材料与试剂

生物材料

1.大鼠（Janvier Labs，法国）
该方案已应用于雄性和雌性大鼠，包括 10 至 18 周龄的 Wistar京都、Wistar汉诺威和自发性高血压大鼠品系。预计该协议适用于其他品系和年龄的大鼠。

试剂

1.Milli-Q 水
2.氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888），在室温下保存
3.葡萄糖酸钠（C 6 H 11 NaO 7 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S2054），在室温下保存
4.氯化钾（ KCl ）（Sigma-Aldrich，目录号：12636），在室温下保存
5.六水氯化镁（MgCl 2 · 6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M2670），在室温下保存
6.氯化钙（CaCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：C1016），在室温下保存
7.葡萄糖（C 6 H 12 O 6 ）（Sigma-Aldrich，目录号：G7021），在室温下保存
8.HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375），在室温下保存
9.牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9647），储存于4°C
10.1,4-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：DTT-RO），储存于4°C
11.来自木瓜乳胶的木瓜蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：P4762），储存于-20°C
12.溶组织梭菌F 型的胶原酶（胶原酶 F）（Sigma-Aldrich，目录号：C7926），储存于 -20 °C
13.溶组织梭菌H 型的胶原酶（胶原酶 H）（Sigma-Aldrich，目录号：C8051），储存于 -20 °C
14.Triton-X（Sigma-Aldrich，目录号：T8787），在室温下保存
15.4% 多聚甲醛 (PFA)（Sigma-Aldrich，目录号：HT501128），储存于 4 °C
16.磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（Gibco，目录号：10010023，或任何其他不含镁和钙的 PBS），室温保存
17.兔抗 Kv7.4 抗体（Abcam，目录号：ab65797），保存于-20°C
18.小鼠抗动力蛋白抗体（Abcam，目录号：ab23905），保存于-20°C
19.Duolink原位 PLA 探针抗小鼠 PLUS（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92001-100RXN），保存于 4 °C
20.Duolink原位 PLA 探针抗兔 MINUS（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92005-100RXN），保存于 4 °C
21.Duolink原位检测试剂红色，含5 ×连接缓冲液和5 × 扩增缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92008-100RXN），储存于 -20 °C
22.Duolink原位洗涤缓冲液 A 和洗涤缓冲液 B（Sigma-Aldrich，目录号：DUO82049-4L），溶解后储存在室温或 4 °C 下（参见配方）
23.抗动力蛋白（小鼠；1:500：ab23905；Abcam）和抗 Kv7.4（兔；1:200；ab65797；Abcam）

解决方案

1.氯化钙 (1 M)（参见食谱）
2.氯化钙 (100 mM)（参见食谱）
3.氯化镁 (1 M)（参见配方）
4.HEPES-Krebs 溶液（参见配方）
5.平滑肌细胞解剖溶液 (SMDS)（参见食谱）
6.库存解决方案（参见食谱）
7.管 1（参见食谱）
8.管 2（参见食谱）

食谱

将所有溶液装入容量瓶中，直至达到指定体积。使用容量瓶有助于实验中的精确测量和可靠的结果。

1.氯化钙 (1 M)
试剂最终浓度数量或体积
氯化钙1M11.098克
将氯化钙溶解在 Milli-Q 水中，将体积精确添加至 100 mL，并储存在 4 °C 下。

2.氯化钙 (100 mM)
μL Milli-Q 水中稀释 100 μL 1 M 氯化钙，并在室温下储存在 1.5 mL 管中。

3.氯化镁 (1 M)
试剂最终浓度数量或体积
六水氯化镁1M20.33克
将六水氯化镁溶解在 Milli-Q 水中，将体积精确添加至 100 mL，并储存在 4 °C 下。

4.HEPES 克雷布斯溶液
试剂最终浓度数量或体积
氯化钠134毫米1.593克
氯化钾6毫米89.46毫克
葡萄糖7毫米252.21毫克
HEPES10毫米476.6毫克
氯化钙 (1 M)2毫米400微升
氯化镁 (1 M)1毫米200微升
将试剂溶解在 Milli-Q 水中，将 pH 调节至 7.4，并将体积精确添加至 200 mL。该溶液应在实验当天新鲜配制。

