材料与试剂

生物材料

S. reilianum菌株储存在 -80 °C 的 30% 甘油中。使用S. reilianum野生型菌株 SRZ1 和 SRZ2 [7]进行转化。

试剂

单向导RNA (sgRNA) 合成
1. T4 DNA聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0203S），储存：-20°C
2. NEBuffer ^TM r2.1（50 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，10 mM MgCl ₂，100 μg/mL BSA，pH 7.9），储存：-20 °C（New England Biolabs，目录号：B7202S）
3. dNTP（DNA）（Carl Roth，目录号：K039.1），储存：-20 °C
4. NucleoSpin®^凝胶和 PCR 净化（Machery 和 Nagel，目录号：740.609.250），储存：RT
5. HiScribe ^® T7 高产量 RNA 合成试剂盒（New England Biolabs，目录号：E2040S），储存：-20 °C
6. DNase I（Thermo Fisher，目录号：EN0521），储存：-20 °C
7. DNase I 缓冲液（Thermo Fisher，目录号：EN0521），储存：-20 °C
8. RNA Clean & Concentrator 25 套件（Zymo Research，目录号：R1017 和 R1018），存储：RT
9. 紫色上样染料（New England Biolabs，目录号：B7024S）；成分：2.5% Ficoll ^® -400、10 mM EDTA、0.08% SDS、0.02% 染料 1、0.02% 染料 2、pH 8；存储：RT
10. 无核酸酶水，储存：RT

RNP 的形成和体外裂解测定
1. EnGen® ^Spy Cas9 NLS + NEB 缓冲液 r3.1（New England Biolabs，目录号：M0667）
2. 500 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）（Carl Roth，目录号：8043.2）
3. 蛋白酶 K（Thermo Fisher，目录号：EO0491）
4. 100 bp 梯子（New England Biolabs，目录号：N3231S）
5. 通用琼脂糖（Bio-Budget，目录号：10-35-1020）
6. 1% 溴化乙锭溶液（Carl Roth，目录号：2218.2）
7. 马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 板 (39 g/L)（BD，Difco ^TM，目录号：213400）
8. Tris碱（Sigma，目录号：102262896）
9. 乙酸（VWR，目录号：20103.330）
10. EDTA 0.5 M pH 8.0（Carl Roth，目录号：8043.2）

S. reilianum的原生质体和转化
1. Novozym 234 [诺和诺德；丹麦，不再可用；替代方案：来自哈茨木霉的裂解酶（Sigma，目录号：SLBJ0553V）]
2. 柠檬酸钠（Carl Roth，目录号。3580.1）
3. 山梨醇（Sigma，目录号：102466217）
4. 柠檬酸（Carl Roth，目录号：X863.2）
5. 山梨醇（Sigma，目录号：102466217）
6. Tris-HCl（Carl Roth，目录号：9090.3）
7. CaCl ₂（Sigma，目录号：1002825086）
8. 聚（乙二醇）PEG MW3350（Sigma，P4338，目录号：102604683）
9. Bacto ^{TM -}酵母提取物（Thermo Fisher，Gibco，目录号：212720）
10. Bacto ^TM蛋白胨（BD，Difco，目录号：211820）
11. 蔗糖（Carl Roth，目录号：4621.2）
12. 山梨醇（Sigma，目录号：102466217）
13. Bacto ^TM -琼脂（BD，目录号：214030）
14. 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）板（BD，Difco ^TM，目录号：213400）
15. 羧甲碱（5 mg/mL）（Sigma，目录号：102085144）
16. 来自猪肠粘膜的肝素钠盐（15 mg/mL）（Sigma，目录号：1001937695）

解决方案

50× TAE 缓冲液（参见配方）
1× TAE 缓冲液（参见配方）
SCS 缓冲液（参见配方）
STC 缓冲液（参见配方）
STC/40% PEG（参见食谱）
再生琼脂灯（参见食谱）

食谱

50× TAE 缓冲液

试剂	最终浓度	数量或体积
Tris碱基	2M（体积/体积）	242.0克
醋酸	2M（体积/体积）	57.1毫升
EDTA 0.5 M pH 8.0	10%（体积/体积）	100.0毫升

1× TAE 缓冲液

试剂最终浓度数量或体积

50× TAE 缓冲液 2%（体积比） 20.0毫升

去离子水 98%（体积/体积） 980.0 毫升

SCS缓冲液

试剂	最终浓度	数量或体积
解决方案一：
柠檬酸钠，pH 5	0.6%（重量/体积）	5.9毫升
山梨醇	18.2%（重量比）	182.0克
解决方案2：
柠檬酸	0.4%（重量/体积）	4.2克
山梨醇	18.2%（重量比）	182.0克

