材料与试剂

生物材料

1.RAW 264.7小鼠巨噬细胞样细胞（ ATCC，目录号：TIB-71）
2.NIH3T3 小鼠胚胎成纤维细胞（ATCC，目录号： CRL-1658）
3.pSp-Cas9（BB）-2A-Puro（PX459）质粒（Addgene，目录号： 62988）
4.pUC19质粒（Addgene，目录号： 50005）

试剂

1.Neon 转染系统 100 μL试剂盒（Thermo Fisher，目录号：MPK10025）
2.HyClone TM经典液体培养基，Dulbecco 改良的 Eagles 培养基，高葡萄糖，GE 医疗细胞培养物 (DMEM)/高：含 4500 mg/L 葡萄糖和 4.0 mM L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠（VWR，目录号：16750-072）
3.胎牛血清（FBS）（Fisher，目录号：MT35010CV）
4.DPBS，无钙，无镁（Thermo Fisher ，目录号：14190250）
5.青霉素-链霉素溶液，100 × ，10,000 IU 青霉素，10,000 μg /mL 链霉素（Fisher，目录号：MT30002CI）
6.Gibco DMEM，高葡萄糖，不含谷氨酰胺，不含酚红（Thermo Fisher，目录号：31053036）
7.Gibco L-谷氨酰胺（200 mM）（Thermo Fisher，目录号：25030081）
8.T4 DNA 连接酶反应缓冲液（NEB，目录号：B0202S）
9.T4多核苷酸激酶（PNK）（NEB，目录号：M0201S）
10.10 × Tango 缓冲器（Thermo Fisher，目录号：BY5）
11.二硫苏糖醇（DTT）（Millipore Sigma，目录号：D9799-5g）
12.10 mM ATP（NEB，目录号：P0756S）
13.Bbs1-HF（NEB，目录号：R3539S）
14.T7 DNA 连接酶（酶学，目录号：L6020L）
15.高压灭菌的 MilliQ 水
16.NEB 5-α 感受态大肠杆菌（高效）（NEB，目录号：C2987I）
17.Opti-MEM 减少血清培养基（Thermo Fisher，目录号：31985070）
18.Lipofectamine 2000 转染试剂（Thermo Fisher，目录号：11668027）
19.嘌呤霉素二盐酸盐（Millipore Sigma，目录号：P8833-25MG）
20.Macherey-Nagel Nucleobond Xtra Midi Plus EF 套件（Macherey Nagel，目录号：740422.5）
21.QIAprep Spin Miniprep 试剂盒（Qiagen，目录号：27104）
22.Zymo Quick-gDNA MiniPrep 试剂盒加盖柱（Zymo Research，目录号：D3024）
23.QIAquick 凝胶提取套件（Qiagen，目录号：28704）
24.Zymo DNA Clean & Concentrator-5 套件加盖柱（Zymo Research，目录号：D4013）
25.Phusion 高保真 DNA 聚合酶-100u（NEB，目录号：M0530S）
26.NEBuilder HiFi DNA 组装预混液（NEB，目录号：E2621S）
27.EDTA粉末（Sigma ，目录号： E9884）
28.HEPES 1 M（Gibco ，目录号： 15630080）
29.Luria Broth (LB)-羧卞西林琼脂平板，羧卞西林浓度为 100 μg /mL
30.卢里亚肉汤 (LB)
31.羧苄青霉素（Fisher BioReagents ，目录号： BP26485），库存为 100 mg/mL
32.康宁 0.25% 胰蛋白酶、0.1% EDTA 溶于 HBSS，不含钙、镁和碳酸氢钠； 6/PK 25-053-CI（Fisher ，目录号： MT25053CI）

解决方案

1.完整的 DMEM（参见食谱）
2.条件 DMEM（参见食谱）
3.无抗生素 DMEM（参见食谱）
4.0.1 M EDTA 溶液（参见配方）
5.FACS 分选缓冲液（参见配方）
6.无酚红 DMEM（参见食谱）
7.1,000× 嘌呤霉素溶液（参见配方）

食谱

1.完整的DMEM
试剂最终浓度数量或体积
HyClone TM DMEM 不适用445毫升
胎牛血清10%50毫升
青霉素-链霉素溶液，100×1%5毫升
全部的不适用500毫升
将所有成分混合并通过0.2μm过滤瓶（康宁）。

