开始这个程序前三天，通常在星期五，分裂细胞1：4，使他们将在星期一汇合。
第1天（星期一） - 分隔您的单元格。
天 2（星期二） - 你的细胞与你发现的任何化合物导致感兴趣的基因的转录激活。修复单元格当你相信p65会在你的基因的调节区利益。计数细胞并等分4百万个细胞每15ml锥形管
第3天（星期三）用p65抗体过夜对样品，预清除样品和IP进行超声处理
第4天（星期四） - 洗涤，洗脱和反向交联。
天 5（星期五） - 苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀。如果你有一天的时间，继续做感兴趣的区域的PCR。

注意：首先确定您的特定细胞类型的超声处理条件，以产生300-1,000bp之间的DNA片段。这通常是大约12％的输出，5个循环，每个10秒，在声处理之间具有30秒的冷却期。如图1的第二泳道所示，DNA的1.2％琼脂糖溴化乙锭凝胶在该区域将显示更明显的污迹。

图1.确定HCT116对ChIP的超声处理条件用星号表示的泳道显示了正确的超声处理条件。

第1天

拆分您的单元格。细胞应处于对数生长期。通常我使用T75烧瓶培养细胞。第二天细胞应该约60-70％汇合。如果你用3ml胰蛋白酶+ 9ml培养基分离一个融合的T75细胞瓶，你将需要4ml细胞（〜5×10 6个细胞）每个T75（你可以做3总，因此未处理，处理和每个T75烧瓶的计数皿）。这些条件适用于HCT116，因此应根据您的细胞系进行相应调整。

第2天

第二天用DMSO或PBS处理细胞，用于对照（取决于您的化合物的溶解度）和目标化合物。为了在索拉非尼处理后检测PUMA启动子上的p65，我进行了8小时时间点。这可能会根据蛋白质的转录速率而改变。我会用你第一次开始看到你的蛋白质表达增加的时间
当你等待你的时间点，计数你的额外烧瓶中的细胞。这将告诉你在你的其他烧瓶中有多少细胞/ml。如果你不能这样做，由于有限的样品量，在你的化合物的时间点后，在修复细胞之前，计数它们。
在烧瓶中加入甲醛至终浓度为1％。让我们坐在室温（RT）与温柔摇动15分钟。
加入1M甘氨酸至终浓度为125mM以终止反应。轻轻混匀。
使用细胞刮刀，刮去细胞并在4℃下以400×g离心5分钟使细胞离心。吸出上清液。
重悬细胞在冷PBS。每15毫升锥形管制备400万细胞的等分试样。标签管正确。再次旋转并吸出上清液。在液氮或干冰/100％乙醇浴中快速冷冻，并储存在-80℃

第3天

从-80℃冰箱中取出2个未处理和2个处理的管。放在冰上解冻。
注意：从现在开始，所有管都在冰面上。
将细胞沉淀重悬于200μl具有蛋白酶抑制剂的冷EBC缓冲液（完全无EDTA的片剂，Roche.I组成10ml EBC缓冲液，1片完全无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物）。一组未处理和处理的将用于p65的p65，而另一组将是负抗体（-Ab）对照。所以你将有4支管，将需要800μl冷EBC缓冲液+蛋白酶抑制剂。
超声处理样品在12％输出，10秒×5个循环，在声处理之间在冰上30秒。
将细胞以9,000×g离心10分钟。
将上清液移至新管中。
按照协议的染色质免疫沉淀测定试剂盒。
1. 使用ChIP稀释缓冲液（包含在试剂盒中）制备蛋白酶抑制剂混合物溶液的主混合物。由于总共有4个样品，您将需要6.4 ml ChIP稀释缓冲液和800μl的10x蛋白酶抑制剂混合液。每个样品加入1,800μl。从未处理和处理的-Ab管作为输入控件取出20微升，保存在4℃供以后使用
2. 用75μl蛋白A/G PLUS-琼脂糖在4℃下旋转1小时来预清洗裂解物。
3. 粒料在14,000×g 约15秒。保存上清液到一个新的管，小心不要打扰沉淀。我通常留下约50微升的上清液后面，以免污染上清液与琼脂糖。保持管与上清液，将球团扔在垃圾桶。
4. 对于-Ab管，在4℃下旋转过夜。对于p65 IP，每管使用2μg的p65抗体。在4℃下旋转过夜。

