材料与试剂

生物材料

3-6 个月大的 Sprague-Dowley 大鼠（Charles River，品系代码：001）

试剂

葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
碳酸氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S0751）
单磷酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S6040）
氯化钾（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
氯化镁（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）
氯化钙（Sigma-Aldrich，目录号：C7902）

解决方案

克雷布斯碳酸氢盐溶液（参见食谱）

食谱

Krebs 碳酸氢盐溶液（最终体积 0.5 L，溶于 ddH ₂ O）

试剂	最终浓度 (mM)	数量或体积
氯化钠	125	3,653 毫克
葡萄糖	10	901毫克
碳酸氢钠	26	1,092 毫克
单磷酸钠	1.25	75毫克
氯化钾	2.5	93毫克
氯化镁	1	102毫克
氯化钙	2	147毫克
全部的	不适用	500毫升

注意：为避免沉淀，在添加氯化钙之前，应先用 95% O ₂和 5% CO _{2向溶液中鼓泡。}

实验室用品

异氟烷（Abbvie，目录号：B506；还有 Henry Schein，目录号：1182097 或任何可用的）
装有 70% 乙醇的喷雾瓶（Fisher Scientific，目录号：BP82031GAL）
培养皿 100 mm × 15 mm（康宁，目录号：351029）
玻璃毛细管，灯丝外径 1.5 mm，内径 0.86 mm（例如，Sutter Instruments，目录号：BF-150-86-10 或Harvard Apparatus，目录号：GC150F-10）
丁烷喷灯
95% O ₂和 5% CO ₂气体混合物

设备

解剖和准备

麻醉诱导室（VetEquip，美国）或任何其他可用的
标准剪刀（精细科学工具，目录号：14002-12）
钝手术剪刀（Fine Science Tools，产品编号：14003-12）。或者，止血剂（Fine Science Tools，目录号：13003-10）
粗镊子（Fine Science Tools，目录号：11652-10）
弹簧剪刀（Fine Science Tools，目录号：15025-10）
精细镊子（精细科学工具，目录号：11412-11）
精细镊子（Fine Science Tools，目录号：11413-11）
啮齿类动物无绳修剪器（Bioseb，型号：Bio-1584）

电生理学和可视化

体视显微镜（奥林巴斯，型号：SZX7）
光源（AmScope，型号：6 W LED 双鹅颈照明器或任何可用的）
正置显微镜（奥林巴斯，型号：BX50WI）
4× 物镜（奥林巴斯，PLN）
相机（任何配备显微镜的）
带探头的膜片钳放大器（Molecular Devices，型号：Multiclamp 700B）
数字化仪（Molecular Devices，型号：Digidata 1440）
显微操作器（Scientifica，型号：PatchStar）
恒流刺激器（数字定时器，型号：DS3）
移液器支架（Molecular Device，型号：1-HL-U）
法拉第笼（Sutter Instruments，型号：AT-36FC）
用于电极的银线 AWG 26（WPI，目录号：AGW1510）
Ag/AgCl 颗粒（WPI，目录号：EP1）
BNC 电缆
个人电脑

软件和数据集

pClamp（版本 10.7，分子设备）
Clampfit（版本 10.7，分子设备）

程序

前期准备
1. _{在开始任何程序之前，将 Krebs 碳酸氢盐溶液加热至室温，并用 95% O 2}和 5% CO ₂气体的混合物向溶液中鼓泡。我们建议给溶液充氧 15 分钟。
2. 收集所有手术工具（图 1）并用 70% 乙醇对其和工作区域进行消毒。
  
  图 1. 神经隔离手术工具的准备
3. 在开始解剖之前，准备一个大培养皿，用于初始收集解剖的神经，并用克雷布斯碳酸氢盐溶液填充。用克雷布斯碳酸氢盐溶液准备另一个培养皿，将其转移到清洁的神经处。解剖后，神经可以在室温下保存在培养皿中。
4. 在麻醉室中用异氟烷 (4%–5%) 最终麻醉动物。通过失去踏板反射（捏住后爪）和/或角膜反射（轻轻触摸眼睛）确保完全麻醉并剔除动物（斩首）。
5. 将动物放置在设计的组织解剖区域中。使用剪刀去除腿外表面的毛皮。如果要收获两条坐骨神经，则对另一条腿重复上述步骤。