2.条件DMEM
试剂最终浓度数量或体积
RAW 264.7 培养物上清液（RAW 264.7 细胞从汇合板中以 1:8 密度在含有 10% FBS、1% pen/strep 的完全 DMEM 中分离，24 小时后收集上清液）50%100毫升
HyClone TM DMEM不适用69毫升
胎牛血清20%30毫升
青霉素-链霉素溶液，100x1%1毫升
全部的不适用200毫升
将所有成分混合并通过0.2μm过滤瓶（康宁）。

3.无抗生素DMEM
试剂最终浓度数量或体积
HyClone TM DMEM不适用450毫升
胎牛血清10%50毫升
全部的不适用500毫升
将所有成分混合并通过0.2μm过滤瓶（康宁）。

4.0.1 M乙二胺四乙酸
试剂最终浓度数量或体积
高压灭菌的 MilliQ 水不适用补足 50 mL
EDTA粉末0.1M1.46克
全部的不适用50毫升
要制备 0.1 M EDTA，请将 EDTA 粉末溶解在 45 mL 高压灭菌的 MilliQ 水中，完全溶解后加至 50 mL，总体积为 50 mL。使用前通过0.2 μm注射器过滤器 ( Acrodisc)过滤此溶液。

5.FACS分选缓冲液
试剂最终浓度数量或体积
磷酸盐缓冲溶液不适用47.75 毫升
EDTA 0.1 M（来自配方 4）1毫米500微升_
乙肝病毒1M25毫米1.25毫升
胎牛血清1%500微升_
全部的不适用50毫升
然后通过0.2 μm注射器过滤器 ( Acrodisc) 。
注意：FACS 分选缓冲液的其他成分可能也适用。

6.无酚红 DMEM
试剂最终浓度数量或体积
Gibco DMEM，不含酚红不适用440毫升
胎牛血清10%50毫升
青霉素-链霉素溶液，100×1%5毫升
L-谷氨酰胺 (200 mM)2毫米5毫升
全部的不适用500毫升
将所有成分混合并通过0.2μm过滤瓶（康宁）。

7.1,000× 嘌呤霉素溶液 (1 mg/mL)
试剂最终浓度数量或体积
高压灭菌的 MilliQ 水不适用补足至 10 mL
盐酸嘌呤霉素1毫克/毫升10毫克
全部的不适用10毫升
要制备 1,000 ×嘌呤霉素，请将二盐酸嘌呤霉素溶解在 9 mL 高压灭菌的 MilliQ 水中，完全溶解后加至 10 mL，总体积为 10 mL。使用前通过0.2 μm注射器过滤器 ( Acrodisc)过滤该溶液，并以 1 mL 等分试样储存在 -20°C下。

实验室用品

1.Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带细胞过滤器卡扣盖（Falcon，目录号：352235）
2.GenClone 96 孔细胞培养板平底孔，TC 处理（Genesee，目录号：25-109）
3.Falcon组织培养板24孔（Fisher，目录号：087721H）
4.GenClone 6 孔 TC 处理板（Genesee，目录号：25-105MP）
5.GenClone TC 处理皿，100 × 20 mm 通风（Genesee，目录号：25-202）
6.Acrodisc 注射器过滤器 0.2 µm Supor 膜，低蛋白结合，无热原，PN 4612（VWR，目录号：28143-310）
7.移液器吸头、血清移液器、Eppendorf 管、PCR 管、50 mL 锥形管、15 mL 锥形管、50 mL 注射器
8.细胞刮刀（例如，VWR，目录号：75799-934）
9.Corning ® 500 mL 真空过滤器/储存瓶系统，0.22 µm 孔径 33.2 cm² PES 膜，无菌（Corning，目录号：431097 ）

设备

1.Neon 转染系统（Thermo Fisher ，型号：MPK5000）
2.PCR 热循环仪（例如 Thermo Fisher，型号：ProFlex PCR 系统热循环仪）
3.血细胞计数器（例如，Hausser Scientific 血细胞计数器 Thermo Fisher，型号：S17040）
4.琼脂糖凝胶电泳装置
5.荧光显微镜（例如 Nikon，型号：Eclipse Ti）
6.FACS 机器（例如 BD，型号：FACSAria Fusion）
7.台式迷你离心机（例如，MyFuge，型号：Southern Labware C1012）
8.台式微量离心机（例如，Eppendorf，型号：5420）

