材料与试剂

生物材料

Premium 胎牛血清（Bio-Techne，目录号：S11150）
寡核苷酸（整合 DNA 技术或其他相关来源）
1. 有义链和反义链互补
2. 添加修饰碱基（包括 2'-O-甲基和 2'-氟核苷酸）、主链修饰（包括硫代磷酸酯主链修饰、替换寡核苷酸主链中特定位置的磷酸二酯键）或其他修饰的选项。

试剂

无核酸酶水（Invitrogen，目录号：AM9932）
Tris碱，分子生物学级（Millipore Sigma，目录号：648310）
浓盐酸（HCl）（Fisher Chemical，目录号：SA49）
氯化钠（NaCl）（Millipore Sigma，目录号：S9888）
EDTA（0.5 M），pH 8.0，不含 RNase（Invitrogen，目录号：AM9260G）
牛磺酸（Millipore Sigma，目录号：T0625）
丙烯酰胺/双溶液 29:1 (30%)（Bio-Rad，目录号：1610156）
过硫酸铵（APS）（Millipore Sigma，目录号：A3678）
TEMED（四甲基乙二胺）（Bio-Rad，目录号：1610800）
2× RNA 上样染料（Thermo Scientific，目录号：R0641）
GelRed 核酸凝胶染色剂（Fisher Scientific，Biotium，目录号：NC9594719）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Fisher Scientific，目录号：SH30256FS）

解决方案

氯化钠 (2.5 M)（参见食谱）
1 M Tris，pH 7.5-8.0（参见配方）
10× 退火缓冲液（参见配方）
20× 耐甘油凝胶缓冲液（参见配方）
15% 聚丙烯酰胺甘油耐受凝胶（参见配方）

食谱

氯化钠 (2.5 M)

试剂最终浓度数量

氯化钠（粉末） 2.5M 1.46克

无核酸酶 H ₂ O 不适用 10毫升

全部的 2.5M 10毫升

1 M Tris，pH 7.5-8.0

试剂	最终浓度	数量
Tris碱基	1M	121.1克
无核酸酶 H ₂ O	不适用	800毫升
浓盐酸	不适用	65毫升
无核酸酶 H ₂ O	不适用	添加使最终体积达到 1 L
全部的	不适用	1升

10×退火缓冲液

试剂	最终浓度	数量
Tris，pH 7.5–8.0 (1 M)（配方 2）	100毫米	400 µL
氯化钠 (2.5 M)（配方 1）	500毫米	800 µL
乙二胺四乙酸 (0.5 M)	10毫米	80微升
无核酸酶 H ₂ O	不适用	2,720 µL
全部的	不适用	4毫升

储存于-20°C

20× 耐甘油凝胶缓冲液

试剂	最终浓度	数量
Tris碱基	1.78M	216克
牛磺酸	570毫米	72克
乙二胺四乙酸 (0.5 M)	1毫米	2毫升
无核酸酶 H ₂ O	不适用	达到 1,000 mL
全部的	不适用	1,000 毫升

储存于 4°C

15%聚丙烯酰胺甘油耐凝胶（见注4）

试剂	最终浓度	数量
丙烯酰胺/双溶液 29:1 (30%)	15%	7.5毫升
耐甘油凝胶缓冲液 (20×)（配方 4）	1×	750 µL
过硫酸铵（10%）	0.1%	150微升
泰美德	1%	15微升
无核酸酶 H ₂ O	不适用	6.6毫升
全部的	不适用	900毫升

实验室用品

标准移液器吸头，容量为 2 µL、20 µL、200 µL 和 1 mL
2、20、200 和 1,000 µL 手动移液器套件（Mettler-Toledo，Rainin，目录号：17014393、17014392、17014391 和 17014382 或类似产品）
优质微量离心管 1.5 mL（Fisherbrand，目录号：05-408-129，或类似的无 RNase 微量离心管）
Bel-Art ^®带盖凝胶染色盒（Millipore Sigma，目录号：BAF135511000-1EA）

设备

标准干式加热器（VWR，目录号：75838-318）
Criterion 空盒（Bio-Rad，目录号：3459901）
Criterion 电池和 PowerPac 基本电源（Bio-Rad，目录号：1656019）
VWR ^®紧凑型紫外线透射仪（VWR，目录号：76407-432）
实验室摇床（Reliable Scientific，型号：55）
高分辨率数码相机（iPhone、Android或其他手机相机都可以）

软件和数据集

ImageJ 是一款基于 Java（在 Mac OS X、Linux 和 Windows 上运行）的免费软件，可从以下网址下载：http://rsb.info.nih.gov/ij/

程序

寡核苷酸双链体制备
1. 将每条单链寡核苷酸 (oligo) 链重悬至 200 µM 浓度或使用无核酸酶水重悬至所需浓度（注 1）。
2. 将 200 µM RNA 寡核苷酸溶液（有义和反义）各 10 µL 和 5 µL 10× 退火缓冲液（配方 3）与 25 µL 无核酸酶水混合在 1.5 mL 微量离心管中。最终体积为 50 µL（注 2）。
3. 将溶液在干热块中于 95 °C 下孵育 5 分钟，然后缓慢冷却至室温（关键）（注 3）。
4. 该溶液可在-20°C 下冷冻保存，并可冻融最多五次。寡聚双链体的最终浓度为 40 µM，可以用无核酸酶水稀释至所需浓度（暂停点）。

