材料与试剂

生物材料

hiPSC AG08C5 细胞系（欧洲 hPSCreg 为 PGNMi001-A）（https://hpscreg.eu/cell-line/PGNMi001-A）[12]
健康对照人类 iPSC 系，女性，SCTi003-A（STEMCELL，目录号：200-0511）

试剂

维持培养基 mTeSR ^TM Plus 试剂盒，cGMP（STEMCELL，目录号：100-0276）
Vitronectin XF ^TM（STEMCELL，目录号：100-0763）
TrypLE ^TM（Thermo Fisher，目录号：12604013）
Y-27632（二盐酸盐），RHO/ROCK途径抑制剂（STEMCELL，目录号：72302）
胎牛血清（FBS）（Sigma Aldrich，目录号：341506）
Gibco Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (DPBS)（Thermo Scientific，目录号：14190）
肥皂（例如，Enzypin，Distrimed，目录号：201261）
乙醇 70%（例如，Fisher Scientific，目录号：16320638）

解决方案

hiPSC 球体诱导培养基（参见配方）
TrypLE ^TM抑制培养基（参见配方）

食谱

hiPSC 球体诱导培养基

作品最终浓度体积

mTeSR ^TM Plus - 50毫升

Y-27632 (10 mM) 10μM 50微升
TrypLE ^TM抑制培养基

作品最终浓度体积

mTeSR ^TM Plus - 9.8毫升

胎牛血清 2% 200微升

每次实验前应立即配制溶液，并根据具体要求调整体积。在与细胞接触之前，这些溶液必须预热至 37°C。可以根据您的培养方案向培养基中添加抗生素。

实验室用品

P1,000 移液器（例如 Pipetman 100–1,000 µL，Gilson，目录号：F144059M）。
吸头 1,000 µL（例如，AmpliPur Expert 吸头 100–1,000 µL，Gilson，目录号：F174401）
丙烯酸树脂（Acrylate-like）（例如，Stratasys，型号：Vero Clear ^TM）
硅胶（例如 Elkem Silicones，型号：BLUESILTM RTV 3503）
一次性高压灭菌袋（Sigma-Aldrich，目录号：Z692212）
6 孔板，圆形（Thermo Fischer，目录号：140675）
Falcon 15 mL 离心管，PET，锥形底部，带塞子密封盖（Sigma-Aldrich，目录号：CLS430055）
Falcon 50 mL 离心管，PET，锥形底部，带塞子密封盖（Sigma-Aldrich，目录号：CLS4558）
培养皿 B60（例如，Corning，目录号：BP53-03）
镊子（例如，EMS 96，Sigma Aldrich，目录号：932922）
一次性血细胞计数器（例如，Millicell® ^， Sigma-Aldrich，目录号：MDH-2N1-50PK）
正排量移液器（例如，Microman 100–1,000 µL，Gilson，目录号：FD10006）
毛细管活塞（例如，CP1,000ST 2 × 91 TIPACK，Gilson，目录号：F148180）
微管 Eppendorf 2 mL（Dutscher，目录号：033297）

设备

喷墨 3D 打印机（例如 Stratasys，型号：Objects 30 pro）
高压灭菌器（例如，Sigma-Aldrich，型号：BioCLAVE ^TM迷你数字高压灭菌器，目录号：Z680109）
离心机（例如，Sigma Aldrich，目录号：C166500）
CO ₂培养箱（例如，MEMMERT，目录号：I227880）
真空干燥箱（例如Goldbrunn，型号：450）
液体抽吸系统（例如，BVC control，Vaccubrand，目录号：20727200）
6 孔板转子（例如，Eppendorf A-4-81 转子，Marshall Scientific，目录号：EP-WPB）

软件和数据集

MATLAB（2022b，2022 年 9 月 20 日）
Prism v9.0（GraphPad，2020 年 10 月 27 日）

程序

该程序的目的是生成生物相容性和可高压灭菌的装置，简化球体的诱导。如图 1 所示，实验者只需使用提供的 3D 文件 (STL) 3D 打印提供的模具即可创建无限数量的设备。

图 1. 硅胶盘制造工艺。比例尺 = 1 毫米。SEM：TM4000（Itachi，日本）。

模具3D打印
1. 使用喷墨 3D 打印机从“EBs-mold-base.STL”、“EBs-mold-intern.STL”和“EBs-mold-extern.STL”STL 文件生产丙烯酸树脂模具（可在https: //github.com/Klux1rst/Spheroids-Inducer-Mold-Bioprotocol/tree/main）。建议使用最能提高分辨率的默认参数来获得高质量的模具（参见一般注释 1）。
2. 对 3D 打印模具进行打印后清洁（通常在室温下在开放容器中浸泡在 50 mL 70% EtOH 中 12 小时，但请参阅材料说明，因为打印后过程取决于树脂）。使用前让丙烯酸酯模具在室温下干燥 30 分钟。
硅胶盘生产

