材料和试剂

PC（Avanti-Polar Lipids）
PE（Avanti-Polar Lipids）
胆固醇（Avanti-Polar Lipids，目录号： 700000）
1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）（Avanti ，目录号： span> 850725）
1,2-二 - （9Z-十八烯酰基）-sn-甘油基-3-胆碱磷酸（DOPC）（Avanti ， ; number： 770375）
1 mCi（37MBq）（PerkinElmer，目录号：NET139001MC）
标记为Flag的利益蛋白质
Tris-HCl（pH 7.4）
NaCl
将抗Flag M2琼脂糖珠（Sigma-Aldrich，目录号： A2220）
Flag肽（Sigma-Aldrich，目录号： F3290）
氯仿
洗涤缓冲液（见配方）
洗脱缓冲液（见配方）

设备

Avanti迷你挤出机（Avanti，目录号：610023）
Vortexer
离心机
旋转器
Branson tip-sonicator（Cole-parmer Cp750）
闪烁计数器（Wallac MicroBeta TriLux，目录号：1450-023）

程序

脂质体的制备（室温）
1. 在不存在胆固醇的情况下的脂质体通过Avanti Mini-Extruder在室温下制备。干燥的1.25mg PC（75％）和PE（25％）混合物在1ml缓冲液（50mM Tris-Cl，150mM NaCl）中水合。通过如所述的挤出获得100nm单层囊泡：
  （ http://www.avantilipids.com/index.php？ option = com_content& view = article& id = 185& Itemid = 193 ）
2. 含有[3 H]胆固醇的脂质体通过使用标准超声处理程序产生。
  1. 通过涡旋溶解干燥2.5mg PC（75％）和PE（25％）在200μl氯仿中的混合物。
  2. 取8μl上述氯仿溶解的脂质混合物，并加入0.001mg [3 H]胆固醇（〜2％摩尔质量）。
  3. 蒸发氯仿并在氮气流下干燥。较长的干燥时间（4-12小时）可用于除去任何痕量的有机溶剂。
  4. 通过加入0.5ml缓冲液（50mM Tris-Cl，150mM NaCl）使干脂质膜水合。在室温下涡旋20分钟后，用Branson尖端超声仪破碎大的多层囊泡悬浮液直到悬浮液澄清。对于超声处理，将样品置于冰上并用包括9秒超声，9秒间隔和35％输入的循环超声处理10分钟。
  5. 来自超声波发生器尖端的金属颗粒和未破坏的脂质聚集体通过在4℃下以100,000×1000g离心30分钟而去除。将所得的主要由小单层囊泡组成的混浊上清液在4℃下储存。脂质体可以在这种条件下储存一周。
检查[脂质体]胆固醇从脂质体转移到蛋白质（图1）反应在冰上进行。
1. 在[3 H]胆固醇/脂质体至蛋白质转移测定中，每个反应在最终体积为200μl缓冲液（50mM Tris-Cl，150mM NaCl，pH 7.4）中含有4μg的PC：PE：[3 H]胆固醇脂质体，以及从293T细胞纯化的不同量的受体蛋白EGFP-FLAG和EGFP :: NRF-5-FLAG（15和30μg） et al。，2012）。 EGFP-FLAG用作阴性对照
2. 在4℃下孵育30分钟后，每种混合物用600μl50mM Tris-Cl，150mM NaCl稀释，然后加入70μl50％Flag珠。
3. 在振荡器上在4℃下孵育约1小时后，将Flag珠在摇动器上在1,000μl洗涤缓冲液中洗涤4-5次，通过闪烁计数定量结合的[3 H]胆固醇。
  
  图1.两个方向的脂质转移测定示意图
检测胆固醇从蛋白质转移到脂质体（图1）
1. 通过将EGFP-FLAG或EGFP :: NRF-5-FLAG（400pmol）与[3 H]胆固醇（100μL）一起温育获得蛋白质 - [3 H]胆固醇复合物pmol）在终体积300μl缓冲液（50mM Tris-Cl，150mM NaCl，pH7.4）中在4℃温育3小时。通过在4℃下与100μl50％Flag珠孵育2小时，将蛋白质 - [3 H]胆固醇复合物下拉，洗涤6次，并用100μlFlag肽（100μl）洗脱， mg ml ^-1）两次。
2. 在蛋白质 - 脂质体转移测定中，每个反应在最终体积为200μl缓冲液（50mM Tris-Cl，150mM NaCl，pH7.4）中含有[3 H]胆固醇复合物到EGFP或EGFP-NRF-5（40μl）和不同量的受体PC脂质体（50和100ng）。
3. 在4℃下培养30分钟后，每种混合物用600μl缓冲液（50mM Tris-Cl，150mM NaCl，pH7.4）稀释。
4. 通过在4℃下以10,000×g（难以在此阶段检测重量）离心30分钟来分离脂质体。脂质体可以看作是管底部的小白色斑点
5. 在缓冲液（50mM Tris-HCl，150mM NaCl）中洗涤脂质体4-5次，每次使用在每个管中的500μl缓冲液。在每次洗涤后通过离心收集脂质体（10,000×g/g）。转移到脂质体中的[3 H]胆固醇的量通过闪烁计数测定。

食谱

洗涤缓冲液
50mM Tris-Cl，150mM NaCl（pH7.4）
洗脱缓冲液
50mM Tris-Cl，150mM NaCl（pH 7.4），Flag肽

致谢

该协议改编自Zhang等人（2012）和Infante等人（2008）。

参考文献

Infante，R.E.，Wang，M.L.，Radhakrishnan，A.，Kwon，H.J.，Brown，M.S.and Goldstein，J.L。（2008）。 NPC2促进胆固醇在NPC1和脂质双层之间的双向转移，胆固醇从溶酶体中排出的步骤。 Proc Natl Acad Sci U S A 105（40）：15287-15292。
Zhang，Y.，Wang，H.，Kage-Nakadai，E.，Mitani，S.and Wang，X.（2012）。 C 。 eleg ans 分泌的脂质结合蛋白NRF-5介导吞噬细胞上的PS表现，用于细胞吞噬。