材料和试剂

吲哚衍生物：
TRP（Sigma-Aldrich，目录号：T0254-500g） IAD（吲哚-3-乙醛）（Sigma-Aldrich，目录号：I1000-100mg） IAA（Sigma-Aldrich，目录号：I5148-2g）
标准显微镜盖玻片
标准显微镜载玻片
0.002％（v/v）吐温水20
0.9％NaCl
FeCl <3>
HClO 4
NaNO ₃
MgSO 4。。 O
KH ₂ PO ₄
正磷酸
葡萄糖
蛋白胨
酵母提取物
酪蛋白酸
微元件
Agar
色氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T0254-500g）
乙酸乙酯
铝箔
对二甲基氨基苯甲醛（Sigma-Aldrich）
Van Urk试剂（参见配方）
Salkowski试剂（见配方）
10 mM正磷酸（见配方）
完整介质（见配方）
20x盐溶液（见配方）
微量元素（参见配方）

设备

锥形烧瓶（100ml）
Neubauer改进了计数室（Marienfeld-Superior，Lauda，Königshofen，德国）
手术刀（无菌）
Whatman纸
Miracloth过滤器15cm×15cm（Merck KGaA，目录号：475855）
Drigalski铲（无菌）
一次性比色杯
前吹式喷雾器
薄层色谱（TLC）室
培养皿（直径12mm）
15 ml无菌Falcon管
2 ml Eppendorf管
玻璃试管
孵化器 Certomat BS-1（B. Braun Biotech International）
Speedvac sc110（Savant，Thermo Fisher Scientific）
Biofuge Primo R（Heraeus）（Rotor，目录号：7590）
Heraeus Pico 17离心机（Heraeus）
分光光度计例如 Ultrospec 3000 proUV/Visible（GE Healthcare）
清洁台Hera Safe（Heraeus）
杂交炉（Hybaid Shake n'Stack，Thermo Fisher Scientific）

程序

收集3至4周龄生长于28℃的印度梨孢囊线虫CM琼脂平板培养物的孢子（参见图1）。

图1.四周龄的 p。楝子琼脂板
1. 在3-4周龄的P上倒约5ml无菌的0.002％Tween水20。在无菌条件下在室温（RT）下培养。
2. 刮板用Drigalski铲和/或解剖刀并混合
3. 通过miracloth过滤器倒入芽孢溶液，收集流过50毫升falcon管
4. 以3500rpm离心7分钟，弃去上清液
5. 用5-10ml 0.002％吐温水20洗涤沉淀。
6. 以3500rpm离心7分钟，弃去上清液
7. 用5-10ml 0.002％吐温水20洗涤沉淀。
8. 以3500rpm离心7分钟，弃去上清液
9. 在10ml 0.002％吐温水中重悬孢子沉淀20，用计数室计数孢子（例如，Neubauer改善）并稀释至所需的孢子浓度（例如 500,000孢子ml < -1 ）。
用400μl500,000孢子/ml孢子溶液在100ml锥形瓶中接种50ml"完全培养基"CM液体培养基（Pham等人，2004）。
让孢子在28℃和130rpm下发芽1周
接种2.5毫米TRP（准备股票1天前，缓慢溶解;在黑暗中工作生长素是光敏感的）。
在黑暗中孵育培养物（或者用铝箔包裹烧瓶）3天
通过miracloth过滤器收集11ml上清液（检查每个过滤器的质量）到15ml falcon管：
1. 用0.9％NaCl洗涤菌丝体，并使整个miracloth过滤器与真菌生物质在烘箱（85℃）中干燥过夜。
15μl的培养上清液等分试样可用于通过LC-MS/MS测定TRP和吲哚衍生物（参见Hilbert等人，2013"）。从falcon管中取1ml进入玻璃用于Salkowski试验的试管
Salkowski试验：将1ml上清液与2ml Salkowski试剂和50μl10mM正磷酸混合，在室温下温育25分钟，测量OD 530。
向剩余的10ml上清液中加入5ml乙酸乙酯，在黑暗中以200rpm孵育3至4小时（上清液可在-20℃下冷冻过夜）。
对于良好的相分离离心机在4℃下以3,500rpm离心5分钟（如果需要，在4℃下在黑暗中离开隼类过夜）。
将2毫升有机相（上相）转移到2毫升的eppendorf管中，在SpeedVac浓缩器中用介质加热蒸发30分钟。
将2ml剩余的有机相加入到沉淀中并重复SpeedVac方法。
将沉淀重悬在60μl乙酸乙酯中（-20℃保存）
计算干生物量。
用Whatman纸填充TLC室。
饱和TLC室用约200ml运行缓冲液氯仿：乙醇：水（84:14:1）洗涤约1小时。
将提取的样品以一定体积装载到TLC板上，每个点代表从等量生物质的样品获得的吲哚衍生物的量（在TLC板上使用不超过6μl）。
使用市售的吲哚衍生物作为标记物对照（例如TRP，IAD和IAA）。
让TLC在黑暗中运行1至1.5小时
干燥TLC板在RT下5分钟约2至5分钟
通过在其上喷洒比例为1:3（Ehmann，1977）的van Urk和Salkowski试剂的混合物并在90℃的培养箱中孵育至多10分钟来开发TLC板。
计算每个点的保留因子（Rf）（化合物移动的距离除以溶剂行进的距离），并将其与对于每个吲哚衍生物对照计算的Rf进行比较。

食谱

Van Urk试剂
1g对二甲基氨基苯甲醛溶解在50ml浓HCl和50ml乙醇中。当储存在棕色/光保护的玻璃瓶中时，该试剂在室温下稳定几个月
Salkowski试剂
制备0.5M FeCl 3（1.35g，在10ml水中）的储备溶液使用1ml该原料与49ml 35％HClO 4
混合
10mM正磷酸 115μl（85％）在100 ml水中
完成介质（CM）1 L
50 ml 20x盐溶液
20克葡萄糖
2 g 蛋白胨
1 g 酵母提取物
1 g 酪蛋白酸
1 ml 微型元素
15克 agar
20x盐溶液1 L
120克 NaNO ₃
10.4 g KCl
10.4 g MgSO 4。。 O
30.4克 KH ₂ PO ₄
微量元素1 L
6 g MnCl <2> ^。 4H <2> O
1.5 g H ₃ BO ₃
2.65克 ZnSO 4 。 7H O
750 mg KI
2.4 mg Na ₂ MO ₄ ^。 2H ₂ O
130毫克 CuSO 4 ^。 5H sub 2 O

致谢

该协议改编自Hilbert等人（2012）。

参考文献

Hilbert，M.，Voll，L.M.，Ding，Y.，Hofmann，J.，Sharma，M。和Zuccaro，A。（2012）。由根内生真菌生成的吲哚衍生物 Piriformospora indica 不是生长所必需的促进但是用于大麦根的生物营养定殖。新植物 196（2）：520-534。
Hilbert，M.，Voll，L.，Hofmann，J。和Zuccaro，A。（2013）。通过LC-MS测定培养上清液中的海藻孢子虫中的TRP和吲哚衍生物的生长测定和检测 MS/MS。生物协议 3（12）：e800。
Ehmann，A。（1977）。 Van urk-Salkowski试剂 - 一种用于硅胶薄层色谱的灵敏和特异性显色试剂检测和鉴定吲哚衍生物。 132（2）：267-276。