图1.使用Fluidigm Biomark ^TM 动态的单细胞基因表达谱在小鼠干细胞分析中的工作流程。此协议的主要基本步骤是：在96孔板上进行单细胞分选，特异性靶扩增，芯片加载，单细胞基因表达RT-PCR和数据收集。这种Fluidigm动态阵列集成流体电路芯片（IFC）包含微流控通道，腔室和阀门的网络，其自动组装单独的PCR反应。有关此特定芯片的更具体的信息，请访问 http：//www.fluidigm。 com/single-cell-gene-expression.html。

材料和试剂

小鼠ES细胞（E14细胞系）（ATCC ，目录号：SCRC-1040 ^TM）
低EDTA（0.1mM EDTA）TE缓冲液（Teknova，目录号：T0227）
细胞一步法qRT-PCR试剂盒（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：11753-100）}
用于研究的感兴趣的基因的Taqman基因表达测定（Applied Biosystems）
注意：测定是使用TaqMan ^？ MGB（小沟结合剂）探针的基于5'核酸酶化学的探针和引物组。在此处搜索您的Taqman基因表达测定： https：//bioinfo.appliedbiosystems.com/genome-database/gene-expression.html
1. 选择您正在进行的实验类型。单击基因表达
2. 选择所需的测定类型。点击所有基因表达测定
3. 选择您要定位的物件。点击鼠标，因为我们的样品是Mouse ES细胞。
4. 输入目标信息。添加基因符号或entrez基因符号或entrez基因要分析其表达的基因的ID。
96.96用于基因表达的动态阵列芯片（Fluidigm，目录号：BMK-M-96.96）
基因表达96.96动态阵列样品& 装载试剂盒（Fluidigm，目录号：85000802），其包含：
1. 两管的2x测定加载试剂（Fluidigm，目录号：85000736）
2. 两管20x GE样品加载试剂（Fluidigm，目录号：85000746）
3. 20个对照线流体注射器（150μl）

通用PCR主混合物（Applied Biosystems，目录号：4304437）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Life Technologies，目录号：14190-136）
TryPLE快速溶液（Life Technologies，目录号：12605-010）
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Life Technologies，目录号：D1306）
碘化丙啶（PI）（Life Technologies，目录号：P-3566）
2x Assay Loading Reagent（Fluidigm，目录号：85000736）
2x TaqMan？Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems，目录号：4304437）
20x GE样品加载试剂（Fluidigm，目录号：85000746）

设备

96孔半裙板，0.2ml孔，直立的侧面（美国科学，目录号：1402-9200）
光学粘合剂膜（Applied Biosystems，目录号：4311971）
PCR-8管条& Strip Camps，natural（USA Scientific，目录号：1402-2500）
TipOne0.1-10μl延伸长度过滤嘴（美国科学，目录号：1120-3810）
TipOne 101-1,000μl长度延长的过滤嘴（美国科学，目录号：1122-1830）
TipOne1-200μl分级过滤嘴（美国科学，目录号：1120-8810）
荧光激活细胞分选仪（FACS Aria II; BD Biosciences，目录号：643756）
多通道移液器（10-100μlEppendorf Research ，目录号：38-3122000043;0.5-10μl目录号：38-3122000019）
热循环仪（Veriti？sup？96-well Applied Biosystems，目录号：PN 4375786）
集成流体电路IFC控制器
MX模型填充并加载48.48个芯片
HX模型填充和加载96.96芯片。
离心机（Eppendorf，目录号：5810）

