材料与试剂

生物材料

pET14b 质粒或其他细菌蛋白表达载体中的钙调蛋白
来自 Proteogenix ( https://www.proteogenix.science/ ) 或其他来源的肽

建议使用具有有利于 CaM 结合的序列、结构或功能的肽，建议最小长度为 5 个氨基酸，最多为 50 个氨基酸，以避免纯度和产量方面的潜在挑战。参见注1。
大肠杆菌BL21 DE3（Sigma-Aldrich，目录号：69450-M）（其他菌株也可能有效）

试剂

丹磺酰氯（DNSC）（Merck，Supelco，目录号：03641）
Sephadex G-25（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：S5772）
Sepharose CL-4B（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：4B200）
Base Trizma（Tris）（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
HEPES（Thermo Fisher，Thermo Scientific Chemicals，目录号：J16926.A1）
氯化钾（KCl）（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
乙二醇-双（β-氨基乙基）-N,N,N,N-四乙酸（EGTA）（Merck，Millipore，目录号：324626）
二水氯化钙（CaCl ₂）（Merck，Millipore，目录号：208291）
氯化钠（NaCl）（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
30% 丙烯酰胺/双溶液，37.5:1（Bio-Rad，目录号：1610158）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：436143）
过硫酸铵（APS）（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：A3678）
Tetrametiletilendiamina（TEMED）（Thermo Fisher，目录号：17919）
异丙醇（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：I9516）
考马斯亮蓝 R-250 粉末（CBB R-250）（Bio-Rad，目录号：1610400）
甲醇（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：1060351000）
乙酸（冰）100%（Merck，Supelco，目录号：100066）
苯基琼脂糖 CL-4B（Merck，Cytiva，目录号：GE17-0150-01）
二甲基亚砜（DMSO）（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
N,N-二甲基甲酰胺（DMF）（Merck，Supelco，目录号：DX1730）
丙酮（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：179124）
乙醇（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：34852-M）
甘油（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
硝酸纤维素膜（Merck，Cytiva，目录号：GE10600001）
布拉德福德（Merck，Supelco，目录号：B6916）
丽春红（Ponceau 4R）（Merck，Supelco，目录号：18137）
三氟乙酸（TFA）（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：302031）
氢氧化铵溶液（NH ₄ OH）（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：221228）
乙腈（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：34851）
LB肉汤（Lennox）（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：L3022）
异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：I5502）
苯甲磺酰氟（PMSF）（Merck，Roche，目录号：10837091001）

解决方案

丹磺酰化缓冲液（D 缓冲液）（参见配方）
裂解缓冲液（L 缓冲液）（参见配方）
平衡缓冲液（CQ 缓冲液）（参见配方）
洗涤缓冲液（CW 缓冲液）（参见配方）
高盐洗涤缓冲液（CHSW 缓冲液）（参见配方）
洗脱缓冲液（CE 缓冲液）（参见配方）
荧光缓冲液（F 缓冲液）（参见配方）
钙缓冲液（Ca buffer）（参见食谱）
APS 10%（参见食谱）
SDS 10%（参见配方）
Tris-HCl 1.5 M，pH 8.8（参见配方）
Tris-HCl 1 M，pH 6.8（参见配方）
15% 丙烯酰胺电泳凝胶解析（参见配方）
堆叠丙烯酰胺凝胶（参见配方）
电泳缓冲液 10×（参见配方）
上样缓冲液 5×（参见配方）
考马斯蓝（见食谱）
快速脱色溶液（参见配方）
脱色溶液（参见配方）
氨苄青霉素 100 μg/mL（参见配方）
丽春红（见食谱）

食谱

丹磺酰化缓冲液（D 缓冲液）

试剂	最终浓度	数量
CaCl ₂ (1 M)	20毫米	2毫升
Tris-HCl（1 M，pH 8.5）	100毫米	10毫升
水_分子	不适用	88毫升
全部的	不适用	100毫升

裂解缓冲液（L 缓冲液）

试剂	最终浓度	数量
乙二胺四乙酸 (1M)	2毫米	0.2毫升
Tris-HCl（1 M，pH 7.5）	50毫米	5毫升
永磁同步滤波器 (0.1 M)	2毫米	2毫升
水_分子	不适用	83.8 毫升
全部的	不适用	100毫升

