材料与试剂

生物材料

^{携带条件性 CreER T2}转基因的CreER ^T2 C57BL/6 小鼠（杰克逊实验室，库存 004682）
纯合 Stn1 ^flox/flox (Stn1 ^F/F ) C57BL/6 小鼠（按照 Nguyen 等人 [34] 中所述生成）
克里尔^T2； Stn1 ^F/F和对照 Stn1 ^F/F C57BL/6 小鼠：通过将 Stn1 ^F/F与 CreER ^T2 C57BL/6 小鼠杂交产生，产生 Stn1 ^Flox等位基因杂合子和 CreER ^T2基因型半合子。然后将这些小鼠与纯合 Stn1 ^F/F小鼠交配，得到 Stn1 条件敲除 CreER ^T2； Stn1 ^F/F和对照 Stn1 ^F/F基因型如前所述 [34]。

试剂

DMEM/F-12（Gibco，目录号：11320033）
胎牛血清（FBS）（Biowest，目录号：S1620）
抗生素/抗真菌溶液（HyClone，目录号：SV30079.01）
胰蛋白酶-EDTA 0.05% 和 0.025%（Gibco，目录号：2530062）
DMSO（Sigma，目录号：D-5879）
4-羟基他莫昔芬（4-OHT）（VWR，目录号：89152-604）
KOD 热启动 DNA 聚合酶试剂盒（Millipore Sigma，目录号：710863，试剂盒中提供溶液）
寡核苷酸：

oIMR5984：5'-GCTAACCATGTTCATGCCTTC-3'（Cre 转基因正向）

oIMR8744：5'-CAAATGTTGCTTGTCTGGTG-3'（Cre 转基因反向）

oIMR8745：5'-GTCAGTCGAGTGCATAGTTT-3'（Cre 内部正向对照）

oIMR9074：5'-AGGCAAATTTGGTGTACGG-3'（Cre 内部阳性对照反向）

Stn1loxPShift-F：5'-TGTAATCCCAGCGCTCAGGAG-3'

Stn1loxPShift-R：5'-GATCTGACAGAGATCTCCTGGCT-3'

Obfc1 5'wtF2：5'-GACTCCTTAGCCCCAGATCTCCGTCAT-3'

Obfc1 5'mtR：5'-CTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATGGATCCACCGACT-3'

Obfc1 5'mtF：5'-CCACATAGTCGGTGGATCCATAACTTCGT-3'

Obfc1 5'wtR：5'-GGGCTAGGGTGTAGCTCAATGGTAGA-3'

Obfc1 3'wtF：5'-CTCTGGGGAGACTGTCTCAGATGTTCA-3'

Obfc1 3'mtR：5'-GAGGCTCAGGATCCATAACTTCGT-3'

Obfc1 3'mtF：5'-GCCAGCCTGGTCTACGTGACAATAACT-3'

Obfc1 3'wtR：5'-GGTCATATGGCCTCACCCTCTAAGA-3'
甘油（Fisher Scientific，目录号：BP-229-1）
琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A9539-500G）
DTT（Sigma-Aldrich，目录号：D0632-5G）
抗 STN1 抗体（Santa Cruz，目录号：sc-376450），1:500 稀释
抗-β-肌动蛋白（Sigma，目录号：A2228）1:60,000 稀释
辣根过氧化物酶二抗：TrueBlot 抗小鼠 IgG HRP 缀合（Rockland，目录号：18-8817-30）1:2,000 稀释
SuperSignal West Femto（Thermo Fisher，目录号：34095）
过氧化氢（30%，ACS 级）（Ward's Science，目录号：470301）
结晶紫（Sigma，目录号：C3886）
CHAPS（Fisher Scientific，目录号：BP571-5）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：459844-4L）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Fisher Scientific，目录号：BP166-500）
溴酚蓝（Sigma，目录号：B-8026）
NaOH（Fisher Scientific，目录号：S318-500）
氯化钠（Fisher Scientific，目录号：S271-1）
Tris-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：T3253-500G）
Na ₂ HPO ₄（VWR，目录号：0404-500G）
KH ₂ PO ₄（JT Baker，目录号：3246-01）
KCl（EMD，目录号：PX1405-1）
Tween-20（VWR，目录号：M147-1L）
脱脂奶粉（雀巢，目录号：12428935）