程序

逆转录特异性靶扩增（RT-STA）主混合物制备。
1. 解冻CellsDirect ^TM一步法qRT-PCR试剂盒的CellsDirect 2x反应混合物。所有步骤应在冰上进行，试剂应在使用前立即冷冻和/或解冻。
2. 将65μl的2x Reaction Mix转移到PCR-8-Tube Strip的每个管中。
3. 使用多通道移液器从PCR-8管柱中加入5μl2x反应混合物到96孔板的每个孔中。
  由于来自单个细胞的RNA的量是很少的象形图，我们不执行传统的RNA分离方案。相反，将分选的细胞直接引入2x反应混合物中。为了确保最佳的样品保存，此主混合物包含CellDirect 2x反应混合物（CellsDirect一步qRT-PCR试剂盒）和SUPERase-In。该酶保护从裂解细胞提取的RNA免受可能存在于RT-STA主混合物中的任何RNA酶的影响。
细胞分选
1. 用TryPLE Express解决方案分离小鼠ES细胞。轻轻吸出细胞培养基，用5-6ml新鲜的1×DPBS洗涤细胞，以去除可抑制TryPLE Express溶液活性的血清。
2. 吸出1×DPBS。
3. 将1ml预热的TryPLE Express溶液直接加入到细胞培养板中，并将板在37℃，5％CO 2下孵育3-5分钟。
4. 取出细胞培养板，轻轻拍打或摇动，然后加入10毫升新鲜细胞培养基与10％（v/v）FBS停止胰蛋白酶活性。用移液管混合细胞，并将1×10 6个细胞转移到15ml锥形管中。以300×g离心，4℃5分钟。
5. 吸出细胞上清液，并在补充有5％（v/v）FBS的1ml 1x DPBS中重悬1×10 6个细胞。
6. 保持1×10 <6> 细胞在冰上，然后根据您有兴趣研究的细胞群体，用合适的表面标记标记细胞。
7. 每1×10 6个细胞加入10微升的DAPI（> 200纳克/毫升）或10微升的PI（5微克/毫升）到单细胞悬浮液含有1×10
8. 在FACS Aria II中进行细胞分选和用FACS Diva软件进行数据分析。
9. 当在排序参数中对单元格排序单元格时。
10. 将单个细胞直接分入含有5μlCellsDirect 2x反应混合物（组分细胞直接一步法qRT PCR试剂盒，Invitrogen）的96孔板的孔中。我们估计细胞分选到孔中后的反应终体积为6μl 注意：将细胞分类到用于RT-STA PCR的相同平板中。始终将井板保持在冰上。
11. 在300×g离心，4℃5分钟96孔板，让细胞进入CellsDirect 2x反应混合物。
12. 用光学粘合膜密封板。
13. 将板存储在-80°C。这个过夜冷冻步骤允许更好的溶解效率

制备特异性靶标扩增（RT-STA）主混合物。

为96孔板制作excel文件模板，并使用特定的20x Taqman测定探针标记每个细胞。
解冻20x Taqman测定，并根据每个20x Taqman测定探针的excel文件模板中的位置将其存放在96孔板中。
在冰上用CellsDirect 2x反应混合物中分选的细胞解冻板。

准备测定混合在1.5毫升eppendorf管中。池所有Taqman实时测定，将在单细胞实时PCR分析，您以前在步骤b中沉积在96孔板上。在混合物中使用的Taqman测定的最终浓度将为0.2倍。使用TE缓冲液稀释Taqman测定。这是0.2x测定混合物。

组件	每反应加入的体积（μl）	最终浓度
20x Taqman基因表达测定1	1.5	0.2x
20x Taqman基因表达测定2	1.5	0.2x
...	...	...
TE缓冲区	高达150μl
TOTAL	150μl

通过组合以下试剂制备样品RT-STA Master Mix：

组件
体积（μl）

0.2x测定混合物
2.5

SuperScript ^TM RT/Platinum ^® Taq Mix
0.2

TE缓冲区
1.3

TOTAL
4

注意：为了克服移液限制，对所有正在测试的样品创建批量解决方案非常重要。
将4μlRT-STA主混合物加入到每个孔中，其中已经包含浸入到CellsDirect 2x反应混合物中的分选细胞。

用光学粘合剂膜密封板。让板在冰上5分钟，同时你编程热循环仪在运行逆转录和特异性靶扩增之前，验证来自96孔板的每个孔具有根据下表的组分和体积。您的最终体积必须为9μl。

零件	体积（μl）
CellsDirect 2x反应混合物（此试剂已在分选的细胞的平板中）	5.0
0.2x测定混合物	2.5
SuperScript ^TM RT/Platinum ^® Taq Mix	0.2
TE缓冲区	1.3
TOTAL	9

逆转录和特异性靶扩增。

将96孔板与RT-STA主混合物放在热循环仪中。

50℃15分钟（将RNA逆转录成cDNA的步骤）

95℃2分钟（使RT酶失活并激活Taq的步骤）

22个循环的95℃15秒和60℃4分钟（STA特异性靶扩增）

保持在4°C

根据这些参数运行样品PCR：
注意：我们筛选了不同数目的循环，我们发现for 单细胞分析22个循环在芯片中给我们更好的结果分辨率。
用TE缓冲液稀释所得的cDNA产物1:5 可以在1：2和1：5之间稀释。

准备10x测定
在无DNA罩中，使用下表中的体积（对于多次运行适当放大），制备具有5μl等分试样的10×测定的96孔板。将20x TaqMan测定，每孔一个，加入到96孔板中，在与excel文件模板相同的位置。

组件	每次进样量（μl）
20x Taqman 基因表达测定（Applied Biosystems）	2.5
2x分析加样试剂	2.5
总量	5.0
最终浓度（10x）	引物：9μM：探针：2μM