将溶液 1 和 2 混合直至 pH 达到 5.8（比例约为 5:1）并高压灭菌。

STC缓冲器

试剂	最终浓度	数量或体积
山梨醇	50%（体积/体积）	500.0毫升
Tris-HCl，1 M pH 7.5	1%（体积比）	5.0毫升
CaCl ₂，1 M，无菌过滤（100 mL 总体积就足够了）	10%（体积/体积）	50.0毫升

STC/40% PEG

试剂	最终浓度	数量或体积
STC缓冲器	60%（体积/体积）	600.0毫升
聚乙二醇 PEG，MW3350；无菌过滤，（50 mL 总体积就足够了）	40%（重量/体积）	400.0克

再生琼脂灯

试剂	最终浓度	数量或体积
Bacto ^TM酵母抽提物	1%（重量/体积）	10.0克
Bacto ^TM蛋白胨	0.4%（重量/体积）	20.0克
蔗糖	0.4%（重量/体积）	20.0克
山梨醇	18.2%（重量比）	182.2克
Bacto ^TM琼脂	1.5%（重量/体积）	15.0克

实验室用品

PCR机（Bio-Rad，型号：T100 ^TM Thermal Cycler）
PCR 管用微量离心机（VWR，型号：Ministar）
台式离心机（VWR，型号：Microstar 17）
37℃培养箱（Memmert，型号：UN110）
28℃培养箱/室
可选：聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 设备（Bio-Rad，型号：PowerPac ^TM Basic、Mini-Protean® ^Tetra系统）
琼脂糖凝胶电泳设备
Nanodrop（Thermo Scientific，型号：Nanodrop 2000c）
ChemiDoc ^TM MP 成像系统（或等效成像系统），带 GFP 滤光片（Bio-Rad，型号：Universal Hood III）
Geldoc：使用凝胶记录装置通过紫外线辐射可视化 DNA（Peqlab/VWR，型号：EBOX VX5）

设备

PCR 管和 1.5 ml Eppendorf 管
无菌切割吸头（1,000 µL 和 20 µL）

程序

sgRNA 的体外转录

使用S. reilianum作为目标生物体在 CHOPCHOP sgRNA 设计器 ( https://chopchop.cbu.uib.no/ )中设计原型间隔子。选择以G开头的原型间隔序列，这是启动 T7 RNA 聚合酶转录所需的。如果没有所需的以 G 开头的原型间隔区，请在所选原型间隔区序列 (21 nt) 的上游添加一个额外的 G。

分别在所选原型间隔序列的上游和下游添加 T7 RNA 聚合酶启动子序列和重叠支架序列，并订购基因特异性寡核苷酸（表 1）。此外，还需要反向互补恒定寡核苷酸，它包含支架和终止子序列以及与基因特异性寡核苷酸的支架序列有 20 nt 重叠（表 1）。

表 1. 用于 sgRNA 合成的寡核苷酸序列

寡核苷酸	顺序
基因特异性	CAAAATTCCATTCTACAAC - G NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
持续的	AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAA CTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC

注：恒定寡核苷酸的下划线序列描述了与基因特异性寡核苷酸的重叠部分。

按 1:1 的比例混合两种寡核苷酸，如下所示：

1 µL 原型间隔寡核苷酸 100 µM 库存

1 µL 恒定寡核苷酸 100 µM 库存

8 µL H ₂ O

总计 10 µL
在 PCR 机中使用以下程序对寡核苷酸进行退火：

95°C 5 分钟

-2 °C/s 时为 95 °C 至 85 °C

85 °C 至 25 °C，-0.1 °C/s

4°C 暂停
添加 T4 DNA 聚合酶以填充突出端：

2.5 µL dNTP (10 mM)

2 µL NEBuffer ^TM r2.1(10×)

5 µL H ₂ O

0.5 µL T4 DNA 聚合酶

总计 10 µL
在 PCR 仪中 12°C 孵育 20 分钟。
用 PCR 纯化试剂盒纯化产物，用 Nanodrop 测量浓度，并在 2%–3% TAE 琼脂糖凝胶上验证 PCR 产物。
使用上述所得的 2 µg DNA 作为模板，并使用 HiScribe T7 高产 RNA 合成试剂盒进行以下反应（NEB，小 RNA 实验方案）：