神经隔离
1. 打开纸巾之前，用 70% 乙醇喷洒皮肤。
2. 将动物侧卧，使脊柱面向实验者。拉起大腿近端部分的皮肤，在动物侧做一个长的后外侧切口，暴露股二头肌。
3. 找到大腿中部的点。垂直握住钝的手术剪刀或粗镊子，在中点穿透肌肉约 10 毫米，并沿体尾方向展开分支。将肌肉拉开会暴露坐骨神经及其分支（图 2，左上）。
  
  注意：穿透肌肉需要一定的力气，需要用力才能将其打开。
4. 使用剪刀和镊子，沿着坐骨神经的整个跨度切割肌肉，并越过其三分叉，到达即将切割分支的点（图2，右上）。
5. 使用止血钳或自固定牵开器保持坐骨神经及其分支打开。Sprague Dawley 大鼠的坐骨神经相对较长，并在远端分为分支（近端> 1 cm）。使用两个牵开器暴露神经及其分支可能有助于仔细解剖。我们尝试将大约 2 厘米的神经暴露到胫神经、腓总神经和腓肠神经的三分叉处。暴露每个分支将取决于兴趣的神经和实验目的。
6. 使用弯钳和弹簧剪刀轻轻地将坐骨神经与周围筋膜和大脂肪组织碎片分开。将弯曲的钳子插入神经近端部分下方，并沿着神经的整个跨度移动钳子，以确保其与周围组织完全分离。
  
  注意：老年大鼠的神经周围有更多的脂肪组织，尤其是在三叉点，使解剖更具挑战性。
7. 使用弹簧剪刀，将坐骨神经分支剪至所需长度。从腰骶部开始，最大限度地延长坐骨神经的长度，并向远端移动到神经前端，从一侧到另一侧切割，同时抬起神经顶部，以避免神经损伤。通常，切割的坐骨神经的长度约为 20-30 毫米。
  
  注意：仔细的神经切除对于产生高质量的神经准备至关重要。即使仅使用坐骨神经，我们也建议切割到三分叉点，因为这使得进一步的操作更容易。
8. 将神经切割至所需长度后，使用粗镊子抓住胫神经（最粗的分支）的尖端，将解剖的神经转移到装有克雷布斯碳酸氢盐溶液的准备好的培养皿中（图2）。
  
  注意：切勿挤压或拉伸神经，因为这会损坏神经。
9. 重复从另一侧解剖神经的过程。完成后，轻轻地将第二根神经转移到培养皿中。
  
  注意：尽量缩短神经解剖的时间，并在安乐死后半小时内解剖两条坐骨神经（每条神经 10-15 分钟）。
  
  图 2. 坐骨神经解剖，显示神经隔离的各个阶段，从神经的立即暴露（左上图）及其到两个隔离神经（下图）的整个开口（右上图）。请注意放大快照（右下）中神经周围的结缔组织和脂肪组织。

神经外鞘去除
1. 在双目或立体显微镜的视觉控制下，使用一把弹簧剪刀和细镊子小心地去除所有周围的组织，例如脂肪和结缔组织或筋膜组织，从神经的各个侧面（图2，右下）。
  
  注意：在手术过程中必须非常小心地处理神经，以避免拉伸神经或对组织造成意外损伤。如果需要握住神经，请握住其尖端。
2. 使用两把细镊子轻轻去除神经外膜，即覆盖神经的鞘，显着阻碍神经纤维的药物渗透性 [8]。为此，从三叉处开始，沿着神经进一步撕裂神经外膜，并沿着神经轻轻拉动鞘，注意尽可能减少神经拉伸。在此过程中，坐骨神经通常会分裂成多个分支（图 3）。基本上，腓总支可以沿着神经的整个跨度分离。胫骨和腓肠支的分裂更为复杂，尤其是在神经的近端部分。
3. 清洁将进行记录的每个神经分支，始终将组织保留在克雷布斯溶液中（图 3 右）。一旦神经外膜被移除，切断在操作过程中用镊子固定的神经末端，以确保神经的高质量记录。
  
  图 3. 神经清洁和神经外膜去除。左图，去除结缔组织和脂肪组织后的坐骨神经。右图，坐骨神经的一半神经外膜被剥离后分裂成单独的分支。
4. 将清洁的神经转移到含有新鲜含氧培养基的培养皿中。
5. 执行第二神经的清洁。
6. 测量每条神经的长度以进行进一步分析（图4）。
  
