材料与试剂

生物材料

金橘（F. crassifolia Swingle）果实（采自中国广西桂林市广西柑橘研究所）

试剂

肌动蛋白细胞骨架标记物 GFP-Lifeact 包含 35S::GFP 盒作为视觉报告基因 [13]
P19农杆菌
酵母提取物（OXOID，目录号：LP0021）
胰蛋白胨（OXOID，目录号：LP0042）
氯化钠（HUSHI，目录号：10019318，CAS：7647-14-5）
D-葡萄糖（HUSHI，目录号：10010518，CAS：14431-43-7）
MES（Sigma-Aldrich，目录号：M8250）
Na ₃ PO ₄（HUSHI，目录号：20040928，CAS：7601-54-9）
乙酰丁香酮（Sigma-Aldrich，目录号：D134406）
GV3101化学感受态细胞（上海维迪生物科技，目录号：AC1001）
抗生素：卡那霉素（Kan）（Genview，目录号：AK177-10G）和利福平（Rif）（Genview，目录号：AR280-1G）
抗体：针对 GFP 的多克隆小鼠抗体（Biorbyt，目录号：orb688437）作为一抗，山羊抗小鼠 HRP（Biorbyt，目录号：orb670233）作为二抗
二甲亚砜（DMSO）（MACKLIN，目录号：C13178602）
甘露醇（Solarbio，目录号：M8141）
KCl（Rawn，目录号：R051965）
CaCl ₂（MACKLIN，目录号：C832203）
BSA（MACKLIN，目录号：B928042）
纤维素酶 R10（Yakult，目录号：220908-02）
次氯酸钠（MACKLIN，目录号：S935360）

解决方案

Luria Broth (LB) 培养基（参见食谱）
渗透缓冲液（参见配方）
酶溶液（参见食谱）
抗生素（参见食谱）

食谱

LB媒体

胰蛋白胨10克，氯化钠10克，酵母抽提物5克；高压灭菌后，用 dH ₂ O补足 1 L。
渗透缓冲液

渗透介质储备溶液：

_{500 mM MES：50 mL dH 2} O中的 4.88 g MES。储存于 4 °C。

20 mM Na ₃ PO ₄：0.17 g Na ₃ PO ₄溶于 50 mL dH ₂ O。储存于 4 °C。

1 M 乙酰丁香酮（3',5'-二甲氧基-4'-羟基苯乙酮）：0.196 g 乙酰丁香酮溶于 1 mL DMSO。分成一次性等份并储存在-20°C。

50 mL 渗透缓冲液

D-葡萄糖250mg、MES储备液5mL、Na ₃ PO ₄储备液5mL、乙酰丁香酮储备液5μL；_{用 dH 2} O定容至 50 mL。
酶解液

酶解原液：

0.8 M 甘露醇原液：7.29 g 甘露醇溶于 50 mL dH ₂ O。

2 M KCl 库存：7.455 g KCl 溶于 50 mL dH ₂ O。

0.2 M MES 库存：1.952 g MES 溶于 50 mL dH ₂ O。储存于 4 °C。

1 M CaCl ₂库存：1.11 g CaCl ₂溶于 10 mL dH ₂ O。

10% BSA 库存：0.1 g BSA 溶于 1 mL dH ₂ O。

10 mL 酶溶液：0.15 g 纤维素酶 R10、0.04 g macerozyme R1、5 mL 0.8 M 甘露醇原液、100 μL 2 M KCl 原液和 1 mL 0.2 M MES (pH 5.7) 原液。将加热块或烘箱中的溶液加热至 55 °C（最高）10 分钟，以帮助酶溶解（或放入 55 °C 水中），然后冷却至室温 (RT)。接下来，添加 100 μL 1 M CaCl ₂库存、100 μL 10% BSA 库存和 dH ₂ O 至 10 mL。通过过滤（0.45 μm）灭菌。
抗生素