解决方案

2 mM 4-OHT 库存溶液（参见配方）
DNA 分离裂解缓冲液（参见配方）
DNA 分离中和缓冲液（参见配方）
磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，pH 7.4（参见食谱）
CHAPS 裂解缓冲液（参见配方）
加载缓冲液（参见配方）
结晶紫染色液（参见配方）
70% 乙醇中的 1% SDS
PBS-吐温 (PBST)
DMEM/F-12 培养基（参见配方）

食谱

所有溶液均使用高压灭菌的 Milli-Q 水或 DMSO 制备。

2 mM 4-OHT 库存溶液

试剂最终浓度数量或体积

4-羟色胺 2毫米 7.75毫克

二甲基亚砜不适用 10毫升

全部的不适用 10毫升

储存于-20°C。避光。如需长期储存，请将溶液储存在 -80 °C 下。

DNA 分离裂解缓冲液

试剂	最终浓度	数量或体积
氢氧化钠	25毫米	20毫克
乙二胺四乙酸	0.2毫摩尔	1.17毫克
水_分子	不适用	20毫升
全部的	不适用	20毫升

储存在室温 (RT) 下。

DNA 分离中和缓冲液 (pH 5.5)

试剂最终浓度数量或体积

Tris-HCl 40毫米 69.9毫克

水_分子不适用 20毫升

全部的不适用 20毫升

储存于室温。

公共广播公司

试剂	最终浓度	数量或体积
氯化钠	137毫米	8克
氯化钾	2.7毫米	0.2克
Na ₂ HPO ₄	10毫米	1.44克
KH ₂ PO ₄	1.8毫米	0.24克
水_分子	不适用	1,000 毫升
全部的	不适用	1,000 毫升

储存于室温。

CHAPS 裂解缓冲液

试剂	最终浓度	数量或体积
章 10%	1%	10毫升
Tris-HCl pH 7.4	30毫米	363.4毫克
氯化钠	150毫米	876.6毫克
数码地面电视	200毫米	3克
水_分子	不适用	90毫升
全部的	不适用	100毫升

储存于-20°C。

加载缓冲液

试剂	最终浓度	数量或体积
十二烷基硫酸钠 20%	4%	20毫升
Tris-HCl pH 6.8	100毫米	1.21克
溴酚蓝	0.2%	0.2克
甘油	20%	20毫升
水_分子	不适用	60毫升
全部的	不适用	100毫升

储存于室温。

结晶紫染色液

试剂最终浓度数量或体积

水晶紫 0.5% 2.5克

乙醇不适用 500毫升

全部的不适用 500毫升

储存于室温。

70% 乙醇中的 1% SDS

试剂	最终浓度	数量或体积
十二烷基硫酸钠 20%	1%	50毫升
乙醇	70%	700毫升
水_分子	不适用	250毫升
全部的	不适用	1,000 毫升

储存于室温。

PBST

试剂	最终浓度	数量或体积
氯化钠	137毫米	8克
氯化钾	2.7毫米	0.2克
Na ₂ HPO ₄	10毫米	1.44克
KH ₂ PO ₄	1.8毫米	0.24克
吐温-20 50%	0.05%	1毫升
水_分子	不适用	999 毫升
全部的	不适用	1,000 毫升