寡核苷酸双链体分析
1. 使用 12 孔或 18 孔梳子浇注 15% 聚丙烯酰胺甘油耐受凝胶（配方 5）（注 4）。
2. 将聚合凝胶放入凝胶运行装置中，并填充 1× 甘油耐受凝胶缓冲液（20× 甘油耐受凝胶缓冲液的稀释液，配方 4）。
3. 轻轻地从凝胶上取下梳子，并通过用力将 1× 甘油耐受凝胶缓冲液移入空孔中来清理孔。
4. 将 1 µL 所需浓度的寡核苷酸样品与 4 µL 水和 5 µL 2× RNA 负载染料混合（注释 5 和 6）。
5. 在干热块中 70°C 使 RNA/RNA 负载染料变性 5 分钟，然后将样品快速转移回冰上。
6. 将样品加载到凝胶上并在 100 V 下运行，直到实现所需的分离（注 7）。
7. 凝胶运行完毕后，小心地分离玻璃盒并取出凝胶。将凝胶转移到小皿中进行染色。
8. 将 1 µL GelRed 与 10 mL 的 1× 甘油耐受凝胶缓冲液混合，使用 GelRed 核酸凝胶染色剂对凝胶进行染色。将凝胶在该混合物中室温孵育 10 分钟，同时轻轻摇动（不要超过最大值的 30%，以避免凝胶撕裂）。
9. 使用紫外透照仪可视化凝胶中的寡核苷酸条带，以确认双链体成功退火并评估样品的纯度。
10. 使用高分辨率相机捕获图像（图 1）。这可用于使用 ImageJ 或类似的量化软件量化条带强度。
  
  图 1. 用于寡核苷酸双链体生成定性评估的聚丙烯酰胺凝胶图像。含有 2'-O-甲基和 2'-氟碱基和硫代磷酸酯主链修饰的完全修饰版 miR-34a (FM-miR-34a) 的代表性 GelRed 染色聚丙烯酰胺凝胶，突出显示了寡双链体的成功退火（如迁移率所示）在凝胶上移动。有关本实验所用寡核苷酸的确切序列和修饰模式，请参阅 Abdelaal 等人。 [8]。每个泳道加载 40 pmol 的寡核苷酸。 Li 等人对其他寡核苷酸双链体进行了类似的质量评估。 [14]；奥雷利亚纳等人。 [9]。
血清稳定性测定
1. 在 50% FBS 中制备 50 pmol 寡双链体，总体积为 10 µL（注 8 和 9）。
2. 准备正确数量的管（在室温下）以反映所需的时间点。建议的时间点包括 0 分钟、10 分钟、30 分钟、1 小时、6 小时、12 小时和 24 小时。
3. 在 37°C 下孵育管直至达到时间点。此时，将 5 µL RNA/血清样品与 5 µL RNA 上样染料混合，并将相应管储存在 -20 °C（注 10）（暂停点）。
4. 最后一个时间点后，在耐甘油凝胶缓冲液中的 15% 聚丙烯酰胺凝胶上分析样品，然后使用 GelRed 核酸凝胶染色剂对 RNA 进行染色，如 B 节中所述（图 2）。
  
  图 2. 血清稳定性凝胶。部分修饰 (PM) 和完全修饰 (FM) miR-34a 在暴露于 50% 血清一段时间后的代表性 GelRed 染色聚丙烯酰胺凝胶。有关寡核苷酸的确切序列和修饰模式，请参阅 Abdelaal 等人。 [8]。每个泳道包含 50 pmol 与血清一起孵育的寡核苷酸。图改编自 Abdelaal 等人。 [8]。 Li 等人对双链体稳定性进行了类似的评估。 [14]；奥雷利亚纳等人。 [9]。

笔记

在整个协议中，单链寡核苷酸的库存浓度被认为是 200 µM。
关键要求是两条链的等摩尔比为 1:1，尽管两条链的浓度可以更高或更低。退火测试的最高浓度是寡核苷酸双链体的终浓度 50 µM。
这是通过关闭热源但将管留在干热块内，使其逐渐冷却至室温来实现的。或者，可以使用烧杯水作为水浴来达到 95°C 的温度，然后移除热源，让装有寡核苷酸管的烧杯水逐渐冷却至室温。
该工艺针对使用 Criterion 空盒浇铸凝胶进行了优化。为了避免过早聚合，10% APS 和 TEMED 应是最后添加到凝胶溶液中的两种试剂。添加 TEMED 后，混合并快速转移适当体积的凝胶溶液 (~13 mL) 以填充空盒。将梳子插入凝胶中，等待 20-30 分钟以使凝胶聚合发生。不要丢弃剩余的凝胶溶液 (~2 mL)，因为它可用于验证凝胶溶液是否已完全聚合。根据 Criterion 凝胶，凝胶通常在室温下在 100 V 电压下运行，无需担心过热。
如果样品之前已冷冻，请在冰上解冻。
包括必要的对照，例如单链寡核苷酸，如果需要，还可以包括 DNA/RNA 梯子。
根据寡核苷酸的大小，可能需要不同的分辨率时间才能实现必要的分离。对于每条链大小为 19-25 个核苷酸的 microRNA（例如 miR-34a），室温下的运行时间通常为 90-120 分钟。
这是通过添加 1.25 µL 无核酸酶水和 2.5 µL 100% FBS 来稀释 1.25 µL 40 µM 双链体来实现的。如果设置多个试管，则可以创建主混合物。
寡核苷酸可以在所有时间点或选定的时间点作为阴性对照与 PBS 代替 FBS 一起孵育。这确保任何降解均归因于血清，而不是样品或水中潜在的核酸酶污染。
对于 0 分钟时间点，确保在添加血清后立即添加 RNA 上样染料并立即冷冻。

