材料和试剂

吲哚衍生物：
TRP（Sigma-Aldrich，目录号：T0254-500g） IAD（吲哚-3-乙醛）（Sigma-Aldrich，目录号：I1000-100mg） IAA（Sigma-Aldrich，目录号：I5148-2g）
Neubauer改进了计数室（Marienfeld-Superior）
无菌手术刀
无菌drigalski铲子
Miracloth过滤器15cm×15cm（Merck KGaA，目录号：475855）
标尺
0.3 ml聚丙烯卡环微型管
0.9％NaCl
0.002％（v/v）吐温水20
90％甲醇（HPLC级）
乙腈（HPLC级）
乙酸（HPLC级）
衣原体溶液
微量元素（MnCl <2> 4H 2 O，H 3 BO 3，ZnSO 4，NH 4 sub 2 SO 4，Na 2 O，KI，Na 2，MO 4，SO 4，SO 4，SO 4，SO 4， > 4 ^。 5H ₂ O）
葡萄糖
蛋白胨
酵母提取物
酪蛋白酸
Agar
完全培养基（CM培养基）（参见配方）
缓冲区A（参见配方）
缓冲液B（参见配方）

设备

1.5 ml Eppendorf管
50ml Falcon管
培养皿（直径12mm）
孵化器（例如 B. Braun Biotech International，Certomat BS-1）
Biofuge Primo R（Heraeus，Germany）（Rotor，目录号：7590）
Phenomenex Luna 250×4.6mm C18R-HPLC柱（Phenomenex）
Phenomenex Luna 10×4.6mm C18s RP-HPLC保护柱（Phenomenex）
ICS3000 HPLC系统（Dionex）
QTrap 3200三重四极杆质谱仪（Applied Biosystems SCIEX）
聚丙烯卡环微通道

程序

I. 生长测定

从3至4周龄的梨孢镰孢平板培养物中收集孢子（参见图1）。

图1.四周龄的 p。 Indica 琼脂平板
1. 在3-4周龄的P上倒约5ml无菌的0.002％Tween水20。无菌条件下在室温（RT）下培养
2. 用无菌Drigalski抹刀和/或解剖刀刮擦板并混合
3. 通过miracloth过滤器倒入芽孢溶液，收集流经50ml Falcon管
4. 在3,500rpm离心7分钟，弃去上清液
5. 用5-10ml 0.002％吐温水20洗涤沉淀。
6. 以3500rpm离心7分钟，弃去上清液
7. 用5-10ml 0.002％吐温水20洗涤沉淀。
8. 以3500rpm离心7分钟，弃去上清液
9. 在10ml 0.002％Tween水中重悬孢子沉淀20，用计数室计数孢子（例如改进Neubauer）并稀释至所需孢子浓度（例如 500,000孢子/ml） br />
接种补充有适当的吲哚衍生物（例如2.5mM TRP;250μMIAD或1,10,100μMIAA）的50ml CM培养基（Phamem et al。，2004）用400μl孢子孢子溶液（500,000孢子/ml），并在28℃在黑暗中（或者用铝箔包裹的烧瓶）培养7天。使用模拟接种的烧瓶作为阴性对照
使用miracloth过滤器从菌丝体分离上清液（检查每个过滤器的质量）
用0.9％NaCl洗涤菌丝体，并使整个miracloth过滤器与真菌生物质在烘箱（85℃）中干燥过夜。
测量干燥真菌生物量（=具有干燥真菌生物质的miracloth过滤器的质量 - 空miracloth过滤器的质量）。
在补充有合适的吲哚衍生物（2.5mM TRP，250μMIAD或1μM，10μM）的CM琼脂平板的中间放置来自3至4周龄的梨孢镰孢平板培养物的5mm琼脂塞， 100μMIAA）。使用CM琼脂板作为对照。
在28℃黑暗中培养14天后，用直尺测量菌落直径。

II。通过LC-MS/MS检测培养上清液中的色氨酸和吲哚衍生物

使用15μl等份的em。腋窝培养上清液
加入1ml 90％甲醇
短暂涡旋并将90％甲醇中的1:10稀释液稀释到0.3ml聚丙烯弹性环微孔中。
通过LC-MS/MS分析10μl的1:10稀释液。
在配备有Phenomenex Luna 250×4.6mm C18s-RP-HPLC柱的ICS3000 HPLC系统上分离IAA和ILA，具有以下梯度
1. 0至5分钟保持在80％缓冲液A，20％缓冲液B中
2. 5至26分钟保持在54％缓冲液A，46％缓冲液B
3. 26至27分钟升至10％缓冲液A，90％缓冲液B
4. 32至34分钟升至80％缓冲液A，20％缓冲液B
5. 32至34分钟升至80％缓冲液A，20％缓冲液B
6. 34至45分钟用80％缓冲液A，20％缓冲液B平衡
使HPLC洗脱液在负电离模式下进行偶联的电喷雾电离，并在QTrap 3200质谱仪上进行随后的串联质谱分析，具有以下设置：
1. 停留时间 75毫秒
2. 去簇电位（DP） -22 V（IAA），-30 V（ILA）
3. 入口潜力（EP） -7V（IAA）， - 55V（ILA）
4. 碰撞能量（CE） -15 V（IAA），-18 V（ILA）
5. 碰撞能量（CE） -15 V（IAA），-18 V（ILA）
6. 碰撞池出口潜力（CXP） 0V（IAA），-4V（ILA）
使用m/z跃迁174/130和174/128定量IAA
使用m/z转换204/128和204/158定量ILA。
使用商业可得的正宗物质作为参考

食谱

完全培养基（CM培养基; Pham等人，2004）
1. CM介质（1L）
  50ml 20x盐溶液
  20克葡萄糖
  2 g蛋白胨
  1g酵母提取物
  1克酪蛋白酸
  1 ml微量元素
  15克琼脂
2. 20x盐溶液
  120克NaNO 3
  10.4克KCl
  10.4g MgSO 4·7H 2 O·h/v 30.4g KH 2 PO 4 sub/
3. 微元件
  6g MnCl 2·4H 2 O 2·h/v 1.5g H sub 3 BO sub 3
  2.65g ZnSO 4·7H 2 O·h/v 750 mg KI
  2.4mg Na 2 MO 4+ 2NH 2 O
  130mg CuSO 4·5H 2 O
缓冲区A
0.75％乙酸，pH2.55（如果需要，用乙酸调节）
缓冲区B
乙腈/0.75%乙酸，pH2.55（如果需要，用乙酸调节）

致谢

该协议改编自Hilbert等人（2012）。

参考文献

Hilbert，M.，Voll，L.M.，Ding，Y.，Hofmann，J.，Sharma，M。和Zuccaro，A。（2012）。 Hilbert，M.，Voll，LM，Ding，Y.，Hofmann，J.，Sharma，M.和Zuccaro，A。（2012）。根内生真菌（Piriformospora indica）的吲哚衍生物生产不是生长促进所必需的，而是用于大麦根的生物营养定植。 New Phytol 196（2）：520-534。
Pham，G。 H.，Singh，A.，Malla，R.，Kumari，R.，Prasad，R.，Sachdev，M.，Luis，P.，Kaldorf，M.，Peskan，T.，Herrmann，。 p的交互。 indic与其他微生物和植物。 In：Varma A，Abbott L，Werner D，Hampp R，eds。植物表面微生物 Heidelberg，Germany：Springer，237-265。