材料和试剂

细菌培养
4-甲基伞形基β-D-半乳糖苷（Life Technologies，目录号：M-1489MP）（用于β-半乳糖苷酶测定）
4-甲基伞形基β-D-葡糖苷酸（Life Technologies，目录号：M-1490）（用于β-葡糖醛酸糖苷酶测定）
磷酸盐缓冲盐水片（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：00-3002）
来自鸡蛋白的溶菌酶（Sigma-Aldrich，目录号：L7651）
200x 4-甲基伞形基β-D-半乳糖苷或4-甲基伞形基β-D-葡萄糖醛酸的储备溶液（参见配方）
4-甲基伞形基β-D-半乳糖苷或4-甲基伞形基β-D-葡糖苷酸的最终工作试剂（参见配方）

设备

荧光微板读数器，例如：Gemini XPS荧光微板读数器（Molecular Devices）或Infinite 200 PRO（Tecan Group Ltd.）
96孔微孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：269787）
平底透明96孔微孔板（低自发荧光和/或在365和445 nm的吸光度是优选的）
能够分配10μl和100μl的多通道移液器（12或8通道）
超低温冰箱（-70℃）

程序

记录待测样品的OD 600。推荐待分析的样品的OD 600位于0.1-1OD 600范围内。在生长培养基中稀释样品，得到0.1-1范围内的OD 600。根据观察到的基因表达水平的范围，稀释因子可能需要通过分析多重稀释来优化
收集100μl稀释的样品（0.1-1OD 600范围），并在-70℃下在96孔微量培养板（"主板"）中冷冻。收集所有样品后，将板放回-70°C，并过夜冷冻。
例如：对于大肠杆菌中的时间过程实验，在单个微孔板中每小时收集100μl样品12小时，在收集每个样品后将微孔板返回至-70℃。此微孔板现在充当"主板"，如果需要，可以在稍后的日期从中进行重复测定。只有负介质的对照也可以在免费孔中添加到主平板。
在收集所有样品（确保所有样品已经在-70℃下完全冷冻）之后，在37℃孵育器中将盖板除霜（以避免通过冷凝交叉污染）除霜母板。
当母板已完全解冻时，使用多通道移液器将每孔中的10μl等分试样加入新的微量培养板（"测定板"）中，并将测定板置于-70℃至少15分钟。
在进行测定前将微孔板读数器预温至37℃，并初始化微孔板读数器软件，以便准备去（参见关于微孔板读数器设置的说明，例如设置）。
准备最终工作试剂。
注意：在使用前立即准备，避免长时间暴露于光（即使用当天）。使每个反应100μl足够。
在37°C培养箱中关闭测定板（避免通过冷凝交叉污染）至少10分钟，和/或直到任何可见的冰晶体溶解在所有孔中。
将自己置于微孔板读数器的近距离内。使用多通道移液器分配100微升工作试剂到96孔微板（或只是含有样品的孔）的每个孔。尽量缩短向每个孔分配试剂之间的时间。立即将微量培养板放在读板器中，盖子关闭，然后启动程序。含有大量β-半乳糖苷酶和β-葡糖醛酸糖苷酶的样品可在最初10分钟内使测定法饱和，因此在加入底物后快速捕获读取是重要的。
注意：对于高度表达早期饱和检测器的样品，数据仍然可恢复。然而，由于可能具有较少的具有荧光线性增加的时间点，速率估计可能不太准确。样品稀释可提高这些样品的准确测量。
使用微孔板软件提取读数的荧光增加速率或导出到excel（参见图1）：
1. 绘制相对荧光强度（机器进行内部荧光标准化，因此它是"相对"荧光强度）随时间（每秒通常是方便的）。选择具有最陡的斜率（V max）的图的线性部分，从中推断速率（在excel中，可以使用等式= SLOPE（））。这将提供每秒的相对荧光单位（RFU /秒）。一些平板仪软件将在测定期间自动地和实时地计算V max max。如果曲线图是曲线或非常嘈杂，您可能分别有细胞透化或荧光检测器增益设置的问题（请参见下面的疑难解答）。
2. 可选：从所有样品中减去阴性对照孔（仅含最终工作试剂的培养基）的平均RFU /秒（实际上，该值通常为零或非常小，因此通常不需要此步骤）。
3. 归一化为步骤1中记录的光学细胞密度（OD <600>）。这将给出RFU/sec/OD <600>的单位。
4. 可以对值进行归一化以考虑所使用的样品体积（除以0.01ml，得到值为RFU/sec/ml/OD 600），然而，该归一化有些任意如果总是使用相同的体积（10μl）。或者，已知浓度的纯化β-半乳糖苷酶或β-葡糖醛酸糖苷酶的标准曲线可用于估计酶浓度的实际单位。
  
