材料和试剂

我。细胞收获和超速离心

Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：41965-039）
胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10108-165）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：14200-067）
胰蛋白酶（Biochrom）
青霉素/链霉素（Life Technologies，Gibco ）
0.45μm过滤器（Sarstedt）
蔗糖（Biomol）
超速离心管（17ml）（Herolab）

II。细胞分离和RNA分离

二硫苏糖醇（DTT）溶液（1M）（AppliChem GmbH，目录号：A3668,0050）
RiboLock核糖核酸酶抑制剂（40U /μl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：E00384）
乙醇> 99.8％（Sigma-Aldrich）
QIAshredder旋转柱（QIAGEN，目录号：79654）
RNeasy Kit（QIAGEN，目录号：74106）
QIAmp病毒RNA试剂盒（QIAGEN，目录号：52906）
TURBO DNA无试剂盒（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM1907）
无核酸酶水（B Braun）
Quant-iT RNA测定试剂盒（Life Technologies，Invitrogen ，目录号：Q-33140）

III。 RT-qPCR

QuantiTect Probe RT-PCR试剂盒（包括逆转录酶）（QIAGEN，目录号：204443）
SYBR Green（Life Technologies，Invitrogen ^TM）
引物有义和反义（Biomers）
分离的RNA
TOPO TA克隆试剂盒（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：45-0640）
AmpliScribe-T7/Sp6高产量转录试剂盒（Epicentre，目录号：AS2607）
RNA标准品

IV。其他材料

HIV-1 DIY p24夹心ELISA试剂盒2（Aalto Bio Reagents）

设备

Heraeus Multifuge X3R离心机（Thermo Fisher Scientific）
离心机5417R（Eppendorf）
Sorvall WX Ultra 100超速离心机（Thermo Fisher Scientific）
Qubit荧光计（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：Q32857）
Rotor-Gene Q（QIAGEN，目录号：9001620）
带管0.1ml（QIAGEN）
15ml管（Sarstedt）
1.5ml管（Sarstedt）

程序

注意：对于从小25cm 2细胞培养瓶获得的细胞数目建立程序。最初，接种150万个贴壁细胞。在转染/感染和随后的培养后，细胞在细胞收获日（三天后）达到80-100％汇合。