6 µL NTP（每个库存 25 mM）

2 µL 10× T7 缓冲液

1.5 µL T7 RNA 聚合酶混合物

X µL 模板（2 µg DNA 模板，第 6 步）

Y µL 无核酸酶 H ₂ O（添加至 20 µL）

总计 20 µL
翻转管子，短暂涡旋，并在 37°C 下孵育过夜。
第二天，添加 14 µL 无核酸酶 H ₂ O、4 µL DNase I 缓冲液（10×）和 2 µL DNase I，并在 37°C 下孵育 15 分钟。

注意：小RNA易降解；在无 RNase 的空间中工作，并使用手套和实验服执行以下所有步骤！
使用 RNA Clean & Concentrator 25 套件纯化所得 sgRNA，并使用制造商的方案（手册，第 5 页）。

可选：使用 TBE 缓冲液（89 mM Tris 碱、89 mM 硼酸和 2 mM EDTA 钠）和 8 M 尿素和 TBE 作为运行缓冲液检查 10% 变性 PAA 凝胶上 RNA 的质量 [14]。
通过 Nanodrop 测量浓度并进行体外裂解测定（B 部分）。

暂停点：可以将sgRNA冷冻至-80℃，第二天继续； sgRNA 也可以在-80 °C 下长期保存。请参阅故障排除 1。

体外裂解试验
1. 为了测试设计的 sgRNA 的体外效率，将 1.5 µL Cas9 (NEB) 和 ~1.5 µg sgRNA（1:1 摩尔比）混合，并在 RT 下孵育 10 分钟（图 1B）。
  
  图 1. 核糖核蛋白复合物 (RNP) 介导的S. reilianum转化工作流程的图形概述。 (A) 使用 T7 HiScribe 试剂盒体外合成 sgRNA。 (B) 体外转录的 sgRNA 与Sp Cas9 形成的 RNP。 (C) 或者：要进行体外裂解测定，请在室温 (RT) 下孵育 10 分钟，然后添加供体模板（扩增感兴趣区域的基因）并在 37°C 下孵育 3 小时。 (D) 1、2 和 3 小时（或过夜）后对 10 µL 反应混合物进行取样。 (E) 使用 100 bp 梯子在 1.5% 琼脂糖凝胶上进行体外切割的可视化。 (F) RNP 在 37°C 下孵育 1 小时，然后转化为S. reilianum原生质体。该图是通过 biorender.com 创建的。
2. 然后，添加 333 ng DNA 切割模板（感兴趣区域的 PCR 产物）（图 1C）。
3. 1、2 和 3 小时后，取出 10 µL 样品（图 1D），并通过添加 1 µL 500 mM EDTA（pH 8）来停止反应。
4. 随后，将 1 µL 蛋白酶 K 添加到反应中，并在 50°C 下孵育反应混合物 30 分钟，以降解 Cas9。
5. 添加 1× 紫色上样染料终止反应。
6. 收集所有样品后，使用 Gel-Doc 可视化检查 1.5% 琼脂糖凝胶上 100 bp 梯子（用溴化乙锭溶液染色）的裂解情况（图 1E，参见故障排除 2）。

用于转化为S. reilianum的 RNP 组装
1. 使用 2 µg 体外转录的 sgRNA 靶向感兴趣的基因，并将其与 6 µg Sp Cas9 混合。
2. 随后，添加 1× NEBuffer ^TM 3.1 和最小体积的水（图 1B）。
3. 混合和离心后，在转化前在 37°C 下孵育反应 1 小时（图 1B）。

S. reilianum的转化
1. 如前所述，使用 Novozym 234制备S. reilianum原生质体 [8]。
2. 对于 RNP 转化（图 1E），将原生质体在冰上解冻 5 分钟。
3. 添加带有抗生素抗性盒的自我复制质粒[例如，pNEBUC-Carboxine (Cbx)；布拉赫曼等人。 [8]，在S. reilianum中复制]、RNP（在 C 部分中形成）、1 µL 15 mg/mL 肝素，以及可选的 1.5 µg 供体模板到原生质体（图 2）。
  
  注意：当 Cbx 抗性选择停止时，自我复制质粒会丢失。到目前为止，我们无法报告整合到 S. reilianum 基因组中。
4. 在冰上孵育原生质体 10 分钟。
5. 添加 500 µL STC/40% PEG，并用尖端切割的蓝色尖端小心地重新悬浮原生质体，直到液体看起来均匀而无团块（上下移液 5-8 次）。
6. 将原生质体在冰上再孵育 15 分钟。
7. 将原生质体铺在再生琼脂光板上，分为两层 [底层：相应的选择性抗生素（对于 pNEBUC — 羧辛：2.5 µg/mL），顶层：无抗生素耐药性]。
8. 第二天，将转化板翻转过来。
9. 四天后，使用蓝色吸头从再生琼脂中挑出转化体到 PDA + Carboxin (2.5 µg/mL)，持续 2-3 天。
10. 然后，将单个菌落转移到 PDA 平板上两天以失去抵抗力。
11. 随后，分离 DNA [16] 并用于进一步确认（参见 E 部分）。