  图1.原始相对荧光单位随时间的图。如上所述，通过β-半乳糖苷酶测定在30分钟时间内分析生物三份样品。在每组旁边指示三次重复的平均斜率和标准偏差。高度表达的样品在600秒后使检测器饱和。与仅负的培养基（具有最终试剂混合物）对照相比，也从低表达的样品中检测到统计学显着的低水平表达。发布/呈现的最终值被归一化为OD <600>。

有关酶标仪设置的注意事项

通用设置：

温度
37°C

激发波长
360-365 nm

发射波长
445-460 nm

总测定时间
10-30分钟，取决于表达水平

在某些机器上，其他设置可能是可选的，但如果可用，建议每次阅读之间发生抖动。

具体机器设置：
Gemini XPS荧光微孔板读数器

温度：	37°C
自动拍摄：	上
阅读类型：	动力学读数为30分钟，读取间隔为1分钟
激励：	360 nm
排放：	450 nm
截止：	435 nm
阅读：	8次/井
PMT：	高
校准：	在

无限 200 PRO

选择全版读取
Nuclon平底透明

盖模式	关闭
温度	37°C
周期数	30
动力学时间间隔	1分钟
振动持续时间	5秒
振幅	1毫米
振动模式	线性
激励	360 nm
发光	460 nm
读板模式	顶部
增益	手动增益模式
增益	85
滞后时间	0
积分时间	20
每个孔多次读取	没有

故障排除

激发/发射
4-甲基伞形酮具有在365nm的激发峰和在448nm的发射峰。然而，在您的特定机器上观察到的峰值吸收和发射光谱以及可用的设置可能略有不同。此外，来自培养基和/或微板的自发荧光和/或吸光度可能需要选择峰外的波长。最好通过用阳性对照（例如具有已知的β-半乳糖苷酶或β-葡糖醛酸糖苷酶活性的样品）进行发射/激发波长扫描来优化您的设置。根据我们的经验，LB，TY和基本培养基和Nunc MicroWell平底96孔微孔板不产生任何自身荧光的问题。特定生物体可能产生在该测定中发荧光的产物。含有适当的阴性对照菌株（缺少lacZ 或 uidA ）的样品的激发/发射波长扫描可以揭示是否是这种情况。
细胞透化
在我们手中，该测定对细胞透化程度非常敏感。在该方案中，针对革兰氏阴性细菌优化，通过在-70和37℃之间将样品冻融两次并通过在测定缓冲液中添加高浓度的溶菌酶来实现有效的细胞透化。如果细胞在整个测定中未完全透化或变得越来越透化，则RFU/sec曲线将呈现弯曲而不是线性。您可能需要优化方案以允许样品的有效透化
酶标仪读数增益
一些微孔板读数器在整个板或每个单独的孔上自动调节检测器增益。这可以增加读取器的动态范围，因为理想地，非常低和非常高荧光的样品可以在同一板中分析。然而，对于一些酶标仪，增益可能需要手动设置。如果根本没有检测到荧光，则增益可能太低。如果增益太高，样品将在测定开始后立即饱和检测器。为了确定您的测定和机器的最佳增益，从您最高表达的样品和您最低表达的样品中取样，并进行试验测定，调整每次迭代的增益。选择低表达的样品具有可检测的增加的水平，并且最高表达的样品在10分钟之前不使检测器饱和。

食谱

200x 4-甲基伞形酮β-D-半乳糖贮存液或
4-甲基伞形基β-D-葡萄糖醛酸苷以50mg/ml溶于DMSO中的4-甲基伞形基β-D-半乳糖苷或4-甲基伞形基β-D-葡萄糖醛酸苷。
以小等分试样从-70°C的光下存储。避免反复冻融。
4-甲基伞形基β-D-半乳糖苷或4-甲基伞形基β-D-葡糖醛酸的最终工作试剂
在含有2mg ml溶菌酶的PBS缓冲液中稀释200x储液至1×

参考文献

Fiksdal，L.，Pommepuy，M.，Caprais，M.-P.和Midttun，I。（1994）。使用快速酶技术监测沿海水域的粪便污染。 Appl Environ Microbiol 60（5）：1581-1584。
Miller，J.H。（1972）。 Experiments in molecular geneticetics，Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor，New York。 p。 352-355。
Ramsay，J.P.，Major，A.S.，Komarovsky，V.M.，Sullivan，J.T.，Dy，R.L.，Hynes，M.F.，Salmond，G.P.and Ronson，C.W。（2013）。广泛保守的分子开关通过表达新型抗活化剂控制在中生根瘤菌中的群体感应和共生岛转移。 Mol Microbiol 87（1）：1-13。