5.SMDS解决方案
试剂最终浓度数量或体积
氯化钠60毫米1.75克
葡萄糖酸钠80毫米8.73克
氯化钾5毫米186.38毫克
六水氯化镁2毫米203.3毫克
葡萄糖10毫米900.75毫克
HEPES10毫米1.19克
将试剂溶解在 Milli-Q 水中，将 pH 调节至 7.4，并加至恰好 500 mL。制备后，将溶液分配到 50 mL 管中并储存在-20°C。在实验当天使用前解冻一份 50 mL SMDS 溶液。

6.洗涤缓冲液 A 和洗涤缓冲液 B
通过将 PLA 缓冲液袋分别溶解在 1 L Milli-Q 中，提前准备PLA 洗涤缓冲液 A 和 B。使用注射器和 0.2 μm孔径过滤器对两种缓冲液进行过滤灭菌，并储存在 4°C 下。

7.库存解决方案
试剂专注所需的最小体积
牛血清白蛋白10毫克/毫升200微升
数码地面电视10毫克/毫升150微升
木瓜蛋白酶5毫克/毫升100微升
胶原酶F10毫克/毫升70微升
胶原酶H5毫克/毫升40微升

8.管1
库存溶液最终浓度数量或体积
BSA（10 毫克/毫升）1毫克/毫升100微升
DTT（10 毫克/毫升）1.5毫克/毫升150微升
木瓜蛋白酶 (5 毫克/毫升)0.5毫克/毫升100微升
SMDS不适用650微升
全部的不适用1,000微升

9.管2
库存溶液最终浓度数量或体积
BSA（10 毫克/毫升）1毫克/毫升100微升
胶原酶 F (10 毫克/毫升)0.7毫克/毫升70微升
胶原酶 H (5 毫克/毫升)0.2毫克/毫升40微升
*氯化钙 (100 mM)100 µM1微升
SMDS不适用790微升
全部的不适用1000微升
*可预先配制氯化钙储备液并在室温下保存以供重复使用。

实验室用品

1.手术剪刀（Fine Science Tools，Mayo-Stille Scissors，目录号：14101-14 ）
2.解剖钳（Fine Science Tools，Fine Forceps，目录号：11252-00 ）
3.解剖剪刀（Fine Science Tools，弹簧剪刀，目录号：15020-15 ）
4.解剖皿（硅胶涂层）
5.缝纫针
6.1.5 mL微量离心管（Eppendorf，目录号：0030120086）
7.50 mL Falcon 管（Falcon）
8.100/200 mL 玻璃烧杯
9.50 mL 注射器 (BD Plastipak)
10.0.2 μm孔注射器过滤器（Sigma-Aldrich，目录号：WHA9914）
11.一次性巴斯德移液器（ Thermo Fisher，目录号：202-1SPK）
12.24孔细胞培养板（ Thermo Fisher，目录号：144530）
13.聚苯乙烯泡沫塑料冰盒
14.火抛光玻璃移液管（定制，见图1）

图1 。玻璃巴斯德吸管的火焰抛光。 A. 取下并丢弃移液器的长端。 B. 在本生火焰中旋转移液器末端，直至其边缘被抛光且开口变光滑且变窄。火抛光前（左）和火抛光后（右）的开口对比。

15.加湿室（定制）
16.盖玻片 12 毫米圆形（VWR，目录号：76355-906）
17.显微镜载玻片（VWR，目录号：16004-422）
18.透明指甲油（任何）

设备

1.移液器（范围从 1 到 1,000 µL ）
2.加热块 (37 °C)
3.本生灯
4.室温下板摇床
5.37℃、5%CO 2细胞培养箱
6.解剖显微镜（奥林巴斯SZX7体视显微镜）
7.细胞显微镜（Leitz Labovert倒置光学显微镜，10 ×物镜）
8.ZEIS LSM780/LSM900 显微镜或任何其他激光扫描共焦显微镜

软件

1.ImageJ（版本 1.53k， 2021 年 7 月）
2.GraphPad PRISM（版本 9，2020年 10 月）

程序

第一部分：大鼠血管平滑肌细胞的分离

A.准备

1.从 -20°C 冰箱中取出装有 SMDS 溶液的 50 mL Falcon 管，并在冰上解冻。
2.准备 HEPES-Krebs 溶液（参见配方）
3.将酶从-20°C冰箱中取出并在室温下解冻。

B.大鼠肠系膜动脉的分离

1.处死大鼠（根据欧盟指令 2010/63EU 关于保护用于科学目的的动物的附件 IV）。
a.通过对头部的一次撞击使老鼠失去知觉。意识丧失后立即进行颈椎脱位，完成宰杀。
2.使用手术剪刀进行剖腹手术，并将肠道提升出腹腔（图 2A-2D）。