软件和数据集

1.ApE（质粒编辑器）v3.1.3 2022 年 11 月 11 日。免费，但如果您愿意，您同样可以使用付费克隆软件，例如 SnapGene

程序

A.人 [12]的程序）（图 1）

图 1. 图表总结了此过程的步骤 A 中将完成的工作。我们将设计多个 gRNA，在本例中针对小鼠 IRF1 的 C 末端，将它们中的每一个克隆到 gRNA-Cas9 表达质粒中，并对它们进行测试以确定最佳引导 RNA（在本例中为 gRNA 1）。序列中的浅粉色或蓝色下划线表示 gRNA 序列，深粉色下划线表示每个可能的 gRNA 的 PAM 序列。所需的插入位点用黄色箭头标记，gRNA 1 的切割位点用紫色箭头标记。

1.设计指南 RNA
a.确定您想要在小鼠基因组中插入敲入序列的位置。对于内源基因标记，这应该紧接在内源 ATG 之后或紧接内源终止密码子之前。
b.从所需插入位点之前的 50 个碱基对到之后的 50 个碱基对中选择基因组 DNA 序列。
c.将此序列复制到 Crispor.tefor.net ( http://crispor.tefor.net/ )以设计指南。对于基因组，选择小家鼠mm10 或 mm39。要选择 PAM，请选择“20bp-NGG – Sp Cas9、SpCas9-HF1、eSpCas9 1.1”。
d.选择具有高特异性分数和尽可能高的切割效率分数的指南。您还应该进行优化，使其尽可能靠近所需的插入位点。您应该选择三个最有希望的指南（图 2）。
注意：很少有看起来完美的指南。这就是我们筛选三个指南的部分原因，以便您可以选择几个看起来有前途的指南，然后进行测试。切割效率预测算法并不适用于所有细胞类型或基因座，这也是我们测试指南的原因。

2.crispor.tefor.net ( http://crispor.tefor.net/ )的示例输出。选择所需敲入插入位置上游 50 bp 到下游 50 bp 的 100 bp 区域，将其输入 cirspor.tefor.net，然后分析可能的 gRNA 结果，根据具有高预测效率、高特异性得分，并尽可能接近您所需的插入位点。在此示例中，gRNA 1、2 和 3 最符合这些标准。

e.每个指南（来自 Eurofins、IDT 等）订购两种寡核苷酸（一种正向和一种反向）。对于正向寡核苷酸，将 CAACG 添加到引导序列的 5' 末端。对于反向寡核苷酸，取正向引导序列的反向互补序列（不包括添加的 CAACG），并在 5' 端添加 AAAC，在 3' 端添加 C。例如，如果您的引导序列是 ACCCTT...GGGCT，那么您将订购正向寡核苷酸 caacgACCCTT....GGGCT 和反向寡核苷酸 aaacAGCCC...AAGGGTc。
2.将 gRNA 寡核苷酸克隆到 pSpCas9-puro 质粒中
a.退火寡核苷酸。
我。根据制造商的说明，在高压灭菌的 MilliQ 水中将每个寡核苷酸稀释至 100 µM 。
二.在 PCR 管中，混合 1 µ L 的每个 gRNA 寡核苷酸（正向和反向）、1 µ L 的 T4 DNA 连接酶反应缓冲液、1 µ L 的 T4 PNK 和 6 µ L 高压灭菌的 MilliQ 水。轻弹管子并将其在台式迷你离心机中旋转。
三.将管放入热循环仪中，循环为37 ° C 30分钟，95 ° C 5分钟，以0.1 ° C/s下降至25 ° C ，在25 ° C保持1分钟，在4 ° C保持. 运行大约需要 1 小时。
四.暂停点：退火的寡核苷酸在使用前可以在-20 ° C下冷冻至少一年。
b.使用 Ran 等人中描述的标准一步限制性连接协议将退火的 gRNA 寡核苷酸克隆到 p SpCas9(BB)-2A-puro 质粒中。 [12]。
我。通过将 1 µ L 退火寡核苷酸（从上面）添加到 199 µ L 高压灭菌的 MilliQ 水中，以 1:200 稀释退火寡核苷酸。
二.在冰上的 PCR 管中准备 gRNA-Cas9 克隆反应。试剂混合后，用指甲轻弹试管，然后在台式迷你离心机中旋转。
成分体积（微升）
pSpCas9(BB)-2A-puro 质粒 (100 ng/ µ L)1
1:200 稀释寡核苷酸2
10× Tango 缓冲区2
DTT (10 毫米)1
ATP (10 毫米)1
Bbs1-HF0.5
T7 DNA 连接酶0.5
高压灭菌的 MilliQ 水12
全部的20