50 毫克/升 Rif

50毫克/升坎

实验室用品

吸头（Axygen，目录号：AXYT1000B）
带针头的 1 mL 注射器（GEMTIER，目录号：0.45X16 RW LB）
用于显微镜检查的玻璃显微镜载玻片、盖玻片（Corning，目录号：CLS294875X25、CLS285522）和 Vectashield（Vectorlabs，目录号：H-1000）
用于培养农杆菌的试管（Eppendorf，目录号：EP0030122178）和烧瓶（Corning，目录号：CLS4444250）
精细镊子和刀片（Artis Tweezer，目录号：Z742671；smartSlicer，目录号：Z740503）
记号笔（STATMARK，目录号：Z648191）
用于放置水果的托盘（PureSolv，目录号：Z681687）和 Falcon 管盖（Corning，目录号：352070）
培养皿（60毫米，可选，用于原生质体的酶消化）（Nalgene，目录号：TMO5921-0060）
移液器（Eppendorf，目录号：GN686271）
橡胶手套（Microflex，目录号：Z265179）
吸水纸（用于吸收渗出的农杆菌）
50 mL Falcon 管（Corning，目录号：352070）

设备

用于农杆菌生长的振荡培养箱（Radobio，型号：Stab M1T），温度 28 °C
离心机（Eppendorf，型号：5424）
洁净工作台（AIRTECH，型号：SW-CJ-2FD）
荧光解剖立体显微镜（奥林巴斯，型号：SZX7）
共焦显微镜（徕卡，型号：SP8）
Nanodrop 分光光度计（或同等设备）测定细菌培养物的光密度

程序

准备金橘果实以预防侵染
1. 对金橘进行柑橘类水果的转化（见注1）。开花后150-210天收获“花皮”金橘或“融安”金橘（见注2）。用2%次氯酸钠溶液消毒2分钟，并用水彻底冲洗；然后，在农杆菌注射前用吸水纸吸干。
2. 选择健康新鲜的水果进行渗透。
农杆菌制剂
1. 将携带GFP-Lifeact 和 P19 的农杆菌菌株 GV3101（参见注释 3）在含有 Kan 和 Rif 抗生素的液体 LB 培养基中于 28°C 下孵育过夜，并以 220 rpm 的转速振荡 12-16 小时，直至光密度 (OD) 超过 1.0。
2. 将农杆菌培养物在 50 mL Falcon 管中以 5,000 × g离心 5 分钟，沉淀细胞。
3. 丢弃上清液并使用渗透缓冲液重新悬浮农杆菌沉淀。
4. 将培养物以 5,000× g离心 5 分钟，弃去上清液。用渗透缓冲液悬浮培养物以达到最终 OD ₆₀₀。
5. 测量农杆菌细胞的OD _{600 ，并添加适当体积的浸润缓冲液，将}农杆菌稀释至所需的 OD（通常为 0.8 OD，见注释 4）。如果您想共表达两种或多种蛋白质，请将不同种类的农杆菌与每种农杆菌混合至所需的 OD 值。每个构建体都需要与 P19农杆菌等量混合（参见注释 5）。
农杆菌浸润
1. 剪掉注射器针头的一部分，留下大约0.1-0.3厘米长的针头。
2. 一手握住果实底部，将菌液轻轻注入外果皮0.1-0.3厘米深度。轻轻按压柱塞，小心地将细菌混合物注入水果组织中（视频 1）。注射时尽量轻柔，以免损坏果实。向每个水果注射 0.2–0.5 mL 的渗透溶液（见注 6）。混合物可能会分布到距注入点 0.8-1.3 厘米半径的区域（数据未显示）。渗透区域很容易被视为黑暗、被水浸透的区域。
3. 用吸水纸除去水果表面溢出的农杆菌。用记号笔标记注射部位以方便取样（视频 1）。
  
  视频1. 水果注射程序
4. 将渗透的水果放在 15/50 mL Falcon 管的盖子上，并在 RT（25°C）下储存大约两天。然后，用保鲜膜包裹以防止脱水（见注释7）并继续在室温下储存。
荧光信号的观察