图2.大鼠肠系膜动脉的解剖过程。 A. 通过颈椎脱位对雄性 Wistar 大鼠实施安乐死。 B-D。进行剖腹手术，并分离大鼠肠道。 E. 使用缝纫针将肠固定在解剖盘上以暴露肠系膜血管。 F-H。可以看到被脂肪组织包围的主要肠系膜动脉和静脉。我知道。去除周围组织，分离肠系膜动脉的3-4个分支以提取动脉平滑肌细胞。

3.切开直肠上方和胃下方的肠道，并将肠道放入装有 HEPES-Krebs 的烧杯中，置于冰上（图2A-2D ）。
4.将肠道放入装有冷 HEPES-Krebs 缓冲液的解剖盘中，并将空肠和回肠沿着解剖盘的侧面钉成一个圆圈，使肠系膜血管可视化，主动脉分支位于中心（图2 E ）。
5.将培养皿置于 10 倍解剖显微镜下，以可视化动脉和静脉（图 2F-2G ）。
a.动脉与静脉的区别在于其平滑肌层较厚，这使得它们比静脉更坚硬。此外，与静脉相比，较厚的壁导致血容量减少。
6.去除动脉周围的所有组织（图2G-2H ）。
a.首先找到较大的静脉，然后用两把镊子小心地撕开它们；然后，将它们一直删除到较低阶的分支。
b.切开连接动脉分支的肠系膜，去除动脉周围的所有脂肪组织。
7.首先在低级分支处切割，去除肠系膜动脉，然后通过切割中央分支来释放肠系膜动脉（图2I-2K ）。
8.取一小段主动脉，包括 3-4 个肠系膜下动脉分支，将其放入装有 SMDS 溶液的 1.5 mL 管中，置于冰上。
9.从解剖盘中取出剩余的肠道进行处理。

C.肠系膜动脉平滑肌细胞的分离

1.准备好火抛光玻璃巴斯德吸管。要制作火抛光移液器，请将移液器的长端折断并将其扔掉。将末端破损的移液器暴露在本生火焰中，并不断旋转。继续此过程，直到边缘抛光、开口平滑并缩小至内径约 0.7-1 毫米（图 1）。每次实验后用乙醇清洗移液器，以便其可用于后续的实验。
2.以下用于平滑肌细胞分离的解决方案改编自Zhong等人。 [14] 和 Chadha 等人。 [11]。将以下储备溶液（配方 7-9）溶解在 1.5 mL 试管中的 SMDS 溶液（配方 5）中，并将其保存在室温下。
a.这些储备液必须在实验当天新鲜配制，不能储存以供将来的实验使用。
3.将带有肠系膜动脉分支的管放入 37°C 热块中的 SMDS 溶液中 10 分钟，以在 37°C 下平衡动脉。
4.同时，通过将储备溶液（配方 7）和 SMDS 溶液合并在 1.5 mL 管中来准备管 1（配方 8）。
5.将肠系膜动脉转移至管 1 。轻轻翻转管 4-5 次，以确保动脉与溶液正确混合，并在 37°C 下孵育 10 分钟。
6.同时，通过将储备溶液（配方 7）和 SMDS 溶液合并在 1.5 mL 管中来准备管 2（配方 9）。
7.从加热块中取出动脉，并使用带有橡胶球的玻璃巴斯德吸管在冰冷的 SMDS 溶液中清洗五次。
8.将肠系膜动脉转移至管 2。轻轻翻转管 4-5 次，使动脉与溶液混合，并在 37°C 下孵育 10 分钟。
a.在此步骤中，动脉分支可能会显得稍微模糊或蓬松；这意味着酶消化有效地分离了细胞。
9.使用带橡胶盖的玻璃巴斯德移液器在冰冷的 SMDS 溶液中轻轻清洗五次。在最后一次洗涤期间，用 500 μL SMDS替换溶液。
10.使用定制的火抛光玻璃移液器轻轻研磨动脉分支，释放肌细胞。
a.进行大约 30 次上下研磨。
11.将含有释放的肌细胞的上清液储存在冰上的单独管中，并将 500 μL新鲜 SMDS 添加到管中的动脉分支中。将一滴上清液放在载玻片上，并使用 10 ×显微镜评估细胞密度。
12.重复研磨过程并将上清液保存在冰上的单独管中，直到上清液中不再释放细胞。
a.此过程可能需要大约 1-5 轮研磨。
注意：如果酶是新打开的，请考虑缩短管 1 和管 2 中酶的动脉孵育时间（缩短 1-3 分钟），以防止动脉过度消化并增强心肌细胞释放。
13.合并已释放肌细胞的上清液，并通过添加更多 SMDS 来调整细胞浓度，以达到所需的细胞密度。将 50 µL 细胞放在玻璃盖玻片上，可以在光学显微镜下检查细胞密度。进行该方案没有必要的明确的细胞密度，但平滑肌细胞应该在光学显微镜的 20× 物镜下可见，并且细胞不应拥挤和相互接触。
14.添加 1 μL 100 mM 氯化钙（最终浓度为 100 μM氯化钙）。细胞粘附在盖玻片上需要钙。
笔记：如果固定细胞后盖玻片上的细胞大量丢失，请考虑将氯化钙浓度增加 10%–20%。
15.添加 100 μL细胞悬液，并在室温下保持 30 分钟，让细胞粘附到盖玻片上（图 3A）。
a.30分钟后，可以将细胞与药剂一起孵育。为此，将化合物以所需浓度溶解在补充有 100 μM氯化钙的 SMDS 溶液中，用 100 μL化合物溶液替换盖玻片上的溶液，并在 37°C 下孵育。

