材料和试剂

一般化学品
非特异性DNA
例如。 Poly-dIdC（Sigma-Aldrich，目录号：P4929）
剪切的鲑鱼精子DNA（Amresco，目录号：E213）
BSA（10mg/ml）
用于PAGE的聚丙烯酰胺 - 双（40％）（例如Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0146）
荧光标记和未标记的用于产生DNA探针（例如IDT）的引物
感兴趣的蛋白质
4x绑定缓冲区（参见配方）
20x运行缓冲区（参见配方）
5％聚丙烯酰胺凝胶（见配方）

设备

Mini-PROTEAN电泳装置（Bio-Rad Laboratories）
荧光成像装置（例如 GE生命科学台风PhophorImager）
Mini-PROTEAN铸造系统（Bio-Rad Laboratories）

程序

用于产生荧光标记的DNA探针的程序
1. 获得将用于感兴趣的目标DNA的PCR扩增的合成DNA寡聚引物（我们已经使用来自IDT的引物成功）。引物应设计与相同的策略通常的PCR引物（即长度为18-30nt，一对引物中的两个引物的解链温度在60℃附近且彼此在3℃内，并且如果可能，G + C含量在40％-60％之间）。至少一种引物必须包括5'-荧光标记（例如6-羧基荧光素（6FAM）），但是如果两种引物都被标记，则可视化灵敏度可以加倍。通过标准PCR方案用任何一般聚合酶产生荧光DNA探针。适合于EMSA分析的探针大小可以从非常小（25bp）到非常大（1000bp）;然而，100-500 bp之间的探针能够提供DNA-蛋白复合物的最佳分辨率，而不需要大量长的凝胶运行时间。如果需要更小的探头，凝胶百分比可能需要增加或运行时间和/或电压降低
2. 应使用标准PCR反应清除试剂盒或通过凝胶纯化目的产物，将过量寡核苷酸和游离核苷酸与DNA探针分离。 DNA探针应悬浮于dH 2 O或优选的缓冲液中
3. 探针的浓度应使用分光光度计测定。推荐的工作浓度为200nM（在EMSA反应中的最终浓度，10nM）
4. 将探针储存在-20°C的黑暗中。探针可以成功地存储几个月，但荧光强度可能在第一个月后开始下降
纯化目的蛋白的方法
我们已经不能确定与各种类型的Rgg蛋白相容的通用纯化方案。表达的Rgg蛋白的溶解度在同源物之间变化很大，需要个体优化缓冲液组成和亲和标签利用。成功的纯化方案的实例可以在下面提供的参考文献的方法部分中找到。不管纯化方法如何，应该提及的是，优选以这样的方式产生亲和标记的Rgg's，以允许在用于EMSA测定之前从Rgg去除亲和标签，从而帮助确保标签是不干扰蛋白质的DNA结合活性
EMSA程序
1. 按照以下建议的配方浇铸5％非变性聚丙烯酰胺凝胶。我们已经成功地将Bio-Rad mini-PROTEAN铸造系统用于这些用途
2. 在溶液中稀释Rgg蛋白至所需浓度，以确保其溶解性（例如，储存或结合缓冲液）。最佳浓度范围将取决于Rgg蛋白，然而在结合反应中导致最终浓度为25-200nM的连续稀释应该为这种优化提供良好的起点。
3. 制备含有以下组分的反应混合物（可以制备在所有反应之间共享的许多组分的主混合物）。染料不应该包括在反应中以便避免干扰绑定。还应该注意，需要将包含作为额外泳道的控制反应（即单独的探针和DNA的对照探针不被蛋白质识别）包括在内：
  5μl4x结合缓冲液+ DTT
  Xμl非特异性DNA *
  3微升80％甘油
  2μl10x BSA *
  1μl10mM CaCl 2 *
  YμldH sub 2 O 总体积为18μl
  注意：加星组分的浓度需要根据经验确定，并且可以根据所使用的Rgg蛋白的活性和DNA结合特异性而改变或消除，但上述量是良好的起点（如对于非特异性DNA为0.001U/ml聚dIdC和50μg/ml/ml的鲑精DNA）。
4. 向上述结合反应中，加入1μlRgg蛋白（或作为对照的缓冲液）
5. 对每个反应，加入1μl荧光标记的DNA探针
6. 在室温（25℃）孵育反应30分钟
7. 当反应在1×运行缓冲液（50mM磷酸钾pH7.5）中作为运行缓冲液在100V，10分钟，4℃下温育预运行凝胶（无样品）。
8. 在凝胶上加载5-10μl的每个反应，并在4℃下在100V运行。运行时间应根据DNA探针的大小进行优化（对于150-300 bp之间的探针，60分钟就足够了）。此外，染料可以在空白泳道中运行，以帮助观察通过凝胶的迁移（溴苯酚蓝和二甲苯cyanol在约65nt和260nt，分别在5％凝胶上运行）。
9. 将凝胶转移到荧光成像设备。我们发现，在透明的聚丙烯片保护层之间夹层凝胶是方便的处理注意：可以通过减少反应中dH 2 O的量来修改上述结合反应以包括竞争物DNA和/或信号肽，使得总反应体积保持20μl。竞争DNA通常以相对于标记探针的10-100倍摩尔过量的浓度包括，但需要对每种蛋白质进行优化。如果加入竞争DNA，在探针之前或同时加入DNA。如果包括信号肽，在温育开始后20分钟（将样品加载到凝胶上之前10分钟）加入肽（或空载体作为对照）。

食谱

4x结合缓冲液
80mM HEPES（pH 7.9）
80 mM KCl
20mM MgCl 2/
0.8mM EDTA 2mM二硫苏糖醇（在使用前立即加入）
20x运行缓冲区
1M磷酸钾（pH 7.5）
注意：最简单的方法是制备K sub 2 HPO 4和KH sub 2 PO 4的单独的1M储备液。 sub> 4，然后将它们混合直至达到所需的pH。另外，应当注意，我们通常在我们的EMSA中使用磷酸钾缓冲液，并且已经使用该系统成功地可视化了通过三种不同的Rgg蛋白的DNA结合。然而，如果优选，基于Tris的缓冲液系统也可能产生成功的结果（如果运行缓冲液改变，凝胶缓冲液也需要相应地改变）。
5％聚丙烯酰胺凝胶（足够2凝胶;可根据需要调整凝胶百分比）
3.5ml丙烯酰胺 - 双（40％） 1ml 1M磷酸钾（pH7.5） 16.3ml dH 2 O·dm / 200μl10％过硫酸铵（新鲜）
20μlTEMED催化剂
注意：额外的凝胶可以裹在沙纸或潮湿的纸巾中，并储存在4°C。

参考文献

Chang，J.C.，LaSarre，B.，Jimenez，J.C.，Aggarwal，C.and Federle，M.J。（2011）。两组A链球菌肽信息素通过相反的Rgg调节剂来控制生物膜的发育。 em> PLoS Pathog 7（8）：e1002190。
LaSarre，B.，Aggarwal，C.and Federle，M.J。（2013）。拮抗性Rgg调节剂通过竞争性DNA结合介导群体感应化脓性链球菌。 MBio 3（6）：e00333-12。