三.将此管在热循环仪中孵育六个循环（37 ° C 5 分钟，然后 21 ° C 5 分钟），然后保持在 4 ° C。此循环大约需要 1 小时。
四.暂停点：从热循环仪中取出后，可在-20 ° C下保存至少一年。
c.将此 gRNA-Cas9 反应的5 μL转化为 50 μL的NEB 5-α 感受态大肠杆菌（高效）。
我。将感受态细胞置于冰上 10 分钟。
二.将 5 µ L gRNA-Cas9 反应添加到细胞中，并通过敲击管轻轻混合。
三.将细胞 + DNA 在冰上孵育 15–30 分钟。
四.将细胞 + DNA 管在 42 ° C下热激 30 秒。
v. 将管子在冰上孵育 2 分钟。
六.将 200 μL LB 添加到管中。
七.在 37 ° C下以 300 rpm 的速度摇动 30-60 分钟。
八.置于 LB-羧苄青霉素琼脂平板上。
九.将 LB-羧苄青霉素板置于 37 ° C 培养箱中过夜。
注意：其他类型的感受态细胞也可能起作用。
d.从培养过夜的平板中挑取三个菌落，并在 LB + 羧苄青霉素的 5 mL 培养物中培养每个挑取的菌落。使用 QIAprep Spin Miniprep 试剂盒进行小量制备，从细菌中提取质粒，并使用通用 U6 引物对质粒进行测序，以确认正确的 gRNA 插入。将具有正确质粒序列的小量样品重新划线到新的 LB-羧苄青霉素平板上并培养过夜。
e.从重新划线板中挑选一个具有正确测序的菌落，并在 100 m L LB + 羧苄青霉素（因此添加 100 μL 1,000× 羧苄青霉素）的中度制备培养物中培养该菌落。培养物应在 37 ° C 下生长过夜，并以 300 rpm 的速度振荡。
f.使用 Macherey Nagel NucleoBond Midi Plus EF 试剂盒执行 midiprep，从 midiprep 培养物中提取质粒。按照试剂盒说明进行低拷贝质粒的中期制备。为了澄清和加载，我们将整个混合物加载到过滤器上（而不是先将其旋转出来）；对于最终的 DNA 浓度，我们使用终结器。我们用 600 µ L 提供的水进行洗脱。生成的质粒是 pSp-Cas9-puro gRNA 质粒，您将在后续步骤中使用它。
注意：可能会使用其他 midiprep 试剂盒，但重要的是最终 DNA 浓度较高，最好超过 1 μg / μL 。对于稍后转染到巨噬细胞中，DNA 不含内毒素也很重要，该套件实现了这一点。
3.测试gRNA切割效率
a.第 1 天，使用血细胞计数器对细胞进行计数，并将 2 × 10 5 NIH3T3 细胞每孔接种到完整 DMEM 的 6 孔板中。接种与您正在测试的 gRNA 相同数量的孔（通常为 3 个），加上 1 个孔作为未切割基因组 DNA 的对照孔，以及 1 个孔作为嘌呤霉素选择的对照孔。
注意：我们使用 NIH3T3 细胞来测试 gRNA 切割效率，因为它们可以高效率瞬时转染，因此在细胞仍表达瞬时选择标记时选择转染细胞。使用 Neon 系统转染的 RAW 264.7 细胞在转染后立即病情严重，无法使用嘌呤霉素进行选择。我们发现，在 NIH3T3 细胞中选择高效的 gRNA 对于在 RAW 264.7 细胞中创建基因敲入非常有效。
b.第二天（第 2 天），对于每个要测试的 gRNA，转染一个孔。
我。将 2.5 μg pSpCas9-puro gRNA 质粒 DNA 添加到Eppendorf 管中的125 μL Opti-MEM 中。