图 3. 分离的血管平滑肌细胞的粘附和一抗孵育。 A. 将 100 µL 细胞悬浮液置于孔中的每个盖玻片上。 B. 使用聚苯乙烯泡沫塑料冰箱和封口膜创建加湿室。 C. 将一滴稀释抗体滴在石蜡膜上，然后将贴有细胞的盖玻片放在上面，用一抗孵育细胞。 D. 用保鲜膜密封加湿室，在 4 °C 下孵育。

16.通过从盖玻片中轻轻吸出 SMDS 溶液来固定细胞，并将 400 μL的 4% PFA 应用到每个孔中。将 24 孔在室温下放在摇床上 15 分钟。
17.PBS 清洗 3 次，每孔400 μL 。
18.立即使用盖玻片进行 PLA 实验，或将盖玻片储存在 24 孔板（每孔含有 1 mL PBS 并用封口膜密封）中，在 4°C 下保存长达四个星期，直到用于 PLA 实验。储存时间取决于具体的细胞类型。

第二部分：解放军

A.准备

1.使用前让 PLA 洗涤缓冲液 A 和 B 达到室温，因为冷洗涤缓冲液可能会导致非特异性背景信号。

B.透化、封闭和一抗孵育

1.在 PBS 中准备足够体积的 0.1% Triton-X，将 400 μL溶液添加到孔内的每个盖玻片中。
2.添加 400 μL 0.1% Triton-X，置于摇杆上，孵育 5 分钟以透化细胞。
3.在 PBS 中洗涤两次，每次 5 分钟。
4.除去 PBS，并将三滴封闭缓冲液（PLA 探针套件中提供）滴到每个孔盖玻片上的细胞上。 37°C 孵育 30 分钟。
5.准备一抗混合物。非常重要的是，针对目标蛋白的两种一抗是在不同物种中产生的。
a.在我们的实验中，为了观察 Kv7.4 和动力蛋白的共定位，我们制备了由抗动力蛋白和抗 Kv7.4 抗体组成的一抗混合物。
6.按照每种抗体的具体要求，用 PLA 探针试剂盒中提供的抗体稀释液稀释一抗。
a.准备足够的量，为每个盖玻片使用 40 μL的一抗混合物。
7.创建一个加湿室（图 3B）。
a.使用聚苯乙烯泡沫塑料冰盒的盖子；盖子的中间必须有一个凹陷区域。
b.将一块封口膜放在盖子中央，盖玻片将放置在此处进行孵育。
c.使用石蜡膜创建四个井，每个井内含有湿纸巾（见图 3B）。将四张湿纸巾放入聚苯乙烯泡沫塑料盖中间的平片封口膜周围的封口膜孔中。这将有助于保持水分并防止盖玻片在与一抗过夜孵育期间变干。
8.将 40 μL的一抗混合物添加到石蜡膜中。
9.使用镊子将盖玻片从封闭液中提起，将其从孔中取出。轻轻拍打纸巾上的盖玻片侧面，去除多余的封闭缓冲液，然后将其放在抗体滴上，其中含有细胞的一侧与液滴接触并朝下（图 3C）。
10.用保鲜膜盖住聚苯乙烯泡沫塑料盖，并在 4°C 下放置过夜（图 3D）。
笔记：该一抗浓度和孵育时间可能需要优化。

