材料与试剂

15 mL 离心管（Corning，目录号：430791）
50 mL 离心管（Corning，目录号：430829）
500 mL三角培养瓶（Corning，目录号：431145）
1.5 mL 微管（Axygen，目录号：MCT-150-CS）
无菌注射器过滤器（Millipore，目录号：SLGVR33RB）
500 mL 离心瓶（Nalgene，目录号：3120-0500）
50 mL圆底离心管（Biosharp，目录号：BS-500-MC）
13.2 mL离心管（Beckman Coulter，目录号：344059）
大肠杆菌菌株 EPI300（Lucigen，目录号：EC300110）
之前使用过的质粒 pCNM3、pBR60 和 pBBRN Pnf N50-TkTcsT [4,7]（图 1）

图 1. Photorhabdus毒力盒 (PVC) 基因座示意图以及用于 PVC 复合物和货物蛋白生产的质粒图谱。A. 参与蛋白质复合物生产的 16 个 PVC 结构基因（注释为Pvc 1– Pvc 16，以蓝色显示）在P. asymbiotica基因组中连续编码。B-D。质粒 pCNM3 (B)、pBR60 (C) 和 pBBRN Pnf N50-TkTcsT (D) 由我们实验室构建，并使用 SnapGene 生成图谱。pCNM3 是通过将完整的 PVC 操纵子连接到 pRK404 载体中构建的，以便在其自己的启动子下进行组成型表达 [8]。pBR60 是通过将含有 PAU_RS16560（LysR 调节基因，以蓝色显示）的 DNA 片段连接到 pBR322 质粒（BamHI-SalI 插入）中，以在其自身启动子下组成型表达调节基因而创建的。pBBRN Pnf N50-TkTcsT 是用于货物生产的质粒。该质粒是通过将来自Trichosanthes kirilowii的有毒 TkTcsT 蛋白（以蓝色显示）的开放阅读框插入广泛宿主范围载体 pBBR1MCS5 中而创建的，并在该载体的 N 末端融合了 PVC 信号肽序列（以红色显示）。 TkTcsT 蛋白。这允许在大肠杆菌中产生信号肽融合蛋白。
LB肉汤，粉末（Solarbio，目录号：L1010）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Gibco，目录号：C10010500BT）
盐酸四环素（Solarbio，目录号：T8180）
氨苄西林钠盐（Solarbio，目录号：A8180）
硫酸庆大霉素（Solarbio，目录号：G8170）
无水乙醇（北京化工厂，目录号：C320080）
TBS 片剂（VWR，目录号：K859-100TABS）
Triton X-100 解决方案（Sigma，目录号：X-100）
蛋白酶抑制剂混合物（MCE，目录号：HY-K0010）
溶菌酶（Sigma，目录号：L6876）
DNase I（MCE，目录号：HY-108882）
氯化钠（Solarbio，目录号：S8210）
六水氯化镁（Solarbio，目录号：M8161）
溶液内毒素erasol（TianDZ，目录号：60607-25）

解决方案

LB 肉汤培养基（参见食谱）
10 mg/mL 四环素溶液（参见配方）
100 mg/mL 氨苄青霉素溶液（参见配方）
50 mg/mL 庆大霉素溶液（参见配方）
5 mg/mL 氯化钠（参见配方）
2 M MgCl ₂（参见配方）
20 mg/mL 溶菌酶（参见配方）
5 mg/mL DNase I（参见配方）
P 缓冲液（参见食谱）

食谱

LB肉汤培养基

将 25 克 LB 肉汤粉添加到 1,000 毫升蒸馏水中。使用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌15分钟。

10 mg/mL 四环素溶液

将 0.5 g 四环素 HCl 添加到 50 mL 无水乙醇中。使用 0.22 µm 孔径亲水性 PVDF 膜过滤除菌。

100 mg/mL 氨苄青霉素溶液

将 1 g 氨苄西林添加到 10 mL 蒸馏水中。使用 0.22 µm 孔径亲水性 PVDF 膜过滤除菌。

50 mg/mL 庆大霉素溶液

将 1 g 硫酸庆大霉素添加到 20 mL 蒸馏水中。使用 0.22 µm 孔径亲水性 PVDF 膜过滤除菌。

5毫克/毫升氯化钠

将 1 g 氯化钠溶解在 200 mL 蒸馏水中。使用 0.22 µm 孔径亲水性 PVDF 膜过滤除菌。

2M MgCl ₂ ·6H ₂ O

将 406 g 六水氯化镁溶解在 800 mL 蒸馏水中，并调节体积至 1 L。用 0.22 µm 孔径亲水性 PVDF 膜过滤灭菌。

20 毫克/毫升溶菌酶

将 1 g 溶菌酶溶解在 50 mL 蒸馏水中。使用 0.22 µm 孔径亲水性 PVDF 膜过滤除菌。

5 毫克/毫升 DNA 酶 I

将一瓶 DNase I (100 mg) 溶解在 20 mL 的 NaCl 溶液 (5 mg/mL) 中。使用 0.22 µm 孔径亲水性 PVDF 膜过滤除菌。