二.将 7.5 μL （与 DNA 的比例为 1:3）Lipofectamine 2000 转染试剂添加到第二个 Eppendorf 管中的125 μL Opti-MEM 中。
三.将 Lipofectamine + Opti-MEM 溶液添加到 DNA + Opti-MEM 溶液中，轻轻上下移液，并在室温下孵育 5 分钟。
注意：使用此溶液时要轻柔，因为 DNA-lipofectamine 复合物可能很脆弱。
四.将转染溶液滴加到孔中，轻轻倾斜板以混合，然后将板放回培养箱。
c.第 3 天，对孔进行胰蛋白酶消化，并将每个孔的全部内容物转移到完整 DMEM 中其自己的 10 cm 板中。对于 gRNA 测试板和嘌呤霉素对照板，在 10 mL 总介质中添加 10 μL 1 mg/mL 嘌呤霉素。
d.第 5 天，检查嘌呤霉素对照板并确认所有细胞均已死亡。用 DPBS 清洗 gRNA 测试板，并将新鲜的完整 DMEM（不含嘌呤霉素）添加到板上。将未切割的基因组 DNA 对照板分开，以便第二天汇合（通常为 1:3）。
e.第6天，使用胰蛋白酶收集细胞（gRNA测试细胞和未切割对照的每种条件），旋转成细胞沉淀，并储存在-80 ° C 。
4.从细胞沉淀中提取基因组 DNA
a.我们使用 Zymo Quick-gDNA Miniprep 试剂盒提取 gDNA；无论您喜欢哪种 gDNA 提取试剂盒都应该有效。
5.放大应发生剪切的区域
a.设计 PCR 引物，从所需切割上游约 300–600 bp 扩增到所需切割下游约 300–600 bp。
注意：我们使用PrimerBlast ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ )从 NCBI 鉴定引物对，目标为 20 bp 引物，退火温度为 60 ° C。
b.使用这些引物，通过从 gRNA 测试细胞以及对照未切割细胞中提取的 DNA 进行 PCR 扩增该区域。
注意：我们使用 NEB Phusion DNA 聚合酶和相关试剂，但替代聚合酶系统也可能有效。由于 Phusion 聚合酶需要的引物 Tm 与通常计算的 Tm 不同，因此我们使用 NEB Tm 计算器 (https://tmcalculator.neb.com/#!/main) 来计算我们将在 PCR 程序中使用的 Tm。我们使用热循环程序，98°C 30 秒，然后 30 个循环（98°C 10 秒，退火温度 30 秒，72°C 每千碱基 PCR 产物 1 分钟），然后 72°C 10分钟，保持在 4°C。
c.在 1% 琼脂糖凝胶上运行 PCR 产物以确认条带大小。
d.QIAquick 凝胶提取试剂盒从凝胶中凝胶提取 PCR 产物。
注意：任何凝胶提取套件都应该有效。
e.将凝胶提取的未切割对照和 gRNA 测试扩增子发送到您用于 PCR 的引物进行 Sanger 测序。
注意：有时，这些引物会是不好的测序引物；在这种情况下，您可以设计并订购额外的内部引物来对切割位点进行测序。
f.使用在线 Synthego ICE 工具 ( https://ice.synthego.com/#/ ) 评估 gRNA 切割效率。
注意：此工具比较未切割（对照）细胞和转染 gRNA 的细胞中的 .ab1 Sanger 测序文件，以确定 CRISPR 位点具有插入缺失的细胞比例。该软件还要求您输入用于该样本的引导序列。具有插入缺失的细胞比例与 gRNA 切割效率相关，这也是由软件计算的。该软件还准确显示形成了哪些插入缺失（图 3）。