储存于室温。

DMEM/F-12培养基

试剂

最终浓度

数量或体积

DMEM/F-12

不适用

500毫升

胎牛血清

100×抗生素/抗真菌剂

13%

1×

75毫升

5毫升

全部的

不适用

580毫升

实验室用品

96孔板（Genesee Scientific，目录号：25-109）
6 孔板（VWR，目录号：10062-892）
10厘米组织培养皿（Nest Biotechnology，目录号：704201）
PVDF膜（MilliporeSigma，目录号：ISEQ00010）
镊子（Fisher Scientific，目录号：08-880）
解剖剪刀（Fisher Scientific，目录号：08-940）
手术刀（Fisher Scientific，目录号：12-000-164和12-000-161）

设备

倒置显微镜（Fisherbrand，型号：03000013）
SDS-PAGE 和蛋白质印迹转移装置（Bio-Rad，型号：Mini-PROTEAN Tetra 系统）
热循环仪（Bio-Rad，型号：T100 热循环仪）
iBright 成像系统（Thermo Fisher，型号：CL1000）
酶标仪（BioTek，型号：Synergy H1）

软件和数据集

GraphPad Prism v9.3（GraphPad，2021 年 11 月 15 日）
ENSEMBL 小鼠基因组浏览器 110 ( https://useast.ensembl.org/Mus_musculus/Info/Index )

程序

设计 CRISPR/Cas9 插入 loxP 位点

小鼠Stn1位点包含 10 个外显子，ATG 起始密码子位于外显子 2 中（图 1A）。当最初设计loxP插入位点时，删除鼠Stn1的最方便方法似乎是删除外显子 5 和 6，这将产生移码并生成截短的 STN1 蛋白。然而，该区域存在功能未知的长非编码RNA（lncRNA）。为了避免影响该 lncRNA，我们通过在启动子区域上游和外显子 2 中 ATG 起始密码子下游插入两个loxP位点来定位Stn1基因的上游区域（图 1A）。补充文件1中提供了序列信息和确切的loxP插入位点。Cre表达导致启动子序列和翻译起始位点的删除，从而抑制基因的转录和翻译（图1A）。删除启动子区域还可以消除由下游 ATG 密码子合成的截短蛋白质可能引起的并发症。然而，我们发现诱导型Stn1缺失是不完全的，可能是由于两个loxP位点之间的距离过长导致重组效率低下，导致STN1部分敲除或耗尽。
小鼠胚胎成纤维细胞的分离
1. 建立CreER ^T2育种对； Stn1 ^F/F和Stn1 ^F/F C57BL/6 小鼠，雄性CreER ^T2； Stn1 ^F/F与雌性Stn1 ^F/F配对，或雄性Stn1 ^F/F与雌性CreER ^T2配对； Stn1 ^F/F。我们没有观察到育种差异。
2. _{用 CO 2}对怀孕 12-14 天（预计）的小鼠进行安乐死，然后进行颈椎脱位。
  
  关键：在转移到细胞培养罩下之前，用 70% 乙醇彻底喷洒小鼠。
3. 用无菌剪刀打开腹腔。小心不要打扰子宫角。
  
  注意：在切口前用无菌镊子提起皮肤并对腹壁进行同样的操作可确保不会造成意外损伤。
  
  关键：重要的是要防止任何毛发进入后续步骤。必要时更换仪器。
4. 用镊子轻轻提起胚胎，然后用剪刀将其剪到靠近骨盆的位置，以提取仍在子宫角内的胚胎。然后，将它们放入装有 ~10 mL PBS 的 10 厘米培养皿中，预热至 37°C。
  
  注意：如果它们不能自由提起，请仔细检查要切割的位置。
  
  关键：重要的是不要撕裂或切割肠道的任何部分，以避免细菌污染。
5. 切开子宫并提取仍在羊膜囊内的胚胎；通过切割每个胚胎之间的区域来分离胚胎，并取出每个胚胎，同时保持羊膜囊完整。
6. 用镊子和无菌手术刀打开羊膜囊，取出胚胎，并在眼线上方切断头部。将切断的头部放入冰上的单独管中，以便稍后提取 DNA。
7. 用手术刀取出红色器官，并将剩余组织放入 6 孔皿中的 2 mL 0.05% 胰蛋白酶中。
8. 用剪刀轻轻但彻底地破坏组织，直到没有大于 1 × 1 × 1 毫米的碎片残留。
9. 对每个胚胎重复步骤 B5-7，并将培养皿放入 37°C、5% CO _{2 的}培养箱中10 分钟。
  
