材料和试剂

选择细胞：稳定表达血管紧张素II 1型受体（AT1R）的HEK293细胞
选择的配体：Sar - 血管紧张素II（Bachem，目录号：H1740）
聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P4707）
1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）
FLIPR Calcium 5测定试剂盒（Molecular Devices，目录号：R8185）
96孔，FlexStation吸移管尖端，黑色（Molecular Devices，目录号：9000-0911）
Probenecid（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：P36400）
细胞生长培养基（参见配方）

设备

培养箱（5％CO 2，37℃）
FlexStation ^® 3多功能微孔板读数器（Molecular Devices）
测定板：96孔微孔板，组织培养处理，黑色/透明，带盖（Greiner bio one，目录号：655090）
配体板：澄清的96-孔微测试板，组织培养处理的U-底（BD Biosciences，Falcon ，目录号：353077）

软件

SoftMax Pro微孔板数据采集& 分析软件（随FlexStation ^® 3多模式酶标仪一起提供）

程序

I. 准备测定板：

用0.01％聚-L-赖氨酸（50μl/孔）在37℃预孵育测定板30分钟（或在室温下2小时）。
用PBS清除和洗涤多余的聚-L-赖氨酸。
准备均匀悬浮细胞的选择表示受体和种子50,000细胞每孔在50μl培养基。
注意：
a。细胞数需要针对特定细胞系进行优化，以便在测定当天形成90％至100％汇合的细胞单层。
b。如果细胞系用感兴趣的受体瞬时转染，测量质膜上受体的表达水平是有用的。
在37℃，5％CO 2下孵育细胞过夜
吸出培养基，并添加100μl无血清培养基到每个孔。在CO 2培养箱中在37℃下孵育细胞2小时
通过将10ml的组分A与组分B（参见制造商的说明书）混合，制备FLIPR加载染料。
注意：如果你的细胞需要丙磺舒，加入丙磺舒到加载染料中，最终工作浓度为2.5mM。 Probenecid由Invitrogen是水溶性的，并且在测定缓冲液中快速溶解。在实验当天，应该新鲜加入丙磺舒。
从CO 2培养箱中取出测定板。不要吸入无血清培养基。向每个孔中加入等体积（100μl）的FLIPR负载染料，并在37℃，5％CO 2下孵育30分钟，然后在室温下温育30分钟，如果该测定将是在室温下进行。如果分析将在37℃下进行，则可以将平板在37℃，5％CO 2孵育1小时。
注意：孵化时间和温度需要针对特定细胞系进行优化。
孵育后将测定板转移到FlexStation 3多模式微板读数器注意：温度应设置为最佳测定条件。

II。准备配体板：

准备配体（激活剂/抑制剂）在1x PBS中的5倍浓度，在配体板中的最终体积为200μl。
注意：
a。您可以测试一种或几种不同浓度的感兴趣的配体。
b。您需要至少具有每个配体浓度的重复，以对数据进行统计分析。
c。请仔细计划您的实验，以便在细胞准备测定时加载配体板。

III。设置仪器（FlexStation ^® 3多模式酶标仪）：

按照制造商的说明指导放置测定板，配体板和移液管吸头
打开SoftMax ^® Pro Microplate Data Acquisition& 分析软件。
单击设置并选择FLEX模式。推荐的实验设置参数如下：
一个。读取模式：荧光
b。波长：Ex：485; Em：525; 剪切：自动（515）
C。灵敏度：高（如果您期望信号非常强，请选择中等或低灵敏度，特别是细胞系稳定过表达受体）。
d。时间：120秒读取，间隔2秒（或相应选择）
e。测定板类型：96孔Greiner blk/clr btm
6）井读数：整板（或相应选择）
F。复合转移：
- 初始体积：200μl
- 传输：1（或相应地选择多次传输）
- 移液器高度：220μl（调整略大于初始体积）
- 移液器体积：50μl（以使测定板中的配体的最终体积为1x）
- 评分：1
- 时间点：18秒（或相应选择）
G。化合物来源：Costar 96 well Ubtm clr。 3 ml
H。自动校准：在
上一世。自动阅读：关闭
读取

代表数据

图1.在18℃第一次用（良好H1）和不用（孔A1）1μMSar 1 - 血管紧张素II刺激的HEK293-AT1R细胞。强>信号随时间的减少很可能是由受体内在化引起的

食谱

用10％胎牛血清（FBS）提供的细胞生长培养基（对于稳定表达血管紧张素II 1型受体（AT1R）的HEK293细胞）Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）

致谢

这项工作得到国家卫生研究院拨款HL47570和HL115964（Sadashiva Karnik，Ph。D.）和国家研究服务奖HL007914（Hamiyet Unal，Ph。D.）的支持。

参考文献

Unal，H.，Jagannathan，R.，Bhatnagar，A.，Tirupula，K.，Desnoyer，R.and Karnik，S.S。（2013）。对血管紧张素II 1型受体的细胞外环2中的特定构象变化的突变的长程作用。 J Biol Chem 288（1）：540-551