平衡缓冲液（Q缓冲液）

试剂	最终浓度	数量
CaCl ₂ (1 M)	5毫米	0.5毫升
Tris-HCl（1 M，pH 7.5）	50毫米	5毫升
氯化钠 (1 M)	100毫米	10毫升
水_分子	不适用	84.5毫升
全部的	不适用	100毫升

洗涤缓冲液（W缓冲液）

试剂	最终浓度	数量
CaCl ₂ (1 M)	0.1毫摩尔	10微升
Tris-HCl（1 M，pH 7.5）	50毫米	5毫升
氯化钠 (1 M)	100毫米	10毫升
水_分子	不适用	84.90 毫升
全部的	不适用	100毫升

高盐洗涤缓冲液（CHSW缓冲液）

试剂	最终浓度	数量
CaCl ₂ (1 M)	0.1毫摩尔	10微升
Tris-HCl（1 M，pH 7.5）	50毫米	5毫升
氯化钠 (1 M)	500毫米	50毫升
水_分子	不适用	44.90 毫升
全部的	不适用	100毫升

洗脱缓冲液（E缓冲液）

试剂最终浓度数量

EGTA (1 M) 1毫米 100微升

Tris-HCl（1 M，pH 7.5） 50毫米 5毫升

全部的不适用 94.9 毫升

荧光缓冲液（F缓冲液）

试剂	最终浓度	数量
氯化钾 (1 M)	120毫米	12毫升
HEPES（1 M，pH 7.4）	50毫米	5毫升
氯化钠 (1 M)	5毫米	0.5毫升
EGTA (1 M)	5毫米	0.5毫升
水_分子	不适用	82毫升
全部的	不适用	100毫升

参见注2。

钙缓冲液（Ca缓冲液）

试剂	最终浓度	数量
氯化钾 (1 M)	120毫米	12毫升
HEPES（1 M，pH 7.4）	50毫米	5毫升
氯化钠 (1 M)	5毫米	0.5毫升
EGTA (1 M)	5毫米	0.5毫升
CaCl ₂ (1 M)	20毫米	2毫升
水_分子	不适用	80毫升
全部的	不适用	100毫升

参见注3。

澳大利亚PS 10%

试剂最终浓度数量

APS 10% 1克

水_分子不适用 10毫升

十二烷基硫酸钠 10%

试剂最终浓度数量

安全数据表 10% 1克

水_分子不适用 10毫升

Tris-HCl pH 8.8 1.5 M

试剂最终浓度数量

特里斯 1.5M 36.3克

水_分子不适用 200毫升

*注4

Tris-HCl 1 M pH 6.8

试剂最终浓度数量

特里斯 1M 12.1克

水_分子不适用 100毫升

参见注5。

15% 丙烯酰胺电泳凝胶 RESOLVING（1 块凝胶）

试剂	最终浓度	数量
丙烯酰胺	15%	2.5毫升
Tris 1.5 M，pH 8.8	390毫米	1.3毫升
10% SDS	0.1%	50微升
10% APS	0.1%	50微升
泰美德	0.004%	2微升
水_分子	不适用	1.2毫升
全部的	不适用	5毫升

电泳凝胶堆叠（一张凝胶）

试剂	最终浓度	数量
丙烯酰胺	4.95%	0.33毫升
Tris 1 M，pH 6.8	125毫米	0.250毫升
10% SDS	0.1%	20微升
10% APS	0.1%	20微升
泰美德	0.01%	2微升
水_分子	不适用	1.2毫升
全部的	不适用	2毫升

电泳缓冲液 10×

试剂	最终浓度	数量
特里斯	25毫米	33克
甘氨酸	1.92米	144克
安全数据表	1%	10克
水_分子	不适用	1,000 毫升
全部的	不适用	1,000 毫升

上样缓冲液 5×

试剂	最终浓度	数量
Tris HCl 1 M pH 6.8	250毫米	5毫升
甘油	50%	10毫升
安全数据表	10%	2克
溴酚蓝1%	0.125%	250微升
水_分子	不适用	4.75毫升
全部的	不适用	10毫升

考马斯蓝

试剂	最终浓度	数量
乙醇	50%	125毫升
醋酸	10%	25毫升
CBB R-250	0.25%	625克
水_分子	不适用	100毫升
全部的	不适用	200毫升