P缓冲液
1. 取 50 mL 蒸馏水至 50 mL 离心管中，加入一片 TBS 片剂。待 TBS 片完全溶解后，将溶液均分至两个 50 mL 离心管中。
2. 在每个管中添加 2.5 mL 的 10% Triton X-100 溶液、500 μL 20 mg/mL 溶菌酶、500 μL 5 mg/mL DNase I、125 μL 2 M MgCl ₂和 500 μL 蛋白酶抑制剂混合物。添加蒸馏水至 50 mL。
笔记：
1. P 缓冲液应新鲜配制。
2. TBS 片剂可能会刺激皮肤和眼睛；避免吸入灰尘、烟雾、气体、薄雾、蒸气或喷雾。
3. Triton X-100 溶液可能会导致严重的眼睛损伤；使用时佩戴防护装置。
4. P 缓冲液中溶菌酶和 DNase I 的终浓度分别为 200 µg/mL 和 50 µg/mL。Triton X-100 和 MgCl ₂浓度分别为 50 mg/mL、0.5% 和 5 mM。

设备

Innova44 培养摇床系列（NBS，型号：SHA1104）
生物安全柜（上海力神科学设备有限公司，型号：Hfsafe 1200LC）
Milli-Q（Millipore，目录号：IX 70XX）
高压蒸汽灭菌锅（YAMATO，型号：SM830）
高速冷冻离心机（Eppendorf，型号：5424 R）
超速离心机（Beckman，型号：Optima L-100 XP）
-80℃超低温冷冻柜（海尔，型号：DW-86L728J）
恒温水浴锅（GFL，型号：GFL1002）
高速冷冻离心机（日立，型号：CR22G）
制冰机（松下，型号：SIM-F140BDL）
NanoDrop 1000 分光光度计

程序

空载和满载 PVC 复合体的生产

空 PVC 复合物在大肠杆菌中的异源表达需要两个质粒：pCNM3 和 pBR60。质粒 pCNM3 携带基于四环素抗性广泛宿主范围载体 pRK404 的 PVC 复合物组装所需的 16 个结构基因（图 1A）。质粒 pBR60 含有 LysR 调节基因 (PAU_RS16560) 片段，该片段对于 PVC 复合物的成熟至关重要（图 1C）。pBR60 的主干载体是氨苄青霉素抗性 pBR322（pBR322 的原始四环素抗性基因因基因插入而被破坏）。两个基因都在它们自己的启动子下组成型表达。共表达这两个质粒的大肠杆菌菌株EPI300可用于相应地产生空PVC复合物（大肠杆菌中的两个质粒用于空PVC）。

对于要生产的负载货物的 PVC 复合物，可以使用基于 pBBRN（广泛宿主范围载体 pBBR1MCS5 的衍生物，其引入 NdeI 位点以在 LacZα 基因开头生成起始密码子）的具有庆大霉素抗性的第三种质粒。在此协议中，在 N 末端产生有毒 TkTcsT 和 PVC 信号肽融合蛋白的 DNA 片段插入 pBBRN 的多个克隆位点，其表达由 lac启动子控制（图 1D）。类似的操作可用于使用上述空 PVC 生产大肠杆菌菌株与第三个货物表达质粒（大肠杆菌中用于装载货物的 PVC 的三个质粒）共转化来生成装载货物的 PVC 复合物。