渗透后约五天（见注 8），使用锋利的刀片（下划线区域）迅速解剖农杆菌渗透的组织，无需特别关注组织块的大小或厚度。随后，将这些组织块轻轻地放在显微镜载玻片上，并立即在配备 DP70 相机的立体显微镜下观察。注射部位附近的荧光信号清晰可见（参见注释 9）。此步骤的目的是通过荧光信号初步评估目的蛋白的表达、强度和组织定位，方便后续采样。详细的亚细胞成像可提供细胞定位信息，因此需要共聚焦显微镜。
共焦显微镜
1. 将具有强荧光信号的组织手工切成小片，尽可能薄，并直接转移到载玻片上进行共焦显微镜检查（参见注释10）。
2. （如果需要使用原生质体进行显微观察，则可选）将用于共聚焦显微镜的样品在黑暗中在灭菌的酶溶液中孵育 1-2 小时（参见注释 11），并在室温下以 40 rpm 的速度振荡，以部分消化细胞壁。这个额外步骤的主要目的是从组织中释放细胞以方便观察。长时间的消化会导致原生质体的产生，但这通常是不必要的；理想情况下，最好将此过程的任何干扰保持在最低限度（使用原生质体观察高尔基体运动如视频 2 所示）。
  
  视频 2. 柑橘类水果原生质体中的高尔基体运动
3. 将样品安装在显微镜载玻片上并用 Vectashield 密封；然后，从一侧轻轻按压盖玻片。
4. 使用带有 63 油浸透镜的 Leica SP8 激光扫描共焦显微镜进行活细胞成像。对于波长设置，GFP 在 488 nm 处激发并在 505–550 nm 处检测。

数据分析

“Huapi”或“Rongan”金橘果实（图 1A）用于 GFP-Lifeact 的瞬时过表达。注射五天后，切开注射部位，在立体显微镜下可见明显的绿色荧光（图1B）。在金橘的不同组织中都可以检测到荧光信号，包括金橘的果皮、反照率、汁囊和农杆菌溶液渗透到的隔板[12]。注射五天后对金橘组织进行的蛋白质印迹分析表明，在所有农杆菌OD 值超过 0.2 时，GFP-Lifeact 的表达都是可辨别的。此外，随着农杆菌注射浓度的增加，GFP-Lifeact 的蛋白质表达水平也有所增强（图 1C）。表现出强大荧光信号的组织被小心地切成尽可能薄的切片，并且通过手动切片和原生质体在共聚焦显微镜下清楚地观察到 GFP-Lifeact 标记的肌动蛋白细胞骨架（图 1D）。然而，游离 GFP 普遍分布在整个果实细胞中，在膜和细胞质中均可检测到游离 GFP 信号（图 2）。

图 1. 荧光蛋白 GFP-Lifeact 在金橘果实细胞中的瞬时表达。A. 注射用金橘果实“花皮”（左）和“融安”（右）的代表图。B. 表达 GFP 融合蛋白的解剖切片。C.使用不同浓度的农杆菌悬液对金橘果实中 GFP-Lifeact 和游离 GFP（来自 pMDC43 双元载体）表达进行蛋白质印迹分析；使用 1:2,000 稀释的抗 GFP 抗体探测每个泳道的 20 μg 总蛋白。D. 通过手动切片（上）和原生质体（下）定位到果实细胞中肌动蛋白细胞骨架的荧光蛋白融合的代表性图像。_{构建体 GFP-Lifeact 在 OD 600} = 0.8处渗透，并在渗透五天后拍摄图像。