*注6

快速考马斯脱色

试剂最终浓度数量

乙醇 10% 10毫升

醋酸 20% 20毫升

水_分子不适用 70毫升

全部的不适用 100毫升

考马斯亮蓝脱色

试剂最终浓度数量

醋酸 10% 10毫升

水_分子不适用 90毫升

全部的不适用 100毫升

氨苄西林 100 µg/mL

试剂最终浓度数量

氨苄青霉素 0.1克/毫升 1克

水_分子不适用 10毫升

实验室用品

截止功率为 2000 MW 的标准透析管（例如 Membra-Cel、Viskase，目录号：300911011）
过滤器，直径 0.2 µm（SARSTEDT，目录号：83.1826.001）
蛋白质浓缩器（Amicon R-Ultra，15 mL，3 KDa）（Millipore，Merck，目录号：UFC9003）
磁力搅拌器（Fisherbrand，Fisher Scientific，目录号：11808892）
小柱（1–5 mL 床体积）（用于重力流纯化的空 PD-10 柱）（Cytiva，目录号：17043501）
电泳室（Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽）（Bio-Rad，目录号：1658004）
手动电泳凝胶配件（适用于 1.00 毫米厚度的凝胶）（Bio-Rad，目录号：1658001FC）
微管，1.5 mL（Eppendorf，目录号：0030120086）
离心管，50 mL（Avantor，VWR，目录号：525-0634）

设备

轨道培养箱（Sartorius，型号：Certomat BS-1，目录号：20444445202）
分光光度计（VWR，型号：V-1200，目录号：634-60009
天平（Fisher Scientific，型号：FPOS622，目录号：8344272595）
热板搅拌器（Fisher Scientific，型号：AREX，目录号：15369664）
pH 计（pH 和 ORP 台式台式仪表实验室 Tester Hanna）（Servovendi，目录号：1965）
带定角转子的离心机（Beckman，型号：Avanti J-20 XP，目录号：8043-30-1171）
转子 JA14（贝克曼，目录号：339247）
微量离心机（Eppendorf，型号：5430R，目录号：5428000210）
Eppendorf ^®转子 F-35-6-30（Eppendorf，Merck，目录号：EP5427716009）
Eppendorf ^®转子 F-45-48-11（Eppendorf，Merck，目录号：EP5427755004）
分光荧光计（我们使用的是 SLM-Aminco 8100 系列 2，未市售）
具有两个透明面的石英比色皿（我们使用 3 mm 光路，100 μL 体积）（Hellma，目录号：105-251-15-40）

软件和数据集

Sigmaplot 11.0（Systat Software, Inc；2008）（可以使用任何其他科学数据分析和绘图软件）
Maxchelator ( https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/CaEGTA-TS.htm )

程序

CaM 表达和纯化

将人CaM基因插入pET-14b表达载体中，导入BL21-DE3大肠杆菌（也可以使用其他表达无毒异源基因的菌株）。CaM 的纯化程序根据现有文献 [11] 进行了改编，可大量获得可溶性蛋白质，如下所述。

蛋白表达
1. 在 37°C 的 1 L LB 培养基中培养甘油储备液中的 BL21-DE3 细胞，辅以 100 μg/mL 氨苄青霉素，直至光密度 (A ₆₀₀ ) 达到 0.8–1。
2. 通过添加 0.4 mM IPTG 诱导蛋白表达，并在 37 °C 下继续培养 4-6 小时或在 20 °C 下培养过夜。
细胞收获和重悬
1. 离心收集细胞（9,000× g， 4°C，9 分钟），并用 50 mL 新鲜裂解缓冲液洗涤细胞沉淀两次。
2. 将细胞沉淀重新悬浮在 30 mL 裂解缓冲液中，并将样品以 10 mL 等分试样储存在 -20°C 下。
样品制备
1. 在冰上解冻等分试样并进行超声处理（50 kHz 下 3 个 10 秒的循环；将样品放在冰上）。
2. 通过在干冰乙醇浴和 37°C 水浴之间交替，使样品经历三个冻融循环。
3. 将样品在微量离心机中以 14,000× g离心 15 分钟。
4. 将上清液加热至 95°C 5 分钟，然后如前所述离心。此步骤利用了 CaM 增强的热稳定性。
色谱法
1. 将CaCl ₂引入上清液中（最终浓度：5 mM）。在室温下将样品加载到用 CQ 缓冲液预平衡的 5 mL 苯基琼脂糖柱上。色谱法可以通过重力流或利用蠕动泵来实现。用 20 倍柱体积的 CW 缓冲液清洗色谱柱，然后用 10 倍柱体积的 CHSW 缓冲液清洗。
2. 使用 20 倍柱体积的 CE 缓冲液洗脱 CaM，取 500 µL 的分数。
分析与存储
1. 将 20 µL CaM 与 5 µL 5× 加载缓冲液混合。将混合物加载到 15% 丙烯酰胺凝胶上，并使用 1 倍稀释的运行缓冲液进行电泳。在大约 120–150 V 的电压下运行凝胶 90 分钟。用考马斯蓝将凝胶染色 10 分钟，然后先使用快速脱色 15 分钟脱色，然后使用常规脱色 30 分钟。使用 3 kDa 的 Amicon 离心过滤器浓缩样品，使其最终浓度至少为 1 mg/mL。用 MilliQ 水透析级分，
2. 将纯化的 CaM 以 1 mg/mL 的浓度储存在 -20 °C 下，以 1 mL 的份数形式保存，或以 1 mL 的份数冻干。
3. CaM 浓度可以通过 276 nm 处的吸光度估算，其中 ϵ ₂₇₆ = 3,030 M ^-1 ·cm ^-1。或者，采用 Bradford 方法进行量化。

