霉素选择标记）替换培养基，如果不汇合，放置2天。否则，根据需要拆分。
在第3天嘌呤霉素选择结束时，用PBS洗涤细胞一次，胰蛋白酶化并接种，使得细胞在第二天在T75烧瓶中约60-70％汇合。在不含嘌呤霉素的DMEM/FCS中培养细胞，并在37℃下孵育过夜。
在第二天，重复步骤6-8，但使用含有pWZL-HRas V12 cDNA的逆转录病毒上清液。如所建议的，这两个转录应该顺序进行，使得p53敲低和永生化先于HRas ^V12过表达。这确保了转化的最佳效率，因为具有低效p53敲低的HRas ^V12过表达导致衰老。
在第二天，用含有300μg/ml潮霉素的新鲜DMEM/FCS（pWZL-HRas V12 cDNA构建体具有潮霉素选择性标记）替换培养基6天。 3天后更换为新鲜潮霉素，必要时分裂细胞。
在第7天潮霉素选择结束时，更换为不含潮霉素的新鲜DMEM/FCS。
根据需要通过细胞另外10-14天以允许HRas V12 驱动细胞增殖。这些变换的细胞现在可以用于 > r 或体内实验。例如，可以将细胞皮下注射到裸鼠的侧腹以评估体内肿瘤生长速率。细胞可以冷冻并储存在液氮中，或者可以连续传代，然而延长的传代将导致基于p53敲低的额外的遗传畸变。

食谱

1,000x聚苯乙烯（4mg/ml）将0.2g溴化己二胺与50ml Milli Q H 2 O混合过滤灭菌（0.22μm）
等分并储存在-20°C

致谢

此协议之前使用和改编自Leong等人（2013）。

参考

Dickins，R.A.，Hemann，M.T.，Zilfou，J.T.，Simpson，D.R.，Ibarra，I.，Hannon，G.J。和Lowe，S.W。（2005）。使用稳定和调节的合成microRNA前体检测肿瘤表型。 Nat Genet 37（11）：1289-1295。
Leong，HS，Chen，K.，Hu，Y.，Lee，S.，Corbin，J.，Pakusch，M.，Murphy，JM，Majewski，IJ，Smyth，GK，Alexander，WS，Hilton，DJ和Blewitt ，ME（2013）。表观遗传调节因子Smchd1 作为肿瘤抑制因子。 73（5）：1591-1599。
Pear，W.S.，Nolan，G.P.，Scott，M.L。和Baltimore，D。（1993）。通过瞬时转染产生高滴度无辅助病毒的逆转录病毒。 Proc Natl Acad Sci USA 90（18）：8392-8396。
Serrano，M.，Lin，A.W.，McCurrach，M.E.，Beach，D.and Lowe，S.W。（1997）。致癌性 ras 会引起与p53和p16的积累有关的过早细胞衰老。 sup> INK4a 。 Cell 88（5）：593-602。