材料和试剂

使用肝素（每60ml血液1ml作为抗凝剂）收集人血或外周血单核细胞（PBMC），
肝素（Sigma-Aldrich，目录号：H3393）
Ficoll-Hypaque（GE Life Sciences，目录号：17-1440-02）
人MACS原始CD4 + T细胞II试剂盒（Miltenyi Biotec，目录号：130-094-131）
BSA（Thermo Fisher Scientific，目录号：SH30574）
PBS（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：10010）
RPMI培养基（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：11875093）}
热灭活的胎牛血清（FBS）（Atlanta Biologicals或其他供应商）
Hank's没有钙或镁的平衡盐溶液（HBSS）（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：14170161）}
PHA（Sigma-Aldrich，目录号：61764）
氖转染系统100μl试剂盒（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：MPK10096或MPK10025）
Aqua Amine Live/Dead discriminator（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：L34957）
7AAD（BD Biosciences，目录号：559925）
抗-CD3抗体+抗-CD28-涂覆的Dynal珠（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：11131D）}
离子霉素（Sigma-Aldrich，目录号：I3909）
佛波醇肉豆蔻酸乙酯（PMA）（Sigma-Aldrich，目录号：P8139）
One Glo荧光素酶试剂（Promega Corporation，目录号：E6110，E6120或E6130）
AP-1-荧光素酶报告物（如Vaysberg等人在2008年所述）
注意：该质粒由具有来自插入人IL2最小启动子的金属硫蛋白启动子的5个拷贝的AP-1结合位点的pGL3骨架（Promega公司，目录号：E1751）组成。
pEGFP-N1（Clonetech）或等价的GFP表达质粒
β-肌动蛋白（b-肌动蛋白） - 驱动的荧光素酶报告质粒或其他高度表达的荧光素酶报告物
注意：在本试验中不建议使用表达renilla萤光素酶的质粒，因为我们发现它会干扰萤火虫萤光素酶信号。
CD3-Alexa700（eBiosceince，目录号：56-0037-42）
CD4-PE-Cy7（BD Biosciences，目录号：557852）
CD4-PE（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：MHCD0404）}
CD45RA-PacificBlue（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：MHCD45RA28）}
CD45RO-PerCp-Cy5.5（BD Biosciences，目录号：560607）
CD4RA-APC（Life Technologies，Invitrogen ，目录号：MHCD45RA05）或Alexa647（BD Biosciences，目录号：562763）
CD25-APC（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：MHCD2505）}
CD40L-FITC（BD Biosciences，目录号：555699）
CD62L-PE（BD Biosciences，目录号：555544）
CD69-PE-Cy5（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：MHCD6906）}
MACS缓冲区（参见配方）

设备

96孔圆底无菌组织培养板（BD Biosciences，目录号：353077或等同物）
96孔白壁，平底板（BD Biosciences，目录号：353296或等价物）
MACS LS柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-401）
氖转染系统（Life Technologies，Invitrogen ^TM，型号：MPK5000）
Dynal磁铁（Life Technologies，Invitrogen ^TM，型号：12321D）
具有96孔板能力的发光计（任何制造商）
MACS中磁体（Miltenyi Biotec，型号：130-042-302）
流式细胞仪（BD LSR II或类似物）

程序

注意：在15或50ml锥形管中的所有离心步骤应在通用离心机中以450×g离心10分钟。在eppendorf管中的所有离心步骤应在800×g下在微量离心机中进行5分钟。

将受试者血液标准化至Ficoll-Hypaque密度梯度离心;收获界面层并在HBSS中洗涤两次，并用MACS Hunan原始CD4 +和II柱纯化。收集流通;这是初始CD4 + T细胞部分。不要向MACS缓冲液中加入EDTA;只使用0.5％BSA的无菌PBS。计数单元格。在通用离心机中重悬于RPMI中并在540×g离心10分钟。对于每种待转染的质粒，需要至少1×10 6个细胞。为了允许额外的体积，刺激最少1.2×10 7个细胞。有关细胞数量要求的细目，请参见表1
表1. 质粒和重复数

质粒
复制数量

AP-1荧光素酶报告物
5

b-肌动蛋白荧光素酶报告物
1

pEGFP报告物
1

无质粒（模拟）
3
在RPMI/10％FBS（无PSG）中将PHA稀释至2.5μg/ml。就转染效率和活化标记物的低表达而言，应当针对每种PHA来源优化浓度。在PHA/RPMI中以1×10 6个细胞/100μl重悬细胞。离开1×10 6个未激活用于活化标记物的FACS分析的细胞
激活细胞19.5-20 h在37℃下，在潮湿的5％CO 2含培养箱。设置并发计时器为19.5和20小时。如果你做超过10次转染，错开刺激的开始至少半小时，以允许足够的时间完成转染20小时。样品必须在PHA刺激后19.5和20小时之间转染