钙调蛋白的丹磺酰化
1. 钙调蛋白制剂
  
  首先在 D 缓冲液中稀释 CaM，以达到 1 mg/mL 的终浓度。
2. 丹磺酰氯制剂
  1. 将丹磺酰氯溶解在丙酮中，浓度为 2.17 mg/mL。
  2. 将此丹磺酰氯溶液储存在 4 °C 或 -20 °C 的黑暗环境中。它可以在很长一段时间内（通常是几个月）保持稳定。
3. 丹磺酰化过程
  1. 将 12.5 μL 制备的丹磺酰氯溶液以 1 mg/mL 添加到 1 mL 的 CaM 溶液中。这导致丹磺酰氯的最终浓度约为 100 μM。
  2. 将混合物在室温、黑暗中孵育 2 小时。在此期间，每 20 分钟轻轻涡旋一次混合物。
4. 丹磺酰化 CaM (D-CaM) 的分离
  1. 要将 D-CaM 与任何未反应的丹磺酰氯分离，您需要一个装有大约 1 mL Sephadex G-25 的一次性柱。
  2. 用蒸馏水平衡大约 250 毫克干树脂。
  3. 将 D-CaM 混合物加载到柱上，并收集每个 50–100 μL 的级分。
  4. 最初洗脱的级分（称为“排除级分”）含有 D-CaM 缀合物。
  参见注7。
  
  为了确定 CaM 中的特定丹酰化残基，采用了胰蛋白酶消化结合质谱或气相蛋白质测序仪，报告了 Lys75 或 Lys 115 处的丹酰化[12,13]。质谱分析显示每个 CaM 结合多达四个丹磺酰分子。此外，胰蛋白酶肽的串联质谱分析强烈表明 Ala1 和 Lys148 处存在丹磺酰化 [14]。其余两个丹磺酰化残留物的鉴定有待进一步调查；然而，数据与它们是Lys75和Lys115的可能性一致[14]。
5. 分数分析
  
  通过在硝酸纤维素上进行点印迹并用丽春红染色，快速验证收集的级分中是否存在蛋白质。此外，使用 15% SDS-PAGE 凝胶分析分数。要进行更详细的检查，请记录每个样品的发射光谱（如下文进一步解释）。
6. D-CaM 存储
  1. 收集含有 D-CaM 的级分，并根据需要进行浓缩。我们建议库存量在 0.5 至 5 µM 之间。
  2. 将所得 D-CaM 等分试样储存在 -20°C 的黑暗环境中，或者作为冻干样品储存。通常，缀合物在 -20°C 下储存几个月或更长时间后仍能保持其特性。
  参见注释 8。
7. 蛋白质浓度测定
  
  利用 Bradford 测定法测定 D-CaM 的蛋白质浓度，使用未标记的 CaM 作为标准。或者，通过 320 nm 处的 UV 吸收来测量 D-CaM 的浓度 (ϵ ₃₂₀ = 3,400 M ^-1 ·cm ^-1 )。
  