注意：图 S1 中说明了以下步骤。
1. 处理基片（EBs-mold-base）。
2. 将中央部分卡入基础部分（EBs-mold-intern）。
3. 要完成组装，请将外部零件卡入基础件 ( EBs-mold-extern )。
4. 确认组装正确，确保所有部件均牢固安装。将模具放入 B60 培养皿的上盖中。
5. 从中心件和外部件之间的外围凹槽开始沉积 1 mL 的硅胶。建议使用正排量移液器以确保准确的体积。
6. 第二次在模具中心再沉积 1 mL。
  
  注意：如果只有经典移液器可用，则可以直接沉积约 2 mL 的硅胶。使用天平以确保准确度（大约 2 克）。
7. 将组件放入密封室中并形成真空 5 分钟。此步骤对于消除两种有机硅相（如果是 RTV 硅）混合时产生的气泡并确保有机硅渗透到外围凹槽中至关重要。
8. 轻轻放置B60下部，使模具表面的硅胶光滑。从一角开始，逐渐堆放，避免滞留空气。可以在顶部放置重物以保持压力。
9. 将组件在 37–55 °C 下孵育 20 分钟以催化交联。或者，在室温下孵育 1.5 小时（取决于所使用的硅胶）。
10. 硅胶完全交联后取出组件。
11. 拆下B60的上部（无需用力）。
12. 在手动握住模具的同时，轻轻地取下（从一定角度使用杠杆）培养皿的下部。
13. 使用抹刀撬动位于模具外部 ( EBs-mold-extern ) 底部的凹口。逐渐从一个凹口到另一个凹口进行操作，直到与下部（EBs-模座）完全分离。
14. 模具的底座（EBs-mold-base ）被完全移除。
15. 轻轻施加压力，手动移除外部部件 ( EBs-mold-extern )。
16. 模具的外部部分（EBs-mold-extern ）被完全移除。
17. 最后，用手指轻轻地将硅胶盘从内部部件（EBs-mold-intern ）上取下。
18. 模具的内部部分（EBs-mold-intern ）被完全移除。
19. 成型过程完成。经过肥皂清洗步骤（可选：使用软毛牙刷）后，所得磁盘可进行高压灭菌（液体或干燥）并使用。
hiPSCs聚集

注意：在 1 级或 2 级实验室的专用层流气流柜中进行培养操作。使用高压灭菌镊子以确保无菌。使用后，将镊子存放在装有 70% EtOH 的 15 mL Falcon 中，直至下次高压灭菌。
1. 使用镊子将硅片放在 6 孔板的底部。
2. 准备 hiPSC 球体诱导培养基（参见配方 1）和 TrypLE ^TM抑制培养基（参见配方 2）。
3. ^{在涂有 Vitronectin XF TM 的}平板上，在含有mTeSR ^TM Plus 的培养基中培养 hiPSC ，直至细胞达到 80%–90% 的汇合（图 2A）。
  
  图 2. 人类诱导多能干细胞 (hiPSC) 球体诱导方案的不同步骤。A. 胰蛋白酶消化前的 hIPSC 集落。B. 铺板和离心后孔中细胞的外观。C. 24 小时聚集后球体的外观。比例尺 = 200 µm。
4. 从细胞中吸出培养基并用 2.5 mL 室温 DPBS 洗涤。对于抽吸，请使用带有移液器和适当管道的真空泵。
5. 添加 2 mL TrypLE ^TM并在 37 °C 下孵育 5 分钟。
6. 细胞脱离后，加入 2.5 mL TrypLE ^TM抑制培养基。将总体积转移至 15 mL Falcon 管中，并在室温下以200× g离心 4 分钟。
7. 将细胞沉淀重新悬浮在 1 mL 的 hiPSC 球体诱导培养基中，并对细胞进行计数（使用血细胞计数器）。
8. 将所需的细胞数量转移至 2 mL Eppendorf 管中。轻轻混合。
  
  注意：所得 hiPSC 球体的直径与沉积在盘上的细胞数量直接相关，遵循线性方程 1（示例：对于 1 × 10 ^{6 个}细胞，D = 79.4 + 42.6 = 122 μm）。
  