C.探针孵育

注：每个盖玻片代表一个反应，每个反应使用 40 µL 溶液。以下步骤中提供的计算适用于单个反应。
1.第二天，将 PLA PLUS 和 MINUS 探针从冰箱中取出并涡旋。
2.通过在试剂盒中提供的抗体稀释剂中按 1:5 稀释 PLA PLUS 和 MINUS 探针来制备 PLA 探针混合物。制备足够的 PLA 探针溶液，每个盖玻片使用 40 μL 。
a.对于一张盖玻片 (40 μL )：在 24 μL抗体稀释液中稀释 8 μL PLUS 和 8 μL MINUS 。
3.将与一抗一起孵育的盖玻片放回 24 孔板中，并在室温下在摇杆上用 PLA 洗涤缓冲液 A 洗涤两次，每次 5 分钟。
4.将一块新的封口膜放入手工制作的加湿室中，并为每个盖玻片添加 40 μL滴 PLA 探针混合物。
5.将盖玻片添加到液滴顶部，包含细胞的一侧朝下。
6.将加湿室放入 37°C 培养箱中 1 小时。

D.结扎

1.将盖玻片放回 24 孔板中，并在室温下在摇床上用 PLA 洗涤缓冲液 A 洗涤两次，每次 5 分钟。
2.×连接缓冲液来制备 PLA 连接混合物，并向混合物中添加连接酶（1:40 稀释度）。
a.对于一张盖玻片 (40 μL )：用 31.2 μL Milli-Q 水和 1 μL连接酶稀释 7.8 μL 5 ×连接缓冲液。
b.等到孵育前立即添加连接酶。
3.将一块新的封口膜放入手工制作的加湿室中，并为每个盖玻片添加 40 μL PLA 连接混合物液滴。
4.将盖玻片添加到液滴顶部，包含细胞的一侧朝下。
5.将加湿室放入 37°C 培养箱中 30 分钟。

E.放大

注意： Amplification Red 检测试剂盒中的荧光团的激发/发射波长分别为 594 nm/624 nm，可以使用德克萨斯红滤光片进行检测（参见第III部分）。还提供替代检测荧光团，例如扩增绿、橙色和远红。
1.将盖玻片放回 24 孔板中，并在室温下在 PLA 洗涤缓冲液 A 中在摇床上洗涤两次，每次 2 分钟。
2.×扩增缓冲液来制备 PLA 扩增混合物，并将聚合酶（1:80 稀释）添加到混合物中。
a.对于一张盖玻片 (40 μL )：用 31.6 μL Milli-Q 水和 0.5 μL聚合酶稀释 7.9 μL 5 ×扩增缓冲液。
b.等到孵化前立即添加聚合酶。
3.将一块新的封口膜放入手工制作的加湿室中，并为每个盖玻片添加 40 μL PLA 扩增混合物液滴。
4.将盖玻片添加到液滴顶部，包含细胞的一侧朝下。
5.将加湿室放入 37°C 培养箱中 100 分钟，避光。

F.安装

1.将盖玻片放回 24 孔板中，并在室温下在摇床上用 PLA 洗涤缓冲液 B 洗涤两次，每次 10 分钟。
a.将铝箔放在 24 孔板上，保护样品免受光照。
2.× PLA 洗涤缓冲液 B中洗涤 1 分钟。
3.μL安装介质将盖玻片安装在显微镜载玻片上。
4.让盖玻片在室温下避光干燥 10 分钟。
5.使用透明指甲油将盖玻片的边缘密封到载玻片上。避免盖玻片下夹有气泡。
6.将载玻片在 4°C 的黑暗条件下保存最多四天，或在 -20°C 下保存六个月。

第三部分：成像和分析

A.影像学

1.通过共聚焦显微镜观察荧光信号（图 4）。

图 4. 显示多个邻近结扎测定 (PLA) 点的单个血管平滑肌细胞的代表性图像。每个红点代表两个一抗在 40 nm 范围内与其各自的蛋白质结合的位点。 A. 德克萨斯红通道（激发波长 592），其中 PLA 点可见。 B. 血管平滑肌细胞的明场图像。 C. 细胞核的 DAPI 染色（激发波长 353）。 D. A、B 和 C 的合并图像。比例 = 5 µm