  丹磺酰部分浓度：
  
  通过光谱法确定掺入的丹磺酰部分的浓度。
  
  如果可能，计算 D-CaM 分子内特定丹酰化残基的数量。
  
  该过程可实现 CaM 的高效丹磺酰化，使其为各种下游应用和分析做好准备。

肽重悬

使用肽时，首先将它们溶解在蒸馏无菌水中。这特别适用于短肽（<5 个残基）。对于每种特定肽，根据其序列选择最合适的条件以确保最佳溶解度。
1. 计算总费用；首先评估肽的总电荷：
  
  为每个酸性残基指定值 -1，包括天冬氨酸（Asp 或 D）、谷氨酸（Glu 或 E）和 C 末端 -COOH。
  
  为每个碱性残基指定 +1 值，包括精氨酸（Arg 或 R）、赖氨酸（Lys 或 K）、组氨酸（His 或 H）和 N 末端 -NH2。计算肽的净电荷。
  1. 正电荷肽；如果肽的总电荷为正：
    
    首先尝试将肽溶解在水中。如果水不起作用，请尝试使用 10%–30% 的乙酸溶液。如果肽仍不溶解，则添加少量TFA（<50 μL）使其溶解，然后稀释至所需浓度。
  2. 负电荷肽；如果肽的总电荷为负：
    
    首先尝试将肽溶解在水中。如果水无法溶解肽，则添加少量 NH ₄ OH (<50 μL) 并稀释至所需浓度。参见注释 9。
  3. 中性电荷肽；对于净电荷为零的肽：
    
    按如下方式引入有机溶剂：首先，尝试添加乙腈、甲醇或异丙醇。对于高度疏水性肽，从少量 DMSO（30–50 μL，100%）开始。逐渐将该溶液逐滴添加到搅拌的水性缓冲溶液（如 PBS 或您首选的缓冲液）中，直至达到所需的肽浓度。如果肽溶液出现浑浊，则表明已达到溶解度极限。在这种情况下，超声处理可以帮助溶解肽。如果肽包含半胱氨酸残基，请使用 DMF 而不是 DMSO。参见注释 10。
    
    如果肽易于聚集，请在进行必要的稀释之前加入 6 M 盐酸胍或 8 M 尿素。

肽与 Apo-CaM 的相互作用

在荧光缓冲液中稀释肽库存以获得 20 μM 肽溶液。

使用以下公式计算每个滴定步骤所需的肽体积：C ₁ ·V ₁ = C ₂ ·V ₂，其中 C ₁是库存中的初始肽浓度 (20 µM)，V ₁是要滴定的肽体积添加在每个步骤中，C ₂是每个步骤中所需的最终肽浓度，V ₂是总样品体积（100 µL）。

准备一个包含计算体积的表格（表 1）：

_{表 1. 在不存在 CaCl 2}的情况下进行肽滴定的样品组成

肽终浓度 (μM)	D-CaM 1 µM (µL)	肽 20 µM (µL)	荧光缓冲液体积 (μL)
0	5	0	95
0.1	5	0.5	94.5
0.2	5	1	94
0.5	5	2.5	92.5
1	5	5	90
1.5	5	7.5	87.5
2	5	10	85
4	5	20	75
8	5	40	55
16	5	80	15

样品制备后，以 185,494× g（半径 98 mm）离心 10 分钟，并小心地将所得上清液转移至新鲜的 500 µL 管中，以去除任何潜在的聚集物。

确保没有气泡，因为它们会扭曲荧光读数。将比色皿插入荧光计并继续采集发射光谱。采用 340 nm 的激发波长，记录 400–660 nm 范围内的发射。所有测量均在 25 °C 的温度下进行，并进行必要的校正以消除任何与缓冲液相关的干扰。这些条件应在 D-CaM 光谱中产生 500 nm 左右的显着荧光峰。记录每个肽浓度的荧光值。
分析数据以确定不同浓度下肽和 D-CaM 之间的相互作用。

钙滴定：

一旦达到信号饱和的肽浓度，就开始将浓缩的 CaCl ₂等分试样逐渐添加到含有肽饱和样品的比色皿中。
在 100 μL 肽饱和样品中，依次添加 1 μL Ca 缓冲溶液。值得注意的是，所有实验都将在 pH 7.4 和 25 °C 的恒定条件下进行。请记住，EGTA 缓冲取决于 pH 值。