病毒颗粒的浓度
1. 离心的粘附，转染或感染细胞的上清液在300×g和4℃5分钟，沉淀所有剩余的细胞材料。当使用悬浮细胞时，通过该离心步骤沉淀细胞。对于25cm 2烧瓶，在转染和培养期间使用5ml培养基。通常，可以使用更大体积的培养基，只要不超过包括蔗糖溶液的超速离心管（参见材料中的I-8和步骤1-d）的容量。
2. 向转染或感染的细胞中加入新鲜培养基，将其置于培养箱中，直到细胞质RNA分离
3. 通过0.45μm过滤器过滤无细胞上清液
4. 超速离心机通过30％蔗糖垫预清除上清液。向试管中加入2.5ml蔗糖溶液，小心地用5ml上清液覆盖，不破坏蔗糖沉淀。管必须用无血清DMEM填充，直到管的边缘下0.5-1cm。这对于在超速离心期间稳定管是重要的。最终体积通过精确平衡桶中的管来确定它们在相同的转子中彼此相对地插入。在4℃下以150,000xg离心2小时。
收获细胞
1. 贴壁细胞：弃去刚添加的细胞上清液，用PBS（1x; RT）洗涤细胞一次，并用胰蛋白酶分离细胞。停止胰蛋白酶治疗通过重悬细胞在含血清培养基中。将细胞在300×g和4℃下孵育10分钟，并将其重悬于冷PBS（4℃）中。
2. 悬浮细胞：在300×g和4℃下离心细胞10分钟，弃去新鲜加入的细胞上清液，并将细胞重悬于冷PBS（4℃）中。
3. 沉淀细胞在300×g和4℃下5分钟，弃去上清液。取出所有剩余的PBS，并通过翻转管子几次来松开细胞
4. 离心步骤：准备RLN和RLT缓冲液的工作溶液。准备在1.5毫升管中的RLT缓冲液的600微升等分。将两个缓冲液储存在冰上。
细胞分级
1. 重悬细胞仔细在175微升冰冷的RLN缓冲液，短暂吸取他们上下与一个广泛的1,000微升移液器。大量吸液可能导致细胞全部溶解，应予以防止
2. 在冰上孵育恰好5分钟以裂解质膜
3. 通过在预冷却的离心机中在4℃下以300×g离心2分钟来沉淀颗粒核。
4. 转移代表细胞质部分的上清液到新的1.5毫升管用200微升吸管。确保不要用核沉淀物污染上清液
5. 在预冷却的离心机中在4℃下将细胞质级分在13,000×g离心3分钟，以沉淀所有剩余的核污染物。
6. 将上清转移至已制备的600μlRLT等分试样（步骤2-c），并储存在冰上
7. 可选：提取核部分
  1. 在900μl冷PBS（4℃）中重悬细胞核沉淀，并在预冷的离心机中在300×g和4℃下离心5分钟。
  2. 弃去PBS，加入600μl冰冷的RLT缓冲液，并通过涡旋混合。细胞碎片在RLT缓冲液中不会完全分解。
  3. 将含有碎片的溶液装载到QIAshredder旋转柱上，并以13,000×g离心2分钟。收集流量作为核分数。
细胞质/核RNA分离
1. 在RLT中涡旋核或细胞质级分，并在13,000×g 和RT下旋转5秒。
2. 加入430μl乙醇（> 99.8％），并通过上下吹吸混合
3. 根据制造商的说明，使用RNeasy Mini Kit分离RNA
4. 用47μl无RNase的H 2 O 2洗脱RNA（这将导致45μl的洗脱体积）。
5. 使用TURBO DNase-free试剂盒进行DNase消化，如下所示：向细胞质或核洗脱液中分别加入5μl10x TURBO-DNase缓冲液和1μl或2μlTURBO DNase。轻轻混合并在37℃孵育2-4小时
6. 通过加入5μl灭活剂（包含在TURBO无DNA试剂盒）每1μlDNA酶灭活DNase，孵育5分钟，在室温下，同时保持试剂重悬。
7. 在11,000rpm和RT下离心1分钟，并将上清液转移到新管中
8. 使用RNA特异性染料（例如Quant-iT RNA测定试剂盒）测量RNA浓度，用不含核酸酶的水调节RNA浓度至例如0.05-0.5μg/μl，存储样品在-80°C
颗粒相关RNA的分离
1. 小心地从步骤1-d的超速离心样品中除去上清液，并用干净的擦拭物干燥管壁。
2. 通过上下吹吸在150μlPBS中重悬（不可见）沉淀（任选：在冰上预先摇动管1小时，此步骤允许1h的程序中断，而没有任何测定性能的损失）。
3. 取10μl浓缩的，重悬浮的颗粒，并存储在-20°C p24特异性ELISA（HIV-1 DIY p24夹心ELISA试剂盒协议2）。
  注意：为了分析衣壳化效率，病毒体相关的RNA拷贝数需要相对于上清液中的颗粒量进行标准化。（颗粒相关RNA的减少/增加的水平有时可归因于减少/增加的颗粒水平。）因此，确定上清液中的p24水平是重要的。
4. 加入560微升含有载体RNA（均包括在QIAmp病毒RNA试剂盒中）的AVL缓冲液，涡旋并在室温下孵育10分钟（当在4℃下存储时，晶体出现在含有载体RNA的AVL缓冲液中）通过剧烈分解在50℃下摇动最长2分钟，并在使用前将缓冲液冷却至室温）
5. 向样品中加入560μl乙醇（> 99.8％）并剧烈涡旋15秒
6. 使用QIAmp病毒RNA试剂盒根据制造商的说明书分离RNA
7. 用47μl无RNase的H 2 O洗脱病毒相关的RNA
8. 按步骤4-e〜4-g所述进行DNase消化。对于颗粒RNA样品，1μlDNA酶的量是足够的
9. 将样品储存在-80°C直到进一步使用。在这种情况下不需要测量RNA浓度，因为总RNA量低，并且样品含有非特异性载体RNA（存在于AVL缓冲液中）。

RT-qPCR

使用QuantiTect Probe RT-PCR Kit设置RT-qPCR反应，如下：

PCR混合物（2x，含Taq，dNTPs）	10μl ; ;
反转录酶（RT）酶	0.2μl
引物检测（2.5μM）	1微升
引物反义（2.5μM）	1微升
SYBR Green（0.1x）	1微升

分离的RNA0.5μg细胞质或0.05μg核RNA; 5微升颗粒相关RNA; 5μlRNA标准品，范围从2×10 ¹ -1×10 ⁹ RNA拷贝/μl
加入无核酸酶水至20μl 准备其他样品省略RT酶，以检测（基因组或转染的）DNA序列的扩增用于HIV-1特异性RT-qPCR的引物根据Amplicor HIV-1监测试验（Michael等人，1999）使用。
检测：SK145s（5'-AGT GGG GGG ACA TCA AGC AGC CAT GCA AAT-3'）
反义：SKCC1Bas（5'-TAC TAG TAG TTC CTG CTA TGT CAC TTC C-3'）

使用AmpliScribe-T7/Sp6高产量转录试剂盒（Epicentre）产生与检测到的HIV RNA片段序列相同的RNA标准物，用于绝对定量胞质和颗粒相关的RNA拷贝数。在RT-（q）PCR后用引物对SK145s/SKCC1Bas获得的扩增子用TOPO TA克隆试剂盒亚克隆到pCRII-TOPO质粒中。根据制造商的说明书，将含有T7或SP6启动子的扩增子用作体外转录反应的模板。通过用来自体外转录试剂盒的MBU DNA酶消化除去模板DNA，另外两个治疗与TURBO无DNA试剂盒。测量RNA浓度并调整为每μl2×10 6至1×10 9个RNA拷贝。