  方程 1：球体直径 (D) 作为沉积在盘上的 hIPSC 数量的函数。
  
  D = 79.4x + 42.6
  
  ^{其中 D 单位为 µm，x 单位为 10 5}的每个圆盘的细胞数
9. 通过以圆周运动方式沉积液滴，将细胞溶液均匀分布在模制圆盘上。为了确保均匀性，将细胞溶液沉积在整个盘上而不是局部，以防止获得的球体的强烈尺寸变化。
10. 在 37 °C、5% CO ₂培养箱中等待 1 小时进行沉淀。此步骤对于确保良好的细胞分布以及球体的均匀性至关重要（图 2B）。
11. 20°C 下 500× g离心2 分钟，以增强细胞聚集。
12. 将 6 孔板放入 37°C、5% CO ₂培养箱中 24 小时（图 2C）。
球体提取

注意：在 1 级或 2 级实验室的专用层流气流柜中进行培养操作。使用高压灭菌镊子以确保无菌。使用后，将镊子存放在装有 70% EtOH 的 15 mL Falcon 中，直至下次高压灭菌。
1. 24 小时后，使用 P1000 移液器和 1 mL 在 37°C 下加热的 DPBS 进行移液。通过抽吸混合，将球体从微孔中移出。
2. 使用细镊子轻轻翻转硅胶盘。
3. 200× g离心4 分钟，从微孔中提取球体。
4. 将每口井的含有球体的培养基收集在 50 mL 收集管中。
5. 用 5 mL 的 DPBS 冲洗每个圆盘，以回收井底部任何剩余的球体，并将此体积添加到收集管中。
6. 用 2 mL 的 DPBS 冲洗每个硅胶盘。将圆盘浸入 EtOH 70% 中 30 分钟。用水和肥皂清洗，用去离子水冲洗，并在高压灭菌袋中高压灭菌以用于下一个实验。
7. 检查球体完整性（参见图 3A 和图 3B），并在 20°C 下以 50× g轻轻离心收集管4 分钟，以获得含有球体的颗粒。
  
  图 3.每个圆盘沉积 1 × 10 ^{6个细胞 24 小时后，两种不同的人类诱导多能干细胞 (hiPSC) 细胞系的球体。}A.细胞系AG08C5。B.细胞系SCTi003-A。比例尺 = 200 µm。
8. 使用 hiPSC 球体继续进行实验。

数据分析

为了证明该方法的稳健性，按照上述协议将不同数量的 hiPSC 应用到光盘上（图 4）。

图 4. 人诱导多能干细胞 (hIPSC) 球体直径取决于沉积的细胞数量。A.1×10 ⁵。B.2.5×10 ⁵。C.5×10 ⁵。D.7.5×10 ⁵。E.1×10 ⁶。F.1.5×10 ⁶。比例尺 = 100 µm。

使用 MATLAB 中开发的自定义图像分析算法，利用与球体直径测量相关的 ImFindCircle 函数，对获得的结果进行分析 ( https://www.mathworks.com/help/images/ref/imfindcircles.html ) 。尽管由于偶尔检测到球体逃逸而并不完美，但分析的大量事件有助于减轻数据可变性。该分析揭示了沉积在圆盘上的细胞数量（每个圆盘包含大约 20,00 个孔）与所得球体直径之间的直接关系。基于每个细胞数量的球体多分散性分析描述于

图 5. 人诱导多能干细胞 (hIPSC) 球体直径分布取决于沉积的细胞数量（n = 300，D = 趋势方程，R = 0.87）。

这些箱线图展示了该技术的多功能性，通过仅改变沉积的细胞的初始数量，使用相同的模具即可生成直径范围为 50 至 150 μm 的球体。值得注意的是，偏差对于小细胞数量（<1 × 10 ^{6 ）很重要，达到每个光盘 1 × 10}⁶细胞的最小值。根据设计的微孔直径（约 400 µm），这种条件似乎最适合均匀球体的生产（图 4E）。这一观察结果可归因于微孔体积与可重复填充的细胞占据的最佳体积（以及细胞数量）之间的关系。

此外，该方法表现出良好的重现性，使用每个盘 1 × 10 ^{6 个}细胞（每微孔约 5,000 个细胞）进行三次独立实验，显示球体中值直径的偏差仅为 10.2 µm（运行 1：中值 130.2 ± 10.2 μm；运行 2 ：127.9 ± 9.9 μm；运行 3：128 ± 10.4 μm）。

提取后观察该方法产生的 hiPSC 球体的完整性（图 6A）。在所有情况下，观察到透明的外围膜，表明良好的聚集。在培养基 (mTeSR™ Plus) 中培养 5 天后，观察到显着生长（图 6B），验证了所产生的球体的活力和质量。