值得强调的是，实验设计包含 10 mM Ca 缓冲液，可评估从 nM 到 µM 范围内的游离钙浓度。值得注意的是，CaCl ₂浓度的调整是允许的，并且可以采用替代缓冲液来促进不同钙浓度范围（无论是升高还是降低）的分析。

利用 Ca-EGTA 计算器 v1.3，结合来自 Theo Schoenmakers 螯合剂的常数，特别是表 2，它对应于 10 mM CaCl ₂钙缓冲液。每次添加 Ca ²⁺后，确保充分混合以达到均匀性。

参见注释 11。

表 2. 10 mM CaCl ₂溶液的游离钙浓度计算

Ca 缓冲液体积 (μL)	总体积（μL）	[Ca ²⁺ ] 总量 (mM)	[Ca ²⁺ ] 游离 (μM)
0	100	0	0
1	101	0.1	0.0030
2	102	0.2	0.0079
3	103	0.3	0.177
4	104	0.4	0.471
5	105	0.5	2.45
6	106	0.6	10.01
7	107	0.7	20
8	108	0.8	30
9	109	0.9	40
10	110	1.0	50

将每个样品添加到比色皿后大约 20-30 秒记录荧光光谱。请注意，延长平衡时间不会产生改进的数据。
继续滴定 Ca ²⁺直至达到饱和，这表示光谱中没有进一步可观察到的变化。

肽与 Holo-CaM 的相互作用

为了评估肽与 Holo-D-CaM 的相互作用，首先用 1 mM 游离 CaCl ₂饱和 CaM 。

使用以下公式计算每个滴定步骤所需的肽体积：C ₁ ·V ₁ = C ₂ ·V ₂，其中 C ₁代表库存中的初始肽浓度 (20 μM)，V ₁是要加入的肽的体积在每个步骤中添加，C ₂是每个步骤所需的最终肽浓度，V ₂是总样品体积（100 μL）。

创建一个表来记录计算的体积（表 3）：

表 3. 在 1 mM CaCl _{2存在下肽滴定的样品组成}

最终肽浓度 (μM)	肽 20 µM 体积 (µL)	F 缓冲液 (μL)	Ca 缓冲液 (μL)	总 V (μL)
0	0	90	10	100
0.2	1	89	10	100
0.5	2.5	87.5	10	100
1	5	85	10	100
2	10	90	10	100
4	20	80	10	100
8	40	50	10	100
16	80	10	10	100

准备好样品后，以 185,494× g（半径 98 mm）离心 10 分钟，然后小心地将所得上清液转移到新鲜的 500 μL 管中，以消除任何潜在的聚集体。
确保没有气泡，因为它们会扭曲荧光测量。将比色皿插入荧光计并继续采集发射光谱。使用 340 nm 的激发波长，记录 400–660 nm 范围内的发射。所有测量均在 25 °C 的温度下进行，并进行适当的校正以考虑任何与缓冲液相关的干扰。这些条件应在 D-CaM 光谱中产生 500 nm 左右的显着荧光峰。记录每个肽浓度的荧光值。

数据分析

在评估特定肽对 D-CaM 的亲和力时，我们的方法涉及分析在不同肽浓度下获得的发射光谱，如图 1A 所示。值得注意的是，在肽浓度和发射光谱强度之间观察到相关性。发射光谱表现出可辨别的趋势，直到达到饱和点，其中肽浓度的进一步增加不再引起最大发射强度的变化。

为了更好地评估强度变化，我们重点关注 490–500 nm 的波长范围（表 4）。我们通过总结该范围内的值来量化强度增加。为了标准化，我们使用 apo-CaM 条件作为基线，确保具有 0 μM 肽的 D-CaM 对应的强度为 0。为了标准化，我们将强度总和除以 apo-CaM 条件中获得的相应值（表 4）。