图 2. 金橘果实细胞中游离 GFP 的瞬时表达

笔记

水果品种选择：水果品种的精心选择至关重要。金橘果实因其皮薄肉嫩的特点而被确定为我们短暂转化的首选材料（图1A）；另外，它们的糖含量高，酸含量低，为农杆菌提供了适宜的生长环境。也可以考虑其他柑橘品种，例如橙子、柚子和柑橘。值得注意的是，金橘表现出持续产生的强大信号和高转换效率（数据未显示）。
果实阶段的确定：金橘果实的成熟绿色阶段（开花后约150-210天）已被证明是瞬时转化的最佳阶段，因为其质地坚硬，代谢活性增强，果皮更细。此外，收获后的金橘果实仍然适合进行实验，这强调了选择新鲜柑橘类水果用于后续程序中注射的重要性。建议避免在成熟末期采摘果实，因为注射农杆菌后果实容易腐烂。
菌株选择：选择多种根癌农杆菌菌株（例如EHA105或GV3101）进行测试。研究结果表明，GV3101 介导的转化产生了最高的蛋白质产量。
光密度值：获得每个构建体的最佳农杆菌密度（OD ₆₀₀）至关重要，并且这一要求因基因而异。农杆菌的OD ₆₀₀也会对蛋白质表达水平产生影响，因此需要在实际研究开始之前优化新构建体的理想 OD _{600 。}农杆菌的OD ₆₀₀浓度低于0.1通常会导致表达弱，而OD ₆₀₀超过1.0则容易引起果实黄化和腐烂。如果减轻潜在的过度表达伪影是主要问题，建议使用仍能产生足够信号的最低 OD。否则，可以采用 0.5-0.8 范围内的OD _{600来实现最大表达。}
P19：通过利用p19构建体可以增强表达，有效避免基因沉默。
注射剂量：每个水果的注射量必须保持在 0.2–0.5 mL 范围内，因为过多的渗透缓冲液可能会导致不可预见的腐烂。
套袋：注果两天后，宜用保鲜膜单独套住果实，以增强保水性并保证透气性；套袋不宜过早，否则会因湿度大而引起果实腐烂。
表达时间：不同的蛋白质可能表现出不同的表达时间线。一般来说，渗透后 4-5 天即可检测到蛋白质表达。如果果实保存条件有利，甚至可以在渗透后一个月内检测到蛋白质表达。蛋白质表达的持久性和丰度通常取决于质粒本身和果实的活力。
用于表达的果实组织：在金橘的各种组织中都可以观察到荧光信号，包括金橘、反照率和汁囊，农杆菌溶液可以渗透到这些组织中。表达的功效取决于不同组织对农杆菌的吸收，良好的吸收与表达强度的增强相关。通常，反照率中荧光蛋白的表达超过其他组织。
在水果组织切片过程中，必须尽量减少施加在样品上的外部压力。使用锋利的剃须刀刀片同样重要，因为它可以减轻机械损伤并降低骨折风险。
酶解：此补充步骤的主要目的是从组织中释放原生质体以方便观察。虽然长时间的消化可以产生原生质体，但这通常是不必要的，理想的方法是尽量减少任何破坏。

协议验证

该协议已在以下已发表的文章中使用和验证：

龚，JL等。（2021）。照亮细胞：柑橘的瞬时转化，以研究与水果品质相关的基因功能和细胞器活动。园艺研究 8(1)：e1038/s41438–021–00611–1，DOI：10.1038/s41438-021-00611-1。
龚，JL等。（2021）。红光诱导的金橘果实着色归因于 FcrNAC22 调节的类胡萝卜素代谢增加。实验植物学杂志 72：6274–6290，DOI：10.1093/jxb/erab283。

致谢

感谢浙江省自然科学基金项目（LQ23C150004和LR23C150001）、国家自然科学基金项目（32102318）和浙江省农业新品种选育重点项目（2021C02066- 1）。该协议是根据我们之前发表的作品进行修改的[12]。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