图 6.第 1 天 (A) 和第 5 天 (B) 每盘1 × 10 ^{6 个}细胞（每孔 ≃5000 个细胞）条件下的球体直径。比例尺 = 100 µm。

协议验证

该协议已成功应用于实验室的各种研究以及我们最近的出版物（Lemarié 等人，DOI：10.3390/bioengineering10121418）。在这项特殊研究中，将 hiPSC 诱导的球体纳入不同的藻酸盐-明胶水凝胶中，以研究在没有生长因子的情况下粘弹性特性对球体命运的影响。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

3D打印成型时，只要正确执行后处理，树脂的性质相对不重要。值得注意的是，非聚合树脂会阻碍有机硅交联[13]。关于打印参数，强烈建议对中心部分（EBs-mold-intern）采用最大分辨率（层高 < 50 μm）。低分辨率可能会导致微孔中的阶梯效应，对细胞聚集产生负面影响，从而影响球体质量。
从井中提取球体是关键的一步。翻转圆盘然后离心去除大多数球体，但一些球体可能保留在微孔中。使用 DPBS 冲洗步骤可以使其恢复。建议在此步骤中大力冲洗（采用重要的回流速率）光盘。为了更严格地标准化球体直径，可以使用具有规定网孔尺寸（通常< 200 μm）的过滤器来留出直径过大的球体，特别是在圆盘边缘，这会影响球体直径分布（见图S2a和图S2b））。原则上，如果用细镊子处理或在清洗步骤中未损坏，硅胶盘可以无限次重复使用。
^{在用 10 6 个}细胞沉积物诱导的球体中观察到的分散度降低与预期一致。该沉积相当于每个微孔大约 500 个细胞，考虑到微孔的圆锥形几何形状（深度为 400 μm，底面为 600 μm），这是一个最佳数量。图 4 阐明了这种所选格式的适应性。请注意，尺寸的适用性取决于细胞类型和数量，突出显示了本研究所选配置的多功能性。
孵育 24 小时后，hIPSC 球体显示出最佳的聚集和结构完整性，并且不会分解。建议在拔牙后一小时内使用它们以防止融合。它们可以重新整合到标准细胞培养物中，粘附在基质涂层上并增殖。或者，它们可以合并到像Matrigel ^®这样的粘性溶液中，同时保持完整性。100 μm hIPSC 球体成功嵌入藻酸盐-明胶水凝胶中，并保留了活力（活死染色，[10]）。请注意，由于扩散限制，球体直径较大时形成坏死核心的风险增加。
这里展示的 3D 模型（使用 Autodesk Fusion 360 设计）是多次迭代的结果，被认为是目前市场上喷墨打印机的平均分辨率和每次实验中获得的球体数量之间的一个非常好的折衷方案。

故障排除

问题1：没有聚合。

可能的原因：细胞数量。

解决方案：沉积更多细胞（根据细胞类型需要允许聚集的最小数量）。

问题2：球体直径的均匀性。

可能的原因：细胞沉积。

解决方案：在整个椎间盘结构上实现均匀沉积（例如通过圆周运动）对于防止局部细胞集中至关重要。

问题 3：每孔有几个球体。

可能原因：离心不良。

解决方案：将离心时间加倍。

问题4：球体产量低。

可能的原因：球体卡在硅胶盘微孔中。

解决方案：在翻转和离心光盘之前用力冲洗光盘。

致谢

这项研究得到了 SEGULA Technologies 和 ANRT（国家研究与技术协会）的支持。作者对 IPS-PGNM 核心设施（https://pgnm.inmg.fr/plateformes-inmg/，法国里昂）提供 AG08C5 和 SCTi003-A（干细胞技术）控制 IPS 线表示感谢。AG08C5 系列在欧洲 hPSCreg 正式注册为 PGNMi001-A ( https://hpscreg.eu/cell-line/PGNMi001-A ) [12]。SCTi003-A 是商业细胞系，雌性，源自血细胞（STEMCELL，温哥华，加拿大）。作者还承认，iPS-PGNM 平台使用的所有人类细胞均已正式向法国卫生部申报 (CODECOH DC-2022-5055)。

这些实验是在 LBTI（法国里昂组织生物学和治疗工程实验室）和学术平台 3d.FAB（法国维勒班）的宝贵帮助下进行的。特别感谢 Rania Hadji 协助起草图片协议。该协议在[10]中得到应用。

利益争夺

作者声明不存在利益冲突或利益竞争。

参考

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补充资料

以下支持信息可以在这里下载

图 S1：用预印模具生产硅胶盘的不同步骤的图示方案。
图 S2：每个圆盘 1 × 10 ^{6 个}细胞的 AG08C5 球体的直径分布。