随后在Holo-CaM条件下重复实验方案，其中最初引入饱和浓度的未结合Ca ²⁺ (例如，10mM)，随后重复肽滴定过程。

为了更清楚地描述强度变化，我们将标准化值表示为百分比，将最大强度设置为 100。这种标准化需要将每个值除以获得的最大强度，然后将结果乘以 100（表 1）。

图 1. 发射光谱数据分析。^{A. 在不存在（左）和存在（右）Ca 2+}的情况下肽增量浓度对丹酰基-CaM (D-CaM) 荧光发射光谱的影响。达到最大发射的波长由垂直不连续线表示（改编自 Alaimo 等人 [15]）。^{B. 在不存在（左）和存在（右）Ca 2+}的情况下，使用固定的 12.5、100 和 400 nM D-CaM 浓度，不同肽浓度下荧光的相对浓度依赖性增强。每种条件下的EC ₅₀值均以蓝色表示。C. 外推至真实亲和力。在不同 D-CaM 浓度下实现 50% 最大响应 (EC ₅₀ ) 的肽浓度图（改编自 Bonache 等人 [16]）。

表 4. 实验数据汇总。归一化数据列中的值是通过将每个强度值除以 apoD-CaM 中获得的相应值并减去 1 获得的。百分比列表示百分比，最大值取 100%，通过将所有值除以最大值计算得出标准化值。

肽 [μM]	强度总和 (490–500 nm)	标准化数据（相对于apoD-CaM）	百分比
0	x1	(x1/x1_apoD-CaM) - 1 = y1	（y1/y最大值）* 100
2	x2	(x2/x1_apoD-CaM) - 1 = y2	（y2/y最大值）* 100
4	x3	(x3/x1_apoD-CaM) - 1 = y3	（y3/y最大值）* 100
...	...	...	...
n	x_最大	(x_ max /x_1_apoD-CaM) – 1 = y max	(y最大值/y最大值)*100 = 100

如果我们将获得的值与肽浓度作图，则会生成以百分比表示的剂量反应曲线。这种方法有利于对不同肽浓度的强度变化进行稳健比较，最终以基于百分比的方式表示指定肽对 D-CaM 的亲和力。

要生成浓度响应曲线，请根据肽-D-CaM 比率或[肽]绘制荧光增强效果，并通过曲线回归使用三参数希尔方程拟合数据。

由于配体耗尽， EC ₅₀值随 D-CaM 浓度变化，尤其是在低浓度下。通过确定一系列 D-CaM 浓度范围内的EC ₅₀值来校正消耗。在无限低的 D-CaM 浓度下，消耗可以忽略不计，使 EC ₅₀成为真正的亲和力值 [1]。为了准确测定解离常数 (K _d )，请使用不同的 D-CaM 初始浓度 (6.25–200 nM) 进行滴定，并在每个 D-CaM 浓度下创建浓度-响应曲线（图 1B）。从图 1B计算表观解离常数 (EC ₅₀ ) 并将其与 D-CaM 浓度作图 (图 1C)。通过线性拟合和外推至 D-CaM 浓度为零，获得真实的解离常数。公式原理

如果化学计量已知，则使用斯卡查德图分析估计 K _d值。然而，我们推荐以前的方法，因为其在 K _d测定中的准确性和可靠性，特别是在复杂的结合相互作用中。

要估计 K _d，假设化学计量为 1:1，请应用以下方程：

这里，F 代表荧光增加，F _max是最大荧光（变量），[peptide] 是已知的总肽浓度，[CaM] 是总 D-CaM 的已知浓度，K _d是亲和常数。

将结果表示为来自三个或更多实验的平均值±SEM。对于统计分析，使用未配对的学生 t 检验，其中 P < 0.05 (*)、P < 0.01 (**) 和 P < 0.001 (***) 被认为具有统计显着性。该协议提供了一种综合方法，用于估计D-CaM 的基于荧光的配体置换测定中的K _{d ，考虑 D-CaM 浓度的影响并校正低浓度下的配体损耗。}它为表征 D-CaM 和配体之间的结合亲和力和协同性提供了一种可靠的方法。