  注意：在处理第一个胚胎后不到 5 分钟内开始孵化，具体取决于胚胎的数量和每个胚胎所需的时间。不同批次的孵化可能需要错开。
  
  关键：建议快速处理以尽量减少细胞死亡。
10. 用 P1000 轻轻上下移液细胞悬浮液，以进一步机械分离细胞，然后将其转移到 2 mL 的 DMEM/F-12 培养基中并再次重悬。
11. 5 分钟后，将上清液转移至新管中，将较大的组织碎片留在管底部。
12. 将新管以500 ×g离心2分钟，弃上清；将细胞沉淀重悬于 2 mL 新鲜 DMEM/F-12 培养基中，转移至 6 孔培养皿中，并放入培养箱中过夜。
  
  注意：小心不要混合或混合来自不同胚胎的细胞。
13. 第二天，用新鲜培养基更换培养基。
14. 监测细胞，直到每个孔达到完全汇合（1-2 天后），然后转移到 10 厘米培养皿中进行扩增，随后冷冻细胞。
基因型验证
1. 将一小块细胞分离组织（参见 B6）放入 50 μL DNA 分离裂解缓冲液（参见配方 2）中，并在 98 °C 下孵育 1 小时。
2. 孵育后，添加 50 μL DNA 分离中和缓冲液（参见配方 3），彻底上下移液混合物以破坏组织的其余部分，然后转移到新管中，留下任何明显的组织团块。
  
  暂停点：DNA 可保存在 -20 °C 直至需要为止。
3. 使用每种最终混合物 1 μL，使用 Cre 转基因引物对和 Stn1flox 引物对进行 PCR 反应。
  1. 为了确定动物是否含有CreER ^T2转基因，PCR 反应应包含：
    
    1 μL 裂解液
    
    2.5 μL dNTP（2.5 mM 库存）
    
    2.5 µL 10× 缓冲液用于 KOD 热启动
    
    1.5 μL oIMR5984 (10 μM)
    
    1.5 μL oIMR8744 (10 μM)
    
    1.5 µL oIMR8745 (10 µM)
    
    1.5 µL oIMR9074 (10 µM)
    
    0.5μL KOD
    
    1.5 μL MgSO ₄（50 mM 库存）
    
    1.25 μL 二甲基亚砜
    
    9.75 μL H ₂ O
    
    总计 25 μL
    
    在以下热循环仪条件下运行 PCR：
    1. 95°C 5 分钟
    2. 95°C 30 秒
    3. 55°C 30 秒
    4. 72℃1分钟
    5. 转至2) 31个循环
    6. 72°C 5 分钟
    7. 10°C无限保持
  2. 为了确定动物的 Stn1 flox 等位基因是纯合子还是杂合子，PCR 反应应包含：
    
    1 μL 裂解液
    
    2.5 μL dNTP（2.5 mM 库存）
    
    2.5 µL 10× 缓冲液用于 KOD 热启动
    
    1.5 μL STN1loxPShift-F (10 μM)
    
    1.5 μL STN1loxPShift-R (10 μM)
    
    0.5μL KOD
    
    1.5 μL MgSO ₄（50 mM 库存）
    
    1.25 μL 二甲基亚砜
    
    13 μL H ₂ O
    
    在以下热循环仪条件下运行 PCR：
    1. 95°C 5 分钟
    2. 95°C 20 秒
    3. 60°C 30 秒
    4. 72°C 40 秒
    5. 转至2) 34个循环
    6. 72°C 2 分钟
    7. 10°C无限保持
  3. （可选）为了验证动物是否在正确的Stn1位点中包含loxP插入，可以进行四个额外的 PCR 反应：
    