细菌采集
1. 根据配方 1 制备 LB 肉汤培养基。如果需要，可在 LB 肉汤培养基中添加抗生素。配制 10 mg/mL 四环素溶液（配方 2），使用时稀释 100 倍，使终浓度为 10 μg/mL。配制 100 mg/mL 氨苄青霉素溶液（配方 3），使用时稀释 100 倍，使终浓度达到 100 μg/mL。配制 50 mg/mL 庆大霉素溶液（配方 4），使用时稀释 500 倍，使终浓度为 10 μg/mL。
2. 将补充有 100 μg/mL 氨苄青霉素和 10 μg/mL 四环素（用于负载 PVC 生产的额外 10 μg/mL 庆大霉素）的 3–4 mL LB 肉汤培养基加载到 15 mL 离心管中。在整个步骤 B 中使用相同类型和浓度的抗生素。
3. 挑取LB固体培养基上含有相应质粒的大肠杆菌 EPI300 染色剂的一个单菌落，或在含有抗生素的 LB 肉汤培养基中的冷冻细菌（在 -80 °C 超低温冰箱中），并在摇床上以 220 rpm 和 37 ℃ 孵育过夜。 °C。
4. 将 2 mL 孵育过夜的细菌（来自步骤 B2 和 B3）接种到 200 mL 含有抗生素的 LB 肉汤培养基中，并在摇床中以 220 rpm 和 30 °C 孵育 24 小时。
5. 将 200 mL 细菌培养物装入 500 mL 离心瓶中，并使用高速冷冻离心机在 4°C 下以 12,000× g离心 10 分钟。
6. 弃去上清液并重悬于 30 mL 无菌 PBS 中。
7. 将悬浮液转移至 50 mL 离心管中，并在 4 °C 下以 3,500× g离心30 分钟。
8. 弃去上清液，将细菌沉淀保存在-80°C超低温冰箱中过夜直至使用。

细胞破裂
1. 准备 P 缓冲液（参见配方）。
2. 从-80℃超低温冰箱中取出冷冻菌，每管加入10mL P缓冲液，重悬，37℃水浴孵育30min。

细胞碎片清除
1. 将裂解物转移至圆底离心管中，并使用高速冷冻离心机在 4°C 下以27,000× g旋转 10 分钟。

蛋白质提取
1. 将上清液转移至超速离心管中，用 4°C 预冷的 P 缓冲液平衡，并使用超速离心机在 4°C 下以150,000–250,000× g离心 1 小时。
2. 弃去上清液，并用 1 mL 4°C 预冷的无菌 PBS 重新悬浮沉淀物。将悬浮液转移至 1.5 mL 微管中，并使用高速冷冻离心机在 4°C 下以18,400× g离心 10 分钟。
3. 将上清液转移至超速离心管中，用 4°C 预冷的 PBS 平衡，并使用超速离心机在 4°C 下以 150,000–250,000× g离心1 小时。
4. 弃去上清液，并用 4°C 预冷的 200 μL 无菌 PBS 重新悬浮沉淀物。将悬浮液转移至 1.5 mL 微管中，并使用高速冷冻离心机在 4°C 下以18,400× g离心 10 分钟。
5. 收集上清液并使用 NanoDrop 1000 分光光度计在 280 nm 处测量 PVC 浓度。将含有 PVC 颗粒的上清液储存在 4°C 下（图 2）。
  
  图 2. Photorhabdus毒力盒 (PVC) 纯化过程中主要步骤的蛋白质样品的 SDS-PAGE 分析。泳道 1：步骤 D1 的全细胞裂解物。泳道 2：来自步骤 E1 的上清液。泳道 3：来自步骤 E3 的上清液。泳道 4：来自步骤 E4 的最终纯化 PVC，用于负染色分析。M：标记。

去除内毒素（可选）
1. 预冷内毒素erasol 试剂和蛋白质样品的溶液。
2. 将50 μL溶液内毒素erasol试剂加入500 μL蛋白质样品中，混匀，冰浴10 min，然后在65℃水浴中孵育20 min。
3. 使用高速冷冻离心机以 18,400× g离心 10 分钟。收集上清液。

协议验证

该协议已在以下研究文章中使用和验证：

江等人。[7]。N 端信号肽有助于将 PVC 复合物工程化为有效的蛋白质递送系统。科学进展（图 1，D 组；图 2，B 组；图 3）。
王等人。[6]。光杆菌毒力盒作为新兴病原体光杆菌非共生菌的致病因子的表征。科学中国生命科学（图1，B图；图2，F图）。
江等人。[8]。细胞外收缩注射系统的冷冻电镜结构和组装。细胞（图1；图6，面板D；图7，面板A；图S1，面板C-D）。