协议验证

^{该方法最初由 Kincaid 和 Vaughan 于 1986 年验证[17]，在识别与 Ca 2+}、肽或蛋白质相互作用引起的构象变化方面表现出一致的功效。Yuan by 和 Graves 在 1989 年的后续研究 [18] 研究了 CaM 与磷酸化酶激酶 γ 亚基的相互作用，而 Munier 等人。1991 年 [19] 表征了百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的催化和钙调蛋白结合域（参见图 3 和 4）。菲洛特奥等人。^{[20]深入研究了红细胞Ca 2+}泵的脂质结合区（G区）与CaM之间的结合（见图4和图5）。2013 年，Alaimo 等人。[14]探讨了 CaM 与 Kv7.2 通道不同成分的相互作用（参见图 5、6 和 7）。张等人。[21] 鉴定了血管紧张素 II (AT1A) 受体中两个不同的 CaM 结合位点（参见图 4 和 6）。阿尔卡德等人。[22] 证明，与不存在 Ca 2+相比，源自 Grb7 CaM 结合位点的非肉豆蔻酰化肽在存在 Ca ^{2+的情况下表现出更高的结合丹酰基-CaM 的效率（参见补充图 2）。}最近，Nuñez 等人。[23]表明，源自 Kv7 通道 S2S3 连接子的肽的氧化会抑制其与 CaM 的结合（参见图 3），并且许多其他研究有助于该方法的综合利用。

一般注意事项和故障排除

我们要求肽的纯度超过 90%，除了保持正确的序列外，还应在 N 末端具有氨基 (-NH3)，在 C 末端具有羧基 (-COOH)。这些末端基团有助于促进肽在后续实验过程中的稳定性和适用性，例如结合测定和功能研究。
D-CaM 样品中的初始 Ca ^{2+浓度在这些测定中起着关键作用。}因此，必须尽量减少任何残留Ca ²⁺的存在。为了实现这一目标，我们使用 5 mM EGTA 来确保滴定下与蛋白质结合的最小内源 Ca ²⁺不会干扰游离 Ca ²⁺水平。
确保缓冲液配制后立即将 pH 值重新调节至 7.4，因为添加 CaCl ₂会导致 pH 值降低。
我们建议将 Tris 溶解在 150 mL 溶液中，用 HCl 仔细调节 pH 至 8.8，然后精确添加必要的体积以达到 200 mL 的最终体积。
我们建议将 Tris 溶解在 75 mL 溶液中，用 HCl 小心地将 pH 调节至 6.8，然后精确添加必要的体积以达到 100 mL 的最终体积。
持续搅拌溶解2小时，并用滤纸过滤。室温保存，避光。
为了消除过量的丹磺酰氯，我们建议结合前面概述的凝胶过滤过程对 D-CaM 样品进行透析。
收集 D-CaM 级分，根据需要进行浓缩，并通过在 -20°C 避光等分试样中储存或通过冻干来保护它们。我们的彻底调查表明，当在 -20 °C 下储存数月甚至更长时间时，缀合物的特性基本保持不变 [14]。
确保蛋白质或肽样品保持均匀而不聚集是至关重要的。我们通常使用动态光散射 (DLS) 和 Zetasizer Nano 仪器（Malvern Instruments Ltd.）来评估样品分散度。必须使用具有单分散性的样品，其中相关函数和多分散指数均低于 0.2。
当处理含有半胱氨酸 (Cys) 残基的肽时，建议避免使用碱性溶液进行溶解并探索替代方法。在这种情况下，理想的溶剂包括脱气介质，如低 pH 缓冲液、稀乙酸或由 0.1% 三氟乙酸的乙腈水溶液组成的溶液。应特别小心避免使用 DMSO，尤其是在使用三氟乙酸肽时。
实现准确 Ca ²⁺滴定的关键是使用 EGTA 或 EDTA 等螯合剂精确控制游离 Ca ²⁺水平。我们更喜欢在 pH 7.5 下进行的实验中使用 EGTA，以复制细胞内条件和生理镁浓度。保持严格的 pH 控制至关重要，因为螯合效率对质子浓度高度敏感。为了计算游离 Ca ²⁺浓度，我们使用 Maxchelator 程序 ( http://maxchelator.stanford.es ) 和定制软件。各种其他程序可用于根据添加的总 Ca ²⁺、给定 EGTA 水平并考虑不同的温度、离子强度和 pH 条件来确定游离 Ca 2+^浓度。

致谢

本文得到了以下研究项目的资助：科学与创新部MCIN/AEI/10.13039/501100011033/FEDER、UE资助的项目PID2021-128286NB-100；巴斯克政府在 IT1707-22 项目下的支持。SM-A 和 EN 分别获得了巴斯克政府提供的博士前 (PRE_2021_1_0101) 和博士后 (POS_2021_1_0017) 合同的支持。

本文之前已被 Alaimo 等人描述和验证。[14] 和努涅斯等人。[23]。随后的验证已在各种研究中进行，如方案验证部分所述。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突。

参考

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