材料和试剂

野生型（ 0 sativa L. ssp 。粳稻栽培品种Tainung67）植物的青穗组织
当它们处于二次分支起始时，从年轻穗收集组织
来自E的重组GST-LGD1蛋白。大肠杆菌（BL21）
pGEX-4T-1GST表达载体（GE Healthcare，目录号：28-9545-49）
总RNA分离试剂盒 - Trizol（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：15596-026）
mRNA纯化试剂盒 - Oligotex mRNA Mini Kit（QIAGEN，目录号：72022）
RNA 5'-末端标记试剂盒（T4多核苷酸激酶）（Thermo Fisher Scientific，目录号：EK0031）
FastAP热敏碱性磷酸酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：EF0651）
[γ-³² P] -ATP - 用于同位素标记
PVDF Immobilon-P膜（EMD Millipore，目录号：IPVH15150）
G-50凝胶过滤染料终止子去除柱（Geneaid，Taiwan，目录号：CG050）
原代抗GST抗体（Bioman，Taiwan，目录号：GST001M）; HRP缀合的二抗（Thermo Fisher Scientific，目录号：SA1-9510）
SuperSignal West Pico化学发光检测系统（Thermo Fisher Scientific，目录号：34087）
阻止缓冲区（参见配方）

设备

凝胶电泳（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-8005EDU）
SNAP i.d. ^® 2.0蛋白检测系统
荧光成像设备（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-9460）

程序

RNA分离和总和mRNA的末端标记
1. 使用Trizol试剂盒从野生型植物的幼穗中分离总RNA。
2. 〜0.5g组织用于分离〜500μg总RNA，使用200μg总RNA用Oligotex mRNA Mini Kit纯化〜2μgmRNA。使用Nanodrop进行最终RNA定量（对于总RNA约2μg/μl;对于mRNA约20ng /μl）。
3. 首先用FastAP热敏碱性磷酸酶（10U）在37℃下处理5μg总RNA和1μgmRNA 1小时以根据制造商的方案除去5'-磷酸基团。
4. 使用1μl（10U）T4多核苷酸激酶在37℃下用[γ-32 P] -ATP对总体和mRNA进行末端标记30分钟。
5. 通过在Sephadex G-50柱上凝胶过滤从未结合的标记物中分离标记的RNA
西北印迹测定
1. 从E中提取GST-LGD1融合蛋白。大肠杆菌含有pGEX-4T-1 GST表达载体
2. 在变性条件下在12％SDS PAGE上分离蛋白质，并转移至PVDF Immobilon-P膜，并使用SNAP i.d. 蛋白检测系统如下。
3. 对于Western印迹，使用一级抗GST抗体（1:2,000）和二级HRP（辣根过氧化物酶） - 缀合的抗体（1:3,000）用于增强的化学发光（ECL）检测。
4. SuperSignal West Pico化学发光法用于根据制造商的说明书检测西方信号
5. 对于西北部，在变性条件下在12％SDS PAGE上分离的重组蛋白转移到PVDF Immobilon-P膜。
6. 然后将蛋白质在含有0.1M Tris HCl（pH7.5）和0.1％（v/v）NP-40的复性缓冲液中在4℃下在印迹上复性过夜。
7. 印迹在复性缓冲液中洗涤4次，每次15分钟，并在室温下在封闭缓冲液中孵育5分钟。
8. 在标记的总和mRNA存在下，印迹在4℃下在封闭缓冲液（无BSA）中杂交过夜。
9. 最后，将印迹在封闭缓冲液（无BSA和Triton）中洗涤4次，每次5分钟，并放射自显影以获得如图1所示的信号。

代表数据

图1. LGD1重组蛋白的西北印迹分析从 E中纯化重组GST-LGD1。并通过SDS-PAGE，western和westernwestern印迹分析。（a）考马斯亮蓝（CBB）染色显示两个主要条带（箭头）。下带的大小为〜56kD（单体），上带为〜112kD（同二聚体）。（b）抗GST抗体识别GST-LGD1融合蛋白（箭头）以及GST（空心圆圈）。西北印迹显示总RNA。（c）和从年轻穗轴组织分离的mRNA（d）结合上带（箭头），但不结合下带（空心箭头）。星号表示RNA与LGD1的降解形式的结合。

食谱

阻塞缓冲区
10mM Tris HCl（pH7.5） 5mM Mg醋酸盐 2 mM DTT
5％（w/v）BSA 0.01％（v/v）Triton X-100

致谢

我们非常感谢岳兴兴博士，陈建文，明仁芬和苏玉宇创建TRIM数据库。我们还感谢Shimamoto博士（日本奈良科学技术研究所），共享pANDA-RNAi载体和Su-May Yu（中国科学院分子生物学研究所），为水稻转基因实验提供了极好的支持。我们还感谢中国科学院转基因植物实验室的协助粒子轰击。我们感谢Krisa Fredrickson女士的英语编辑。这项工作得到中央研究院（台湾），国家农业生物技术国家科技计划（NSTP/AB，098S0030055-AA，台湾），国家科学委员会（98-2313-B-001-001- MY3，台湾）和李基金会（美国）到光玉，Jauh。

参考文献

Uyttewaal，M.，Mireau，H.，Rurek，M.，Hammani，K.，Arnal，N.，Quadrado，M.and Giege，P.（2008）。 PPR336与植物线粒体中的多核糖体相关。 J Mol Biol 375（3）：626-636
Terribilini，M.，Sander，J.D.，Lee，J.H.，Zaback，P.，Jernigan，R.L.，Honavar，V.and Dobbs，D。（2007）。 RNABindR：用于分析和预测蛋白质中RNA结合位点的服务器 Nucleic Acids Res 35（Web Server问题）：W578-584
Thangasamy，S.，Chen，P.W.，Lai，M.H.，Chen，J.and Jauh，G.Y.（2012）。含有RNA结合活性的水稻LGD1通过替代启动子影响生长和发育。 Plant J 71（2）：288-302。
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