  图 4. 神经外膜去除和清洁后分离的神经分支。注意神经长度。

吸管和神经抽吸的制造
1. 抽吸电极是电生理学实验中的重要工具，我们使用抽吸电极来刺激和记录神经。
2. 使用丁烷喷灯和玻璃毛细管制造吸移管，将移液管抛光至尖端直径接近神经尺寸。虽然抽吸电极是为每个神经单独制作的，但我们建议预先制作一组具有不同尖端直径的移液器，如图 5 所示。使用相机或目镜评估尖端直径，并选择尖端最适合神经的移液器末端尺寸。
  
  注意：制造具有不同尖端直径的移液器可以根据神经的直径来容纳神经，并确保神经被牢固地固定。
  
  图 5. 玻璃移液管经过火抛光至不同的尖端直径，以实现适当的神经抽吸
3. _{准备电生理装备，用连续含氧的克雷布斯碳酸氢盐溶液（95% O 2}和 5% CO ₂ ）填充灌注系统，并通过带有蠕动泵的记录室循环含氧介质。在长时间记录过程中，必须使含氧介质在腔室中循环，以维持神经组织的健康。
  
  注 1：我们建议使用培养皿作为记录室。介质的流速将根据灌注系统的设计而变化，但它应该足以维持一致的灌注流并提供足够的氧气和营养水平来支持组织。应避免流量过大，因为这可能会影响录音。
  
  注 2：连接到电源的蠕动泵通常会产生电噪声，最好应放置在法拉第笼外部。
4. 将两个参考 Ag/AgCl 电极（一个用于刺激器，一个用于记录头台）放置在室内，并将吸移管连接到其电线。让移液器充满介质。
  
  注意：介质不应到达移液器支架，因为它会产生大量电噪声，只能通过更换移液器支架来消除。我们建议使用长吸移管和配套的电极线。
5. 使用闭合钳将其中一根神经转移到记录室。
  
  注意：切勿用镊子夹住神经。
6. 聚焦于神经并使用低放大倍率（例如，物镜 4×）评估其远端和近端的宽度。使用封闭的镊子，将神经的远端推到连接到导线和刺激器的吸管的最开口处。施加负压将神经尖端吸入移液管内。确保移液器尖端和神经之间的接触紧密。特别是，当施加负压时，神经不应在移液管内进一步移动，并且一旦负压释放，神经不应从移液管中滑出（图 6，下图）。
  
  注意：如果神经不适合移液器内部，请使用具有更宽或更窄尖端直径的吸移器（参见步骤 D2）。
  
  图 6. 在神经所在的情况下刺激和记录抽吸电极以实现稳定的记录
7. 重复上一步，继续记录移液器的神经近端。一旦两个神经末端都位于吸管内，请将记录和刺激电极放在彼此前面，避免拉伸神经（图 6），这可能会影响 CAP 记录 [9,10]。
  
  注意：保护抽吸电极中的神经对于稳定记录至关重要，特别是在长时间和药理学应用下。
8. 确保刺激器已连接并且接地电极已就位。通过用单脉冲（1-2 mA，1 ms 持续时间）刺激神经开始测试协议，以启动有髓鞘（A 纤维）和无髓鞘 C 纤维产生 CAP。一旦获得典型的 CAP（参见 E 部分），让神经稳定 15-20 分钟。这进一步改善了神经和移液器之间的接触，从而提高了 CAP 记录随时间的稳定性。在室温下记录。

神经刺激和记录
1. 将放大器设置为电流钳位模式。由于记录的信号通常不超过 10 mV，我们建议使用 5 GOhms 输入电阻并在 10–20 kHz 下对信号进行数字化。将贝塞尔滤波器信号设置为 ≥ 2 kHz，用于非髓鞘 C 纤维的记录。对于 A 纤维（传导速度更快的有髓纤维）的录音，贝塞尔滤波器应增加至 5-10 kHz。
2. 使用 0.1 至 2 mA 范围内的正极性方波电流脉冲刺激神经纤维。要激活高阈值 C 纤维，脉冲持续时间应为 1 ms。
  