使用QuantiTect Probe RT-PCR Kit允许RT反应和PCR扩增在一个管中进行，不间断 RT-qPCR在Rotor-Gene Q系统中进行，具有以下设置：

RT步骤	50°C	20分钟
初始变性	95°C	15分钟
变性	95°C	10秒
退火65°C	65℃	60秒
伸长和荧光	72℃	30秒
检测1
荧光检测2	78℃	15秒

步骤（iii-vi）应该重复总共45个循环。

在最后一个PCR循环后，进行以下熔解曲线测量：
在50℃至99℃范围内以1℃/步进行，在4秒/步之后的第一步平衡90秒。由于在该RT-qPCR中由SYBRGreen监测扩增，熔解曲线分析对于验证特定DNA片段的扩增是重要的。此外，应包括常规琼脂糖凝胶电泳分析以验证预期大小的DNA片段的扩增
用Rotor-Gene Q软件仅使用荧光测量值2分析RNA拷贝数。与测量1相反，来自引物二聚体的荧光信号应当在78℃强烈降低。请注意，第二次荧光测量的确切温度可能因不同的Rotor-Gene设备而异，因此需要优化。
注意：这里描述的引物和设置是为检测HIV-1未剪接的基因组RNA而设计的。为了分析来自其他逆转录病毒的RNA，必须修改RT-qPCR方案。

图1：壳体化测定工作流程示意图。包含粒子将来自感染或转染细胞的上清液超速离心通过30％蔗糖垫。从浓缩颗粒分离的RNA 并通过RT-qPCR分析感染/转染的细胞的细胞质。包封效率确定为HIV-1拷贝之间的比率数量/ml上清液和HIV-1拷贝数/μg细胞质RNA。取决于p24水平的实验设计定量浓缩颗粒样品对归一化很重要颗粒相关的RNA水平与p24/Gag颗粒的量上清液。

食谱

细胞培养基
DMEM
10％（v/v）FCS
1％（v/v）青霉素/链霉素
RLN缓冲区
50mM Tris-Cl（pH8.0） 140mM NaCl 1.5mM MgCl 2·h/v 0.5％（v/v）Nonidet P-40
通过0.2μm过滤器过滤使用前加入1,000U/ml RNA酶抑制剂和1mM DTT
RLT缓冲区（包含在RNeasy Mini Kit中）
使用前加入1％（v/v）β-巯基乙醇
AVL缓冲液（包含在QIAamp病毒RNA试剂盒中）加入1毫升AVL缓冲液到一个管的冻干载体RNA（包括在QIAamp病毒RNA试剂盒），彻底混合，并将溶液转移到AVL缓冲瓶。混合后，准备等分试样，并在4℃下保存

致谢

该协议改编自我们的论文：Brandt等人（2007）; Blissenbach等人（2010）;和Grewe等人（2012）。这项工作是由德国研究基金会（DFG）授予KlausÜberla（Ue45/11-1）资助的。 Bianca Hoffmann和Bastian Grewe得到了DFG研究生院（GRK 1045）的支持。在Bianca Hoffmann和Bastian Grewe，Inga Ohs，Maik Blissenbach，Sabine Brandt，Bettina Tippler，Thomas Grunwald，KlausÜberla，Rebecca Konietzny和Klaus Sure之后，他们都是建立所述方法的团队的一部分。

参考文献

Brandt，S.，Blissenbach，M.，Grewe，B.，Konietzny，R.，Grunwald，T.and Uberla，K。人类和猴免疫缺陷病毒的Rev蛋白增强RNA包被。 3（4）：e54。
Blissenbach，M.，Grewe，B.，Hoffmann，B.，Brandt，S.and Uberla，K。（2010）。重新审视HIV-1 Rev的核RNA出口和包装功能。 J Virol 84（13）：6598-6604。
Grewe，B.，Hoffmann，B.，Ohs，I.，Blissenbach，M.，Brandt，S.，Tippler，B.，Grunwald，T.and Uberla，K。 1型人类免疫缺陷病毒基因组RNA的细胞质利用不依赖于与gag的核相互作用。 a>。 J Virol 86（6）：2990-3002。
Michael，NL，Herman，SA，Kwok，S.，Dreyer，K.，Wang，J.，Christopherson，C.，Spadoro，JP，Young，KK，Polonis，V.，McCutchan，FE，Carr， Mascola，JR，Jagodzinski，LLand Robb，ML（1999）。针对M型人类免疫缺陷病毒1型亚型的校正病毒载量标准的开发和改进的 AMPLICOR HIV-1 MONITOR测试与不同亚型的分离株。 J Clin Microbiol 37（8）：2557-2563