在19.5小时前，将DNA质粒加入到Eppendorf管（2.0μg/1×10 6个细胞）中，如表2所示。将1.0ml RPMI/10％FBS（无抗生素）的24孔板（每个转染反应一个孔），并保持在37℃直到准备转染。向转染室中加入3.0ml Neon缓冲液E（包含在Neon试剂盒中）
表2.用于转染的体积

转染	DNA	最终数量	总数
反应		缓冲区T	必要的单元
1	3.0微克	150μl	1.5 x 10 ⁶
2	5.0微克	250微升	2.5 x 10 ⁶
3	7.0μg	350微升	3.5 x 10 ⁶
n	2 n + 1μg	100 n + 50微升	n×10 ⁶ + 5×10 ⁵

在19.5小时，通过在微量离心机中离心800×g离心5分钟开始在PBS中洗涤细胞。在氖缓冲液T中重悬细胞（10 6个细胞/100μl，参见表2）。为每个管准备至少50微升额外的体积。不允许额外的体积将引入气泡进入Neon移液管，这将破坏转染。
确保完成转染20小时。将氖灯设置为2,400 V，2个脉冲，12 ms。对于其他人类T细胞亚群，这些参数应根据氖手册中的描述进行优化
每次电穿孔100μl。检查提示，确保霓虹灯提示中没有气泡，并观察火花。如果样品出现火花，请忽略它，不要重复使用该尖端。使用提示不要超过两次。将每个电穿孔/转染反应（100μl）加入24孔板的1孔中。重复电穿孔直到完成。快速工作以保持一致性。为了评估生存力，您可以在没有质粒的情况下电穿孔一个样品
在37℃/5％CO 2培养箱中孵育细胞24小时

24或48小时的激活后，染色细胞的激活标记。染色一个未刺激的样品和一个PHA刺激的样品。包括aqua胺活/死区分器。为了染色，在eppendorf管（800×g，在微量离心管中5分钟）中沉淀1×10 6个细胞，用PBS洗涤并遵循制造商的水胺染色说明书。在MACS缓冲液中洗涤细胞，并在总体积为100μl的MACS缓冲液中重悬，其中抗体如下所列。在室温下孵育10分钟，用1.0ml MACS缓冲液洗涤，并重悬于1％多聚甲醛的MACS缓冲液中。建议的抗体和荧光团列于表3中。该染色组合可以根据可用的流式细胞仪的能力进行调整。

表3.针对激活标记的建议染色

表位	荧光团	Volume/10 ⁶个单元格
CD3	Alexa700	2.5μl
CD4	PE-Cy7	10微升
CD45RA	太平洋	2.5μl
CD45RO	PerCp-Cy5.5	10微升
CD25	APC	2.5μ
CD69	PE-Cy5	2.5μl
CD40L	FITC	10微升
CD62L	PE	10微升

门在淋巴细胞，aqua胺细胞，单子。为了评估纯度，在CD3阳性+ CD4 +细胞+ CD45RA阳性细胞和CD45RO阳性细胞上进行门控。为了鉴定在PHA刺激的样品中未被激活的细胞的百分比，使用未刺激的样品使用CD25 - ，CD69L，CD40L ^-和CD62L ⁺。参见图1的门控策略。

图1.通过流式细胞术分析样品纯度和活化。顶行：未刺激的样品为纯度染色。底部行：如所示的未激活的（灰色）和PHA刺激的样品（黑色）的重叠染色，并且如所示的在初始CD4 + sup/T细胞上门控。

在转染后24小时，激活细胞用于测量AP-1活性。用1ml RPMI/10％FBS洗涤抗CD3 +抗CD28涂层的Dynal珠。离心管磁珠上的磁珠1分钟，然后吸取培养基，同时留下磁珠上的磁珠。从磁铁中取出，加入1毫升培养基，重复总共3次洗涤。准备25微升每10 6个细胞，加上足够1额外的样品。以4x原始体积（例如100μlRPMI/10％FBS /25μl最初使用的珠子）重悬。
稀释并结合PMA和ionomycin的工作浓度为50 ng/ml PMA和250 nM离子霉素。使总体积为1 ml。
将转染的细胞转移到eppendorf管和沉淀（800×g，在微量离心机中5分钟）。留下一个未刺激细胞的复制品。不要合并重复。吸出上清液和重悬在550μlRPMI/10％FBS。等分100微升/孔，并转移到96孔圆底板。分裂转染在每行重复5个孔。通过在450×g离心10分钟并抽吸沉淀细胞上清液。
注意：为了避免这个步骤，你可以重悬细胞在225微升RPMI/10％FBS和准备上述所有刺激试剂的2x工作库存。在这种情况下，根据下图，每孔等分50微升细胞，并添加50微升含有刺激试剂的培养基。