数据分析

使用 ImageJ 或类似软件测量条带强度。使用 ImageJ 的协议可以在 Davarinejad [15] 中找到。
虽然一次技术重复就足够了，但由于与牛血清相关的变异性，至少需要三次生物重复。
学生t检验可用于比较两个单独的寡核苷酸之间的条带强度。方差分析可用于比较血清稳定性测定中使用的多个时间点的条带强度。

协议验证

该方案用于生成功能性 microRNA-34a (miR-34a) 双链体并将其特异性快速地递送至肿瘤组织。它还用于评估配体缀合的 miR-34a 的发育 [9,11]
该协议用于生成和评估完全修饰的 miR-34a 的稳定性，与部分修饰的 miR-34a 和未修饰的 miR-34a 双链体在 50% 血清中孵育一段时间后的稳定性进行比较。虽然未修饰的和 PM-miR-34a 在暴露于血清后迅速不稳定，但 FM-miR-34a 在长达 24 小时内完全耐药，并在至少 72 小时内保持完整[8]。
建议至少进行三个独立的生物学重复，以产生准确、可靠的结果。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

该方案最初设计用于退火两个互补的合成 RNA 寡核苷酸，现已成功使用修饰寡核苷酸（包括 2'-O-甲基和 2'-氟核糖）以及其他主链修饰（包括硫代磷酸酯键）进行验证。它适用于小干扰 RNA (siRNA)、微小 RNA (miRNA)、反义寡核苷酸 (ASO) 和其他修饰寡核苷酸。
该方案使用 FBS 进行血清稳定性测定。根据需要，可以将其修改为包括以下任何牛血清类型：新生牛血清、小牛血清、成年牛血清和供体牛血清。
FBS 批次之间存在相当大的差异，包括不同水平的核酸酶和其他导致寡核苷酸降解的成分。使用新批次的 FBS 时，请加入适当的对照，以便与之前的结果进行一致的比较。
对于“食谱”部分中详细介绍的食谱，请首先准备必要的储备溶液。
该方案中使用的凝胶是使用甘油耐受缓冲液运行的聚丙烯酰胺凝胶。凝胶组合物已被稍微修改以将甘油耐受缓冲液掺入凝胶内。有关凝胶注模过程的其他提示，请参阅注释 4。

故障排除

上样时的最终体积可能小于 10 µL，这可能是由于 RNA 变性过程中的蒸发造成的。这不应该影响实验的结果。
凝胶中可见的未退火单链的存在可以通过精确测定单链产物的浓度并在退火过程中添加等摩尔浓度来校正。
解析凝胶上的两个单链寡核苷酸非常有用，可以更好地了解凝胶上任何分辨率较低的产物。

致谢

这项工作部分由美国国立卫生研究院 (R01CA205420 和 R01CA226259) 资助给 ALK，国防部 (W81XWH-22-1-1085) 为 ALK 提供 LCRP 创意开发奖。该协议改编自 Orellana 等人。 [11]，奥雷拉纳等人。 [9] 和阿卜杜拉尔等人。 [8]。

利益争夺

ALK 是普渡大学提交的美国专利 PCT/US2017/061997 的发明人，该专利涵盖了配体靶向递送 miRNA 的方法和用途。 ALK 是普渡大学提交的美国临时专利 63/454,177 的发明人，该专利涵盖了修饰的 miR-34a 的方法和用途。 SGI 没有竞争利益。 ALK 是 LigmiR Therapeutics 的联合创始人兼首席执行官，该公司致力于研究用于递送 microRNA 的配体介导的递送系统。

参考

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Li, W.（.、Wang, Y.、Liu, X.、Wu, S.、Wang, M.、Turowski, SG、Spernyak, JA、Tracz, A.、Abdelaal, AM、Sudarshan, K. 等开发叶酸结合的 miR-34a 治疗前列腺癌：挑战和前景。 国际科学杂志。
达瓦里内贾德，H.（2015）。使用 ImageJ 进行蛋白质印迹定量 [实验方案]。https://www.yorku.ca/yisheng/Internal/Protocols/ImageJ.pdf