    1 μL 裂解液
    
    2.5 μL ldNTP（2.5 mM 库存）
    
    2.5 µL 10× 缓冲液用于 KOD 热启动
    
    1.5 μL 引物 a、c、e 或 g (10 μM)（参见下面的引物注释）
    
    1.5 μL 底漆 b、d、f 或 h (10 μM)（参见下面的底漆注释）
    
    0.5μL KOD
    
    1.5 μL MgSO ₄（50 mM 库存）
    
    1.25 μL 二甲基亚砜
    
    13 μL H ₂ O
    
    在以下热循环仪条件下运行 PCR：
    1. 95°C 5 分钟
    2. 95°C 20 秒
    3. 60°C 30 秒
    4. 72°C 40 秒
    5. 转至2) 34个循环
    6. 72°C 2 分钟
    7. 10°C无限保持
  笔记：
  
  引物对 #1：如果存在 5' loxP，则产生 547 bp 产物。
  
  引物 a：Obfc1 5'wtF2，在 5'loxP 位点上游退火（图 1A）
  
  引物 b：Obfc1 5'mtR，在 5'loxP 位点退火（图 1A）
  
  引物对 #2：如果存在 5' loxP，则产生 226 bp 产物。
  
  引物 c：Obfc1 5'mtF，在 5'loxP 位点退火（图 1A）
  
  引物 d：Obfc1 5'wtR，在 5'loxP 位点下游退火（图 1A）
  
  引物对 #3：如果存在 5' loxP，则产生 335 bp 产物。
  
  引物 e：Obfc1 3'wtF，在 3'loxP 位点上游退火（图 1A）
  
  引物 f：Obfc1 3'mtR，在 3'loxP 位点退火（图 1A）
  
  引物对 #4：如果存在 5' loxP，则产生 550 bp 产物。
  
  引物 g：Obfc1 3'mtF，在 3'loxP 位点退火（图 1A）
  
  引物 h：Obfc1 3'wtR，在 3'loxP 位点下游退火（图 1A）
  
  图 1. Stn1 ^F/F等位基因和CreER ^T2转基因的基因分型。 A. 编码鼠Stn1基因的靶向构建体，该基因包含 10 个外显子。黄色箭头表示loxP位点。箭头表示 PCR 引物位点。打开框：非编码外显子。 Cre 蛋白是一种位点特异性 DNA 重组酶，可重组一对loxP序列。 Cre 酶与loxP 位点结合并将两个位点结合在一起，催化它们之间的重组事件，导致两个loxP位点之间的 DNA 序列切除。切除的 DNA 通常会被降解，剩余 DNA 的末端会连接在一起。 B. 用于检测Stn1 ^F/F等位基因是否存在的 PCR 产物示例。 C. 用于检测CreER ^T2转基因的 PCR 产物示例。
4. 向每个 PCR 反应中添加 5 μL 6× 上样缓冲液（参见配方 6），并将 12 μL 混合物上样到 2.5% 琼脂糖电泳凝胶上。 120 V 运行 1 小时。
  
  暂停点：PCR 反应在电泳前可在 -20 °C 下保存几天。
  
  预期结果和解释：WT等位基因将产生184 bp的PCR产物，重组的flox等位基因将产生218 bp的产物。如果 PCR 反应产生单个 218 bp 条带，则表明该动物为Stn1 ^F/F；单个 184 bp PCR 产物意味着该动物为Stn1 ^+/+； 184 bp 和 218 bp 的双条带意味着该动物是Stn1 ^F/+（图 1B）。CreER ^T2转基因的存在会产生双条带（图 1C）。
MEF 的培养和 Stn1 的诱导敲除
1. _{在 37°C、5% CO 2}的 DMEM/F-12 培养基中培养 MEF 细胞。
2. 当细胞以 1:4 的分流比接近或完全汇合时进行传代。
  