RNP 辅助同源重组在S. reilianum中产生敲除

为了在S. reilianum中产生无抗生素抗性的敲除突变体，利用了 CRISPR/Cas9 介导的同源定向修复。为此，通过 Gibson 组装将目标基因的 1 kb 同源侧翼区域克隆到 MOCLO 载体 TK#1_pAGM1311 中，生成供体模板（图 2）。
1. 对于S. reilianum原生质体的转化（参见 D 节），将供体模板与自我复制质粒 (pNEBUC)、RNP（针对目标区域的 sgRNA）和 1 µL 肝素一起添加。
  
  注：转化效率高>100个菌落；如果你的效率较低，请重复原生质体和转化。
2. 如上所述转移获得的转化体（参见C部分）。
3. 分离转化体和野生型的 DNA。
4. 使用左侧的正向引物和右侧的反向引物进行 PCR（图 2C），并将带大小与野生型进行比较（图 2D）。
5. 选择来自 PCR 的推定阳性突变体，通过 Southern blot [17,18] 使用缺失构建体（左翼 + 右翼）（先前用作供体模板）作为杂交探针进行进一步验证。
  
  图 2.使用核糖核蛋白复合物 (RNP) 在有和没有供体模板的情况下转化S. reilianum 。 (A) 使用 RNP 介导的转化产生移码突变体。生成的移码突变体通过测序或如图 3 中所述通过荧光损失进行筛选。 (B) 使用 RNP 辅助的同源重组与供体模板生成敲除突变体。 (C) 用于生成淘汰赛的供体模板设计。通过 PCR 扩增编码序列的 1 kb 侧翼区域，并带有突出端，以便 Gibson 组装到主链 TK#1_pAGM1311（MOCLO 主链，级别 -1）中。 (D) 使用左翼 (LF) 正向引物和右翼 (RF) 反向引物进行缺失突变体验证 PCR 的示例 [预期大小：WT，1021 bp；突变体 (+)，676 bp；效率：62.5%（10/16）]。不同基因组位点之间的效率可能有所不同。图 2A 和 B 是使用 biorender.com 创建的。

协议验证

例如，可以使用 GFP 荧光作为读数来测试 RNP CRISPR/Cas9 的效率（图 3）。为了测试S. reilianum的效率，在 SRZ2 菌株的ip基因座中生成了含有由 pOTEF（组成型启动子）控制的 GFP 单整合的菌株，并通过 Southern blot 进行了确认（图 S1）。为了转化S. reilianum原生质体，使用了针对 GFP 的 sgRNA 以及 RNP 中的 Cas9（参见 C 部分）和用于在再生琼脂上进行选择的自动复制质粒 (pNEBUC)。在 PDA + Cbx (2.5 mg/mL) 上于 28 °C 孵育四天后，将转化子挑出，两天后，将其转移至 PDA 板并使用 Chemi-Doc 检查其荧光。

图 3. GFP 作为核糖核蛋白复合物 (RNP) 介导的S. reilianum转化的靶标。一个例子显示了 RNP 介导的 CRISPR/Cas9 转化在S. reilianum中的效率。生成了在 pOTEF 启动子下表达 GFP 的S. reilianum SRZ2菌株。 sgRNA+Cas9靶向GFP编码序列被转化，移码突变体失去了GFP信号。 GFP sgRNA 的效率：~41% (34/83)。

一般注意事项和故障排除

故障排除

不。

步

问题

建议/解决方案

1

sgRNA合成

低浓度

(<500 纳克/微升)

不进行转化，重复合成；需要最小体积的高浓度

2

体外裂解试验

解理后无条带

1) 测试Cas9酶的功能（使用对照）

2）新sgRNA的设计

致谢

该项目获得了欧洲研究理事会（ERC）根据欧盟地平线2020研究和创新计划（资助协议编号771035）提供的资金，以及德国卓越战略下德国研究基金会（DFG，德国研究基金会）的资助，EXC-2048/1-项目 ID：390686111。该协议改编自以前的工作 [14]。

参考

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补充资料

可以在此处下载以下支持信息：

图S1。将单个 GFP 整合到 SRZ2 菌株中的 Southern 印迹。