2.使用适当的显微镜设置。
a.×油浸物镜捕获图像。
b.选择用于核检测的 DAPI 滤光片和用于 PLA 点检测的德克萨斯红滤光片。要可视化细胞轮廓和对比度，请在显微镜设置中包含明场成像通道（图 4）。
c.确保每个实验应用一致的激光设置。
3.捕获单个细胞的完整 z 堆栈图像。每个盖玻片可以捕获多个细胞。
4.为了进行定量比较，从至少三个生物重复中捕获至少 30 个细胞的 PLA 信号。
a.包括阴性对照样品作为实验的一部分。合适的阴性对照可能涉及使用两种已知没有共定位的蛋白质靶向抗体，因此不应产生信号。或者，考虑使用蛋白质敲低细胞进行额外的控制措施。正如我们研究中所实施的，另一种适当的对照涉及仅使用一种一抗。

B.数据分析

注意：分析每个细胞内荧光 PLA 点的数量。根据所需的方法，PLA 点可以在单个中间细胞 z 平面上进行量化，或者在包围整个细胞的最大强度投影上进行量化。
1.在 ImageJ 中打开图像文件。确保在单独的窗口中打开 PLA 点、DAPI 和明场图像，而不是使用合并的通道文件。您可以通过选择“拆分通道”选项来实现此目的（图 5A）。

图 5.ImageJ 中的数据分析。 A. 在 ImageJ 中打开显微镜图像的特定设置。 B. 用于可视化清晰点同时最小化背景的阈值参数示例。 C. 数据输出示例，显示每个 z 堆栈的点数，每行对应于不同的堆栈。

2.现在将打开代表 PLA 点、DAPI 和明场的三个单独窗口。关闭 DAPI和明场窗口，以便只有 PLA 点窗口保持可见。
3.在 ImageJ 浏览器中，选择图像>调整>阈值。
4.通过单击并从左向右拖动上方的栏来调整阈值参数，直到点变得清晰可见并且背景被删除。确保下部栏一直设置到右侧（图 5B）。
5.要计算点数，请在 ImageJ 浏览器中选择“分析” > “分析粒子” 。
6.调整颗粒分析的尺寸参数，调整最小和最大尺寸。
a.对于我们的实验，我们通常选择 0.3 至 3 微米^2 的粒径范围。超出此范围的颗粒将被排除在计数之外。根据具体要求调整这些参数。
7.选择汇总选项并单击确定。
a.要在 PLA 图像窗口中标记计数的粒子，请选择“添加到管理器”选项，然后单击“确定” 。
8.ImageJ 现在将提供处理所有图像的选项。通过选择“是” ，ImageJ 将对每个堆栈的 PLA 点进行计数，并生成每个堆栈的点数的输出数据文件（图 5C）。如果应计算某个特定堆栈的 PLA 点的数量，请选择“否”，ImageJ 将计算您当前在 PLA 图像窗口中选择的堆栈的点数。
9.要比较不同条件下（例如对照或药物处理的细胞）每个细胞的 PLA 点的平均数量，请将每个生物复制的点计数添加到 GraphPad PRISM 中。使用嵌套 t 检验分析数据集，以测试药物治疗是否对两种蛋白质之间的相互作用数量有影响。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：
•范德霍斯特等人。（2021）。动力蛋白调节 Kv7.4 通道从细胞膜的运输。 J. Gen. Physiol。（图3F 、6C、7B&C 和 8A）。

致谢

这项工作得到了灵北基金会的资助（授予 TA Jepps R323-2018-3674 ）。我们感谢哥本哈根大学集成显微镜核心设施在荧光显微镜方面提供的技术援助。此外，该协议改编自 van der Horst 等人的先前工作。 [5]。

利益争夺

没有需要声明的竞争利益。

参考

1.Day，注册护士和戴维森，MW (2012)。用于 FRET 显微镜的荧光蛋白：监测活细胞中的蛋白质相互作用。生物论文 34（5）：341-350。 https://doi.org/10.1002/bies.201100098
2.Bajar, B.、Wang, E.、Zhang, S.、Lin, M. 和 Chu, J. (2016)。荧光蛋白 FRET 对指南。传感器16(9)：1488。https: //doi.org/10.3390/s16091488
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