一般注意事项和故障排除

步骤B4和B5中过夜培养的细菌的OD ₆₀₀应高于0.6。如果细菌的OD ₆₀₀低于0.6，一般表明培养过程中出现了一些问题，或者货物蛋白可能对细菌有毒。
步骤B3中，在30℃下孵育，因为30℃下的蛋白质表达和组装比37℃下更好。
步骤B7中，收集到的细菌沉淀可以在-80℃保存过夜，以促进细菌细胞完全破裂，这有助于PVC复合物的更大产量。
在步骤E1和E3中，150,000× g至250,000× g范围内的任何离心力都可以有效地沉淀颗粒。例如，以更高的速度纺丝会产生更多数量的 PVC 颗粒，但会产生许多不需要的未成熟组分。
在步骤E5中，使用NanoDrop 1000分光光度计测量PVC蛋白质样品的浓度。NanoDrop 1000分光光度计是一种方便的蛋白质和核酸浓度测定设备；低至 2 µL 的样品均可准确定量。此处，通过测量 280 nm 处的紫外吸收来估算蛋白质样品的浓度。该方法虽然不是严格定量的，但快速、方便，适合本方案中蛋白质浓度的测定。
在步骤E5中，根据该方案提取的蛋白质的浓度通常应在1–5 mg/mL的范围内。如果浓度高于 10 mg/mL，建议重复步骤 E4–E5 以排除任何剩余的细菌碎片或其他蛋白质成分。
步骤F是可选的；然而，如果要在动物身上测试蛋白质样品，这是必不可少的步骤。

数据分析

负染色是评估溶液中PVC样品质量的最佳方法[8]。将 1-5 μL PVC 样品的等分试样（取决于蛋白质浓度）涂在辉光放电多孔碳铜网格（300 目，中京科院，北京）上，清洗并用 2% 乙酸双氧铀染色。将负染色网格在室温下干燥并使用电子显微镜检查。PVC 复合物（如果存在）呈子弹形（图 3）。

图 3. 从大肠杆菌中纯化的光杆菌毒力盒 (PVC) 颗粒的代表性负染色电子显微镜图。通过负染色电子显微镜观察，空 PVC (A) 和负载 TkTcsT 货物的 PVC 复合物 (B) 具有相似的 T4 尾状形态。显示了 PVC 的成熟（黑色箭头）和未成熟（白色箭头）成分。

致谢

感谢高宁教授和北京大学电镜实验室在负染色方面的帮助。我们也感谢齐进和冯江实验室的所有成员提供的有益建议。该工作得到了国家重点研发计划（2022YFC2303200）、国家自然科学基金（32070081）、中国医学科学院医学科学创新基金（2021-I2M-1-037）和专项基金的资助。北京协和医学院中央高校科研基金（3332023055）。原始协议是在之前的作品中开发和使用的[6-8]。

利益争夺

没有宣布任何竞争利益。

参考

泰勒 (NMI)、范拉吉 (MJ) 和莱曼 (PG) (2018)。噬菌体收缩注射系统及相关系统。 摩尔微生物学108(1)：6-15。
Wang, J.、Brodmann, M. 和 Basler, M. (2019)。VI 型细菌分泌系统的组装和亚细胞定位。 微生物学年鉴73：621-638。
Desfosses, A.、Venugopal, H.、Joshi, T.、Felix, J.、Jessop, M.、Jeong, H.、Hyun, J.、Heymann, JB、Hurst, MRH、Gutsche, I. 等。（2019）。整个收缩注射系统在伸展和收缩状态下的原子结构。 自然微生物学4(11)：1885-1894。
Rocchi, I.、Ericson, CF、Malter, KE、Zargar, S.、Eisenstein, F.、Pilhofer, M.、Beyhan, S. 和 Shikuma, NJ (2019)。细菌噬菌体尾状结构通过注射核酸酶效应物杀死真核细胞。 细胞代表28(2)：295-301 e294。
Costa, SC、Girard, PA、Brehelin, M. 和 Zumbihl, R. (2009)。新兴的人类病原体非共生光杆菌是一种兼性细胞内细菌，可诱导巨噬细胞样细胞凋亡。 感染免疫77(3)：1022-1030。
王X.、程J.、沉J.、刘L.、李娜、高娜、江芳和金Q. (2022)。光杆菌毒力盒作为新兴病原体光杆菌非共生菌的致病因子的表征。 科学中国生命科学65(3): 618-630。
江凤、沉静、程静、王晓、杨静、李娜、高娜和金Q. (2022)。N 端信号肽有助于将 PVC 复合物工程化为有效的蛋白质递送系统。 科学进展8(17)：eabm2343。
江凤、李娜、王X、程J.、黄Y.、杨Y.、杨J.、蔡B.、王YP、金Q.、高，N.（2019）。细胞外收缩注射系统的冷冻电镜结构和组装。单元177(2)：370-383 e315。