  注意：该协议还激活 A 纤维，但其快速响应与刺激伪影重叠。通过使用 0.8–1.2 ms 的负极性刺激，可以专门激活 C 纤维。在这种情况下，由于 A 纤维中的阳极电导块，A 纤维驱动的 CAP 不会出现，而 C 纤维驱动的 CAP 会延迟几毫秒。
3. 对使用上述协议生成的 CAP 进行多次试验（图 7）。
  
  注意：CAP 的重现性非常好；然而，它们可能容易出现与时间和使用相关的振幅下降和传导减慢。因此，我们建议对每个感兴趣的时间点运行 5-10 次试验，试验之间的间隔至少为 10 秒。
  
  图 7. C 纤维生成的复合动作电位 (CAP) 的代表性记录（1 ms 脉冲持续时间）。红线显示八次试验的平均轨迹。记录是使用 Clampfit 软件收集的原始数据。
4. 对于 A 纤维驱动 CAP 的记录，我们建议使用 50 μs 刺激持续时间的协议（图 8）。
  
  注意：在高刺激强度下，50 μs 脉冲也可能激活很大比例的 C 纤维（图 8，右下）。
  
  图 8. 混合纤维刺激的代表性记录（顶部迹线）显示 A 型纤维响应（左下迹线）和 C 纤维刺激（右下迹线）。红线显示八次试验的平均值。记录是使用 Clampfit 软件收集的原始数据。
5. 神经及其分支之间引发 CAP 所需的刺激强度差异很大。因此，有必要确定产生 CAP 的最小刺激以及进一步增加刺激电流不会产生任何变化的刺激（即饱和刺激）。为此，在每个实验开始时，通过逐渐增加刺激强度，开始使用 1–2 mA（1 ms 脉冲持续时间）的刺激进行测试，以使用 50 μs 脉冲协议建立 A 光纤驱动 CAP 的最小电流和饱和电流（图 9，左）。CAP 幅度随刺激呈非线性增加（图 9，右）。
  
  注：由饱和刺激驱动的 A 纤维介导的 CAP 的典型振幅范围为 0.5 mV 至几毫伏。
  
  图 9. A 型纤维响应的代表性记录（左迹线），显示刺激强度依赖性（右图）
6. 使用 1 ms 脉冲协议对 C 光纤驱动的 CAP 重复相同的操作。
  
  注意：由饱和刺激驱动的 C 纤维介导的 CAP 比 A 纤维小，范围在 0.05 到 0.5 mV 之间。
7. 建立最小刺激和饱和刺激后，以下实验方案可以测试药物治疗前后饱和电流引起的 A 纤维和 C 纤维驱动的 CAP。
  
  注 1：CAP 的幅度和信号分布在不同神经甚至其分支之间或在同一大鼠的右侧或左侧神经上记录时可能会有所不同。
  
  注2：为了加快这一过程，在获得一定的实验经验后，可以排除刺激强度依赖性，通过粗略增加刺激直至达到饱和水平，凭经验找到最佳刺激强度。
8. 完成记录后，保存数据以供离线分析。
9. 实验结束时，测量抽吸电极尖端之间的距离，以评估神经纤维的传导速度。
  
  注意：C 纤维的传导速度表现出很大的变化，并且 CAP 幅度取决于神经的长度和两个记录电极尖端之间的距离 [11]。我们建议使用约 2 厘米的神经长度以获得最高质量的录音。

数据分析

CAP 的形状和幅度取决于神经长度以及抽吸电极和神经之间的接触质量（电阻）。这些参数在不同的制备过程中差异很大，因此，应针对配对分析进行标准化。此外，CAP 可能具有复杂的形状，包括多个峰和可变的轮廓；因此，确定振幅可能具有挑战性。我们建议使用曲线下的归一化面积作为统计分析的主要信号读数。在要估计的其他参数中，它可能是 A 纤维或 C 纤维的纤维传导速度，通过将抽吸电极尖端之间的距离除以刺激开始与 CAP 开始之间的延迟来计算。可以使用 Clampfit 和/或 Origin 软件进行数据分析。

协议验证

为了验证该协议，我们按照上述步骤进行神经电生理记录，旨在测试利多卡因（临床上常用的局部麻醉剂）的效果[12,13]。此外，该协议的一部分已在最近发表的研究文章中使用和验证（Krotov 等人的图 1 [14]）。