第4天

添加60微升蛋白A/G PLUS琼脂糖到所有4管（-Ab管。在4℃下旋转1小时，以拉下免疫复合物。
以14000×g /秒，15秒钟短暂离心沉淀。除去上清液并丢弃。
使用以下试剂盒中包含的缓冲液列表清洗沉淀。如果您没有套件，则包括配方。离心后洗涤，完全去除上清液，并在此列表中的下一个缓冲液中重悬。洗涤缓冲液的盐浓度增加以去除与抗体/琼脂糖复合物的非特异性结合。使用500μl的缓冲液，在4℃下旋转5分钟，每次洗涤。
1. 1x低盐免疫复合物洗涤缓冲液
2. 1×高盐免疫复合物洗涤缓冲液
3. 1×LiCl免疫复合物洗涤缓冲液
4. 2x TE缓冲区。
新制备洗脱缓冲液。通过加入250μl洗脱缓冲液洗脱蛋白质，涡旋，并在室温下旋转孵育15分钟。短暂旋转，将洗脱液移至新管中，并用另一250μl洗脱缓冲液重复洗脱。合并洗脱液，每次IP反应的最终体积为500μl（此时，您应该有4个试管，2个用于p65 IP，2个用于-Ab，有控制并分别处理）。
向洗脱液中加入20μl5 M NaCl。另外，向输入对照中加入5μl5M NaCl，并在65℃加热所有样品4小时以逆转交联。在这一步，样品可以储存在-20°C，或如果你有时间，进行DNA提取。

第5天

通过苯酚/氯仿萃取回收DNA。
1. 测量反向交联样品的体积。向每个样品中加入等体积的苯酚，涡旋，并以14,000×g旋转3分钟。将上清转移到新管（避免底部和中间相层）。
2. 加入等体积的氯仿，涡旋，并以14,000×g旋转3分钟。将上清转移到新管（避免底部和中间相层）。
通过乙醇沉淀沉淀DNA。
1. 测量提取样品的体积。向每个管中加入0.1体积3M乙酸钠，2体积100％乙醇和4μl5mg/ml糖原（作为DNA载体）。
2. 涡旋并置于-20℃下30分钟
3. 在4℃以14,000×g离心20分钟。
4. 非常小心地倒出上清液，仔细观察DNA沉淀，使其不会脱落。
5. 用500μl70％乙醇洗涤沉淀。涡旋并在4℃以14,000×g离心5分钟
6. 非常小心地倒出上清液，观察DNA沉淀，使其不会脱落。这将是非常"滑"。我使用未过滤的吸头从芯块中取出剩余的乙醇，如果芯块移动，则将芯块推回到管的底部。
7. 将管翻转倒置并风干7分钟。
8. 重悬在30μl水中。
使用围绕基因启动子中感兴趣的潜在结合位点的引物进行PCR。 DNA的产物大小应为约100-200bp。在2％TBE或TAE凝胶和文件上进行PCR反应。

食谱

EBC缓冲区
50mM Tris（pH7.5） 100 mM NaCl
0.5％NP-40
ChIP稀释缓冲液
0.01％SDS
1.1％Triton X-100 1.2mM EDTA
16.7mM Tris-HCl（pH8.1） 167 mM NaCl
10x蛋白酶抑制剂溶液
将一个完整的迷你无EDTA片溶于1ml水中
低盐免疫复合物洗涤缓冲液
0.1％SDS
1％Triton X-100 2mM EDTA 20mM Tris-HCl（pH8.1） 150mM NaCl
高盐免疫复合物洗涤缓冲液
0.1％SDS
1％Triton X-100 2mM EDTA 20mM Tris-HCl（pH8.1） 500 mM NaCl
LiCl免疫复合物洗涤缓冲液
0.25 M LiCl
1％IGEPAL-CA630
1％脱氧胆酸（钠盐）
1mM EDTA
10mM Tris（pH8.1）
TE缓冲区
10mM Tris-HCl
1mM EDTA（pH8.0）
洗脱缓冲液
1％SDS
0.1 M NaHCO 3 3/v/v

致谢

该协议改编自Dudgeon等人（2012）。这项工作由NIH资助CA106348和CA121105和美国癌症协会授权RSG-07-156-01-CNE（LZ）支持;飞行员医学研究所，NIH资助CA129829和美国癌症协会授予RGS-10-124-01-CCE（JY）; NIH国家研究服务奖博士后奖学金F32CA139882（CD）;和中国奖学金委员会（RP）。 LZ是V基金会癌症研究的学者。

参考文献

Dudgeon，C.，Peng，R.，Wang，P.，Sebastiani，A.，Yu，J.and Zhang，L。 p53的核功能是由DNA损伤诱导的PUMA介导的凋亡所必需的。< em> Proc Natl Acad Sci > USA 104（10）：4054-4059。