Brandizzi, F.、Hawes, C.、Boevink, P. 和 Roberts, A. (2001)。GFP 启发了植物细胞内膜动力学的研究。植物生物系统公司。135（1）：3-12。https://doi.org/10.1080/11263500112331350580
朱成、郑X、黄Y、叶J、陈鹏、张成、赵F、谢Z、张S、王娜、等人。（2019）。早期开花迷你柑橘 ( Fortunellahindsii ) 的基因组测序和 CRISPR/Cas9 基因编辑。植物生物技术。J.17（11）：2199-2210。https://doi.org/10.1111/pbi.13132
Sparkes, IA、Runions, J.、Kearns, A. 和 Hawes, C. (2006)。荧光融合蛋白在烟草植物中快速、瞬时表达并产生稳定转化的植物。纳特。协议。1(4)：2019–2025。https://doi.org/10.1038/nprot.2006.286
Tsuda, K.、Qi, Y.、Nguyen, LV、Bethke, G.、Tsuda, Y.、Glazebrook, J. 和 Katagiri, F. (2011)。一种有效的农杆菌介导的拟南芥瞬时转化。植物杂志69(4)：713–719。https://doi.org/10.1111/j.1365-313x.2011.04819.x
Orzaez, D.、Mirabel, S.、Wieland, WH 和 Granell, A. (2006)。番茄果实的农用注射剂。直接对水果中的转基因进行快速功能分析的工具。植物生理学。140（1）：3-11。https://doi.org/10.1104/pp.105.068221
赵Y.、毛W.、陈Y.、王W.、戴Z.、窦Z.、张K.、魏L.、李T.、曾B.、等人。（2019）。草莓果实基因功能分析瞬时表达测定的优化和标准化。园艺。资源。6(1)：e1038/s41438–019–0135–5。https://doi.org/10.1038/s41438-019-0135-5
安JP、王XF、李YY、宋LQ、赵LL、尤CX和郝YJ（2018）。EIN3-LIKE1、MYB1 和乙烯反应因子 3 在协同调节乙烯生物合成和花青素积累的调节环中发挥作用。植物生理学。178（2）：808-823。https://doi.org/10.1104/pp.18.00068
李涛、蒋志、张丽、谭丹、魏勇、袁慧、李涛、王安 (2016)。苹果 ( Malus Domestica ) MdERF2 通过抑制MdACS1转录对果实成熟过程中的乙烯生物合成产生负面影响。植物杂志88(5)：735–748。https://doi.org/10.1111/tpj.13289
沉S.l.、尹X.r.、张B.、谢X.l.、蒋Q.、Grierson,D.和陈K.s.。（2016）。CitAP2.10萜烯合酶CsTPS1的激活与“Newhall”橙中 (+)-朱栾倍半萜的合成有关。J.Exp。机器人。67（14）：4105-4115。https://doi.org/10.1093/jxb/erw189
Yin, X., Xie, X., Xia, X., Yu, J., Ferguson, IB, Giovannoni, JJ 和 Chen, K. (2016)。乙烯响应因子参与柑橘类水果脱节过程中叶绿素的降解。植物杂志86(5): 403–412。https://doi.org/10.1111/tpj.13178
朱明、林建、叶建、王荣、杨成、龚建、刘勇、邓成、刘平、陈成、等人。（2018）。对柑橘类水果果皮体的全面蛋白质组分析揭示了对果皮体生物发生和功能的见解。园艺。资源。5(1)：e1038/s41438–017–0014–x。https://doi.org/10.1038/s41438-017-0014-x
龚建、田志、曲X、孟Q、管Y、刘鹏、陈C、邓X、郭W、程Y、等人。（2021）。照亮细胞：柑橘的瞬时转化，以研究与水果品质相关的基因功能和细胞器活动。园艺。资源。8(1)：e1038/s41438–021–00611–1。https://doi.org/10.1038/s41438-021-00611-1
Smertenko, AP、Deeks, MJ 和 Hussey, PJ (2010)。植物细胞中肌动蛋白重组的策略。J.细胞科学。123（17）：3019-3028。https://doi.org/10.1242/jcs.071126