使用两个抽吸电极，我们评估了应用浓度为 2% 的利多卡因之前和之后的 A 纤维 CAP 和 C 纤维 CAP。药理作用是迅速的——我们注意到 CAP 的程度逐渐下降，在药物灌注 1-2 分钟后完全消失。效果的发生取决于灌注速率。图 10 显示了两个 A 纤维电导记录的叠加，以通过配对记录（来自药物应用之前和之后的同一神经）显示利多卡因的效果。统计总结表明在来自不同动物的几种神经制剂中观察到相同的治疗效果。这作为该方法的可靠性及其在药理学测试中的适用性的概念验证。

图 10. 使用利多卡因进行药物治疗可完全阻断 A 纤维电导。左图是应用浓度为 2% 的利多卡因之前（对照）和之后不久（灌注后 1-2 分钟）的 A 纤维的代表性记录。右图是不同实验条件下复合动作电位 (CAP) 曲线下面积的量化。n = 6 个独立测试的神经样本。

图 11 表明该方案可以准确测量 2% 利多卡因对 C 纤维功能的治疗效果。与 A 纤维电导类似，利多卡因在药物灌注后 1-2 分钟内完全阻断伤害性纤维产生的 CAP。先前的研究表明，利多卡因通过阻断钠离子通道来阻止AP沿神经的启动和传导，从而有效阻断感觉和运动纤维，从而产生麻醉作用[15,16]。

图 11. 使用利多卡因进行药物治疗可完全阻断 C 纤维电导。利多卡因浴前（对照）和浴后不久的代表性记录（2%）。不同实验条件下复合动作电位 (CAP) 峰值幅度的量化。N = 6 个经过药理学测试的神经样本。

我们的研究结果提供了功能证据，表明我们使用的方案在检查生理条件和药物治疗下的神经功能方面是有效且可靠的。该模型可在未来的研究中用于评估止痛药物和其他药物治疗对各种病理状况的有效性。

一般注意事项和故障排除

周围神经已被认为是治疗疼痛（包括慢性疼痛）的重要治疗靶点。然而，准确测量神经功能对于评估任何治疗方法的疗效至关重要。此外，神经功能的读数应该稳健、可靠且可重复，以检查药物治疗的效果。在这里，我们提供了详细的分步方案，用于测量成年大鼠的感觉、运动和伤害性纤维的神经电导。总之：

收获后，坐骨神经应始终保持在室温下氧合良好的新鲜溶液中。组织不应保存在冰上。解剖的神经可以维持几个小时。
虽然该协议实施起来相对简单，但需要实践。完成神经准备一般需要大约2小时。该协议最具挑战性和最耗时的步骤是去除神经外膜并在抽吸电极和神经之间建立紧密接触。可以省略整个神经而不是单个分支的神经外膜去除和记录，这可能是研究受损神经传导的实用工具。然而，这需要更高强度的电刺激来激活神经纤维，并且会影响任何药物干预的冲洗时间，尤其是冲洗时间。
我们建议使用培养皿而不是标准记录室与传统灌注系统相结合，原因如下：
1. 标准记录室可能太小，无法容纳长的神经制剂。
2. 使用蠕动泵进行灌注会大大增加记录的电噪声。
3. 真空驱动的流出需要大量的溶液，可能不适合药理学研究。
电生理记录可能在解剖后 12 小时内进行。然而，应考虑响应幅度随时间的变化。我们建议在解剖后 4 小时内进行记录，并实施 0.5-1.5 小时持续时间的实验方案，以避免可能的耗尽。
确保温度稳定性，因为 1–2 °C 的变化会影响光纤传导速度，从而改变 CAP 形状。
通常，在一只大鼠中，解剖左右神经，并在对照和测试条件下记录以下测量结果。
该方案在使用不同年龄的动物方面是有效的。
该协议可用于小鼠神经制剂。由于神经和分支尺寸较小，我们建议使用更高放大倍数的立体显微镜，以确保更好地可视化神经和分支。此外，在整个手术过程中格外小心地处理神经至关重要。
根据研究兴趣，该协议也适用于不同的遗传背景和治疗。

致谢

这项工作由 UCL-Welcome Trust 翻译合作伙伴试点奖 RM-TIN #178973 (OK) 资助。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

道德考虑

动物的使用符合欧盟委员会指令 (86/609/EEC) 和英国内政部（科学程序）法案 (1986)。

参考

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