  注意：当传代后细胞汇合度太低时，细胞需要很长时间才能生长。
3. 为了诱导 Cre 表达以耗尽 Stn1，将 4-OHT 添加到培养基中，终浓度为 2 μM，持续 48-96 小时。
MEF 的永生化
1. _{原代细胞通过在 DMEM/F-12 培养基中于 37 °C、5% CO 2}连续传代数月（20 次以上传代）而自发永生化。继续生长且不衰老的存活细胞可被认为是永生化的。永生化细胞的形态略有不同（图2）。
2. 为了诱导 Cre 表达以敲除 Stn1，请将 4-OHT 以 2 μM 的浓度添加到培养基中 48-96 小时。
  
  图 2. 原代和永生化小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 的细胞形态。 A. 原代 MEF 细胞倾向于聚集生长。 B. 与原代 MEF 相比，永生化 MEF 生长得更均匀，分布更均匀，细胞收缩且呈圆形，纺锤体更窄。图像是用配备 10 倍相差镜头的蔡司倒置显微镜 Observer 拍摄的。
诱导后蛋白质水平分析
1. 将细胞重悬于 15 μL CHAPS 裂解缓冲液中（参见配方 5）并在冰上孵育 30 分钟，从 20,000 个细胞中提取蛋白质。然后，在 4°C 下以 12,000 × g旋转15 分钟，并将上清液与 2× 上样缓冲液按 1:1 混合。
2. 将样品加载到 10% SDS-PAGE 凝胶上，并在 SDS 凝胶电泳缓冲液中以 160 V 运行 60 分钟。
  
  注意：确切的运行时间可能有所不同；参考上样缓冲带的位置并运行直至其靠近凝胶的底部边缘。
3. 将蛋白质从凝胶转移到 Bio-Rad 转移室中的 PVDF 膜上，在 ~100 V 和 400 mA 下持续 70 分钟。
4. 将膜在 PBST 缓冲液 + 5% 脱脂牛奶中在 RT 下封闭 1 小时。
5. 将膜在 PBST 中的一抗（抗 STN1 和抗 β-肌动蛋白）中于 4 °C 孵育过夜。
6. 在 PBST 中清洗膜五次，每次 10 分钟。
7. 将膜在 5% 脱脂牛奶 PBST 缓冲液中的 HRP 二抗中于 RT 孵育 1 小时。
8. 在 PBST 中清洗膜五次，每次 10 分钟。
9. 将 SuperSignal West Femto 混合物在 ddH ₂ O 中按 1:5 稀释到湿膜上。
10. 使用 iBright CL1000 成像系统捕获蛋白质印迹信号。蛋白质印迹信号的示例如图 3A 和 3B 所示。
  
  图 3. STN1 耗竭的诱导导致细胞对氧化应激敏感。 A. 原代Stn1 ^F/F和CreER ^T2、Stn1 ^F/F小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 克隆用 4-OHT (2 μM) 处理 48 小时。通过蛋白质印迹分析 STN1 蛋白表达。 B. 自发永生化的Stn1 ^F/F和Cre、Stn1 ^F/F MEF 克隆用 4-OHT (2 μM) 处理 48 小时。通过蛋白质印迹分析 STN1 蛋白表达。 C. 将永生化 MEF 克隆接种到 35 mm 培养皿中，然后用 4-OHT 处理 48 小时。然后将细胞用胰蛋白酶消化并接种到 96 孔板中，每孔 5,000 个细胞。一旦细胞贴壁，就添加指定浓度的过氧化氢24小时。通过结晶紫比色测定法测定细胞活力。进行了两次独立的实验。显示了一项实验的代表性结果。误差线：SD
测试细胞对过氧化氢的敏感性
1. 根据步骤 D3 进行诱导后，在培养物中生长 MEF，进行胰蛋白酶处理，并将 5,000 个细胞接种到 96 孔板的每个孔中。维持培养基中的 4-OHT。每个样品和每个处理条件的六个孔中的种子细胞。
2. 细胞沉降并附着在培养皿上约 3 小时后，添加过氧化氢并将培养板在 37 °C 和 5% CO ₂下孵育过夜。
3. 用多通道移液器去除培养基，每孔用 200 μL PBS 轻轻清洗，然后去除 PBS。
  