用光学粘合膜密封板。
重要：对于未使用的样品入口，对于未使用的测定入口，加入3.3μl样品混合物和2.7μl无DNA水，加入3.0μl测定上样剂和3.0μl水。

准备样品混合物
合并下表中的组分以制备样品混合物（适用于多次运行）。

组件
每次进样量（μl）

TaqMan Universal PCR Master Mix（2x）
2.5

20x GE样品加载试剂
0.25

cDNA（已稀释1/5）
2.25

总量
5.0
1. 用光学粘合剂膜密封板。

在集成流体电路（IFC）中启动96.96动态阵列^TM。
1. 从BioMark 96 x 96动态阵列袋中取出。避免接触芯片的中心。
  在芯片上或在入口中的控制线流体使得芯片不可用。该芯片需要在打开包装后24小时内使用。
2. 取带有150μl对照线流体的96.96注射器，并通过将注射器引导通过蓄能器并向下推动黑色O形环，将150μl控制线流体注入芯片上的每个蓄能器。每个蓄电池使用一个注射器。避免将移液器尖端从注射器弯曲。
3. 将芯片放入集成流体电路（IFC）控制器HX，然后选择Prime（136x）脚本程序，将控制线流体注入芯片。此程序需要（〜20分钟）。

芯片加载
1. 在启动后60分钟内装入芯片，以减少芯片内的压力损失
2. 在移液进入芯片入口之前，在4℃下彻底涡旋5分钟，来自96孔板的所有测定和样品溶液，并在300℃下 /> 重要的是，当将位于左侧的芯片入口上的10x测定混合物（在步骤5中制备）和10x样品混合物（在步骤6上制备的）装载在芯片入口上时，避免在芯片入口内形成任何气泡是至关重要的芯片入口位于芯片的右侧。为了避免气泡，请按移液器直到第一次停止。如果出现气泡，用新鲜的无菌尖端弹出。注意交叉污染或反应体积损失。
3. 将芯片放回IFC控制器HX，选择加载混合（163x）程序将样品和分析装载到芯片中。选择OK开始加载。此程序需要（〜1小时30分钟）。
4. 当载入混合（136x）程序运行时，从计算机选择"BioMark数据收集Fluidigm"程序。
5. 从程序中选择"双击以预热灯"。灯泡将在20分钟后准备就绪，软件上的灯泡指示灯应为绿色
6. 当加载混合（136x）程序完成后，从IFC控制器HX中卸载加载的芯片。

使用数据收集软件。
1. 双击桌面上的数据收集软件图标以启动软件。
2. 单击开始新运行以打开机器门。
3. 检查状态栏以验证相机温度和指示灯是否已准备好为绿色。
4. 在将芯片放在托盘上之前，取下蓝色塑料膜。将条码朝向机器外部的芯片放置。按照"A"方向。
5. 单击加载。
6. 验证读取器正确识别芯片条形码并识别芯片类型。
7. 单击下一步。
8. 单击运行文件。
  1. 选择新。
  2. 浏览要存储数据的文件位置。
  3. 点击下一步。
1. 扩增，参考，探针：
  1. 选择应用程序类型：基因表达。
  2. 选择被动参考：（ROX）。
  3. 选择测定：单探针。
  4. 选择探头类型：FAM-MGB。
  5. 单击下一步。
1. 单击浏览查找热协议文件：GE 96 x 96标准v1.pcl
  PCR配置文件包括：
  
  95℃10分钟
  
  40个循环95℃15秒和60℃60秒
2. 确认已选择自动曝光。
3. 单击下一步。
4. 验证芯片运行信息。
5. 单击开始运行。此程序需要（〜2小时）。

结果分析单细胞基因表达谱表示为CT值。
1. 当运行完成后，打开程序"Fluidigm实时PCR分析"。
2. 打开chipRun文件。 bml进行分析。
3. 选择"分析视图"。
4. 根据结果，设置以下参数用于分析：质量阈值，基线校正和CT阈值方法。
5. 点击"分析"。
6. 结果显示为CT值。在软件中可以看到CT值作为热图视图，图像视图或表格。导出扩展名为".cvs"的所有文件。
7. 可以使用Fluidigm实时PCR分析或基因表达阵列的任何程序使数据可视化和完全分析。

致谢

我们感谢参与单细胞生成分析以及数据分析的本文的所有作者MacArthur等人（2012）。我们衷心感谢NIH（GM078465）和NYSTEM（C024410）对IRL的资助。这项工作还得到了EPSRC博士培训中心资助（EP/G03690X/1）和EPSRC 2011/12机构赞助奖（EP/J501530/1）的支持。

参考文献

MacArthur，BD，Sevilla，A.，Lenz，M.，Muller，FJ，Schuldt，BM，Schuppert，AA，Ridden，SJ，Stumpf，PS，Fidalgo，M.，Ma'ayan，和Lemischka，IR（2012）。 Nanog依赖性反馈环调节小鼠胚胎干细胞异质性。 Nat细胞生物学 14 11）：1139-1147