将每个孔重悬于含有适当刺激剂的100μl培养基中，并转移至冰上的96孔白壁板。参见表4的重复分布的布局和分布图对于未刺激的样品使用RPMI/10％FBS，对于b-肌动蛋白 - 荧光素酶转染的样品。存在额外刺激的空间，例如单独的抗CD3。如果使用可溶性抗体，请使用二级交联抗体
表4.刺激样品板布局

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

AP-1（1）

中等

CD3 + CD28 Dynal珠子

Iono。 + PMA

B

AP-1（2）

中等

CD3 + CD28 Dynal珠子

Iono。 + PMA

C

AP-1（3）

中等

CD3 + CD28 Dynal珠子

Iono。 + PMA

D

AP-1（4）

中等

CD3 + CD28 Dynal珠子

Iono。 + PMA

E

AP-1（5）

中等

CD3 + CD28 Dynal珠子

Iono。 + PMA

F

未转播

中等

中等

中等

中等

中等

G

b-actin-luc

中等

中等

中等

中等

中等

H

一旦添加了所有刺激试剂，从冰中取出板并在37℃，5％CO 2下孵育4小时。
在刺激孵育期间，通过染色一个未转染的样品和pEGFP转染的样品用2.5μl抗CD4-PE和2.5μl抗CD4RA-APC或Alexa-647来评估转染效率。染色后，向每个样品中加入5μl7AAD以评估存活力。这在PE-Cy5通道上检测。不要修复这些样品。预期转染效率范围为活的（7AAD ），CD4 ^{+ CD45RA ^{的5％至40％ +}细胞。在未转染细胞的顶部1％处设置EGFP ⁺门。见图2.

图2.通过流式细胞术评估存活力和转染效率。上部：在活细胞（7AAD ^-）上门控的模拟转染的样品，然后淋巴细胞和CD4 ⁺ CD45RA ⁺细胞。底部：在顶行中描述的群体中通过％EGFP ⁺测量转染效率。 EGFP ⁺ Gate设置在来自模拟转染细胞的信号的顶部1％}
根据制造商的说明准备Promega One-Glo试剂，或解冻覆盖在箔中的等分试样。您将需要每孔100μl。刺激后4小时，从培养箱中取出板，并使用多通道移液器添加100微升One-Glo试剂每孔。盖上箔，孵育3分钟。
注意：没有必要删除Dynal珠，因为这些不影响萤光素酶读数（A.Palin，未发表的数据）。在光度计上读取，每孔读取1秒。 One Glo试剂不需要使用注射器。包括一个空井作为从板的背景的控制。
为了分析数据，减去未刺激样品的吸光度值，将转染复制品配对（即，从A2或A3中减去A1值;从B2或B3中取出B1，等等。）。除以减法计算倍数变化。未转染的对照产生来自细胞的背景荧光，b-肌动蛋白荧光素酶信号是荧光素酶活性的对照。这将显着高于受刺激的细胞。抗CD3抗体+ CD28抗体刺激的细胞提供AP-1响应于TCR接合和共刺激的上调的测量，而离子霉素+ PMA用作测量细胞诱导AP-1的能力。要比较两种样品类型或两组，使用5个刺激复制品的平均值减去未刺激的复制品和非配对的学生t检验。

食谱

MACS缓冲区
1x PBS
0.5％BSA
通过真空过滤灭菌。
注意：不要在此缓冲液中加入EDTA，因为它可能会干扰T细胞受体信号传导。

参考文献

Cron，R.Q.，Schubert，L.A.，Lewis，D.B.and Hughes，C.C。（1997）。将DNA连续瞬时转染到非转化的人和鼠T- 淋巴细胞。 J Immunol Methods 205（2）：145-150
Palin，A.C.，Ramachandran，V.，Acharya，S.and Lewis，D.B。（2013）。人类新生儿幼稚CD4 + T细胞具有增强的由微小RNA miR-181a调节的激活依赖性信号传导。/a> J Immunol 190（6）：2682-2691
Vaysberg，M.，Hatton，O.，Lambert，S.L.，Snow，A.L.，Wong，B.，Krams，S.M.and Martinez，O.M。（2008）。爱泼斯坦 - 巴尔病毒潜伏膜蛋白1的肿瘤衍生变体诱导持续的Erk激活和c-Fos 。 J Biol Chem 283（52）：36573-36585。