  注意：为避免细胞意外脱离，应沿孔的侧面缓慢添加 PBS，并以相同的方式遍及整个板。去除培养基和 PBS 时应缓慢地进行，使板稍微倾斜，并将移液器尖端放在孔的一角。
4. 向每个孔中添加 100 μL 结晶紫溶液（参见配方 7），并在室温下孵育 15 分钟。
5. 倒出结晶紫溶液并用纸巾牢牢吸干。
6. 用多通道移液器添加 ddH ₂ O，倒出，并用纸巾牢牢吸干。
7. 将板在 RT 下浸入 ddH ₂ O 中 15 分钟，倒出，并用纸巾吸干。
8. 将板风干直至完全干燥。
  
  暂停点：如有必要，干燥的板可以在室温下干燥避光的地方保存过夜。
9. 每孔添加 200 μL 1% SDS 的 70% 乙醇溶液（参见配方 8），小心地重悬并用多通道移液器混合每个孔，不要引入气泡。
10. 使用读板器测量 570 nm 处的吸光度。结果如图3C所示。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：

阮等人。（2023）。哺乳动物 STN1 缺乏会通过抑制 DNA 修复促进结肠癌的发展。科学进展（图 4、图 6，图 D 和 E，图 7，图 A）。

一般注意事项和故障排除

故障排除

问题1：MEF细胞生长缓慢。

可能的原因：经过多次传代后，原代 MEF 衰老。

解决方案：使用早期传代的 MEF 细胞。建议冷冻几份早期传代的原代 MEF 以供以后使用。

问题 2：抗 Stn1 蛋白质印迹背景较高。

可能的原因：使用常规 HRP 标记的二抗小鼠 IgG 抗体。

解决方案：使用 TrueBlot HRP 标记的抗小鼠二抗。

问题 3：永生化 MEF 细胞失去 Stn1 耗尽。

可能的原因：我们最初使用SV40大T抗原来永生化MEF。然而，我们发现用这种方法永生化的 MEF 对 4-OHT 治疗没有反应，并且似乎失去了 STN1 的消耗。尽管这种损失的确切原因尚不清楚，但我们怀疑 SV40 大 T 抗原改变了双链断裂的修复，这可能会影响 CreloxP重组效率和精度。此外，大量 T 抗原表达会导致更高的突变和染色体畸变，这可能会影响 Cre 重组作用的位点。

解决方案：使用自发永生化的 MEF。不要使用 SV40 大 T 抗原来永生化 MEF。

问题 4：Cre 诱导后 STN1 消耗效率低下。

可能原因：他莫昔芬治疗时间不够长，或他莫昔芬浓度不正确。

解决方案：细胞需要用 4-OHT 处理至少 48 小时才能实现有效的 Stn1 消耗。检查 4-OHT 浓度以确保其正确。

致谢

我们感谢 Duc Dinh Nguyen、Eugene Kim、Thanh Nguyen 和 Olga Shiva 提供的技术援助。该协议在原始研究论文中进行了描述和验证：DOI：10.1126/sciadv.add8023。

利益争夺

作者声明不存在任何财务或非财务竞争利益。

道德考虑

动物被安置在芝加哥洛约拉大学健康科学校区的特定无病原体动物设施中并进行研究。所有研究均得到机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。

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补充资料

可以在此处下载以下支持信息：

鼠 Stn1（又名 OBFC1）基因座的序列，包括上游区域。 loxP 插入位点的位置和插入的 loxP 序列被突出显示。红色长箭头表示基因分型中使用的引物的位置。