图 3. 在线Synthego ICE 工具 ( https://ice.synthego.com/#/ )的示例输出，显示插入缺失百分比和敲除分数

g.选择尽可能接近您所需插入位点的最佳切割效率的 gRNA。
注意：我们选择切割效率最高（插入缺失百分比）的 gRNA，该 gRNA 尽可能接近我们所需的插入位点。根据我们的经验，任何高于 50% 的 indel 百分比通常就足够了，尽管我们还没有具体测试过使用得分为 40% 与 60% 的 gRNA 进行后续测试。我们已经看到 indel 分数低于 30% 的 gRNA 失败了，尽管我们不能将它们的失败具体归因于它们的低切割效率。在 IRF1 示例中，我们选择了 gRNA 1。

B.设计和构建 HDR 供体质粒

1.使用 NEB Phusion 聚合酶从 RAW 264.7 基因组 DNA 中扩增所需插入位点两侧的约 1 kb 同源臂。我们使用 Zymo Quick-gDNA Miniprep 试剂盒从野生型 RAW 264.7 细胞中提取 RAW 264.7 基因组 DNA。对于 N 端标记，插入位点应紧接在内源 ATG 起始密码子之后，对于 C 端标记，插入位点应紧接内源终止密码子之前。一旦确定了最佳 gRNA，就需要在供体质粒中对其 PAM 序列进行突变以避免重新切割。我们使用带有突出端的引物来添加新序列。如果 PAM 无法同义突变，则应在 gRNA 种子序列中进行至少 3 个同义突变，以防止 Cas9 重新结合。如果 PAM 位于 UTR 中，我们会进行文献检索，以确定它是否位于 UTR 中已知对监管很重要的区域；如果不是，我们只需改变 PAM 即可。如果 UTR 中存在已知的监管，我们会尽力避免对该区域进行突变。所需的荧光蛋白插入序列还需要通过 PCR 从含有该荧光蛋白的质粒中扩增。我们在 pUC19 主干中使用 Gibson 组装来组装质粒，因此在需要时也在我们的引物上添加适当的 Gibson 突出端。这通常会导致由质粒骨架、左同源臂、右同源臂和荧光蛋白组成的四部分吉布森组装反应（图 4）。

图 4. 同源定向修复 (HDR) 供体质粒的构建图。该质粒由左同源臂、接头序列、荧光蛋白标签和右同源臂组成。这些序列中的每一个都必须从基因组 DNA（对于同源臂）或荧光蛋白质粒（对于荧光蛋白）进行 PCR 扩增。由于这是 C 末端标签，因此荧光蛋白直接插入内源终止密码子之前。灰色阴影表示同义突变 gRNA 识别序列的过程，以防止进一步的 gRNA 结合而不改变蛋白质序列。供体质粒中掺入的同源臂包含该突变序列，并且突变碱基在该图中用星号标记。每个同源臂的长度应约为 1 kb。

笔记：
a.您可以使用不同的 PCR 化学方法，但我们建议使用高保真 PCR 酶，因为整个质粒具有正确的序列非常重要。
b.对于 N 末端标记，请确保荧光蛋白标签上不包含终止密码子。
c.我们使用PrimerBlast（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ ）来设计我们的克隆引物，目标是20 bp引物和60 ° C的退火温度。
d.我们使用限制性酶消化 2 μg pUC19 主链。然后，我们在琼脂糖凝胶上运行此消化的骨架以及我们的三个 PCR 片段（左同源臂、右同源臂和荧光蛋白标签），使用 Q IAquick 凝胶提取试剂盒凝胶提取条带，在 30 µ L中洗脱，然后通过 Zymo DNA Clean & Concentrator-5 试剂盒运行该产品，并在 12 μL Zymo 洗脱缓冲液中洗脱。这种两步纯化可产生更清洁、浓度更高的 DNA，从而提高我们手中 Gibson 组装的效率。我们使用每个 DNA 片段 100 ng 进行 Gibson 组装反应，并使用 NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix，在 50 ° C 下孵育 1 小时。我们将 Gibson 克隆设计为每两个 DNA 片段之间有约 23 bp 的重叠。
e.在内源蛋白和荧光标签之间的质粒中添加接头或 T2A/P2A 序列，则在设计 PCR 时，也可以将它们引入到引物尾部。我们使用 Nora 等人的 T2A 序列。 [6] 和一个具有 DNA 序列 GGCGACGGCGCCGGCCTGATCAAC 的 GDGAGLIN 连接子。
2.将克隆的质粒（吉布森组装后）转化为NEB 5-α 感受态大肠杆菌（高效），如上所述。
3.培养四个小量制备物，对小量制备物进行测序，并确定具有正确测序的小量制备物。您需要确保整个同源臂和插入序列都是正确的。
4.使用正确的测序培养质粒的中期制备培养物，并使用 Macherey Nagel NucleoBond Midi Plus EF 试剂盒以与上述 gRNA-Cas9 质粒相同的方式进行中期制备。
注意：质粒浓度最好高于 1 μg / μL 。如果低于 500 ng/ μL ，我们建议重复中提。
C.将 gRNA-Cas9 质粒和供体质粒转染至 RAW 264.7 细胞中（图 5）

注意：我们使用 Neon 转染系统而不是任何形式的脂转染，因为在我们手中，Neon 转染系统在 RAW 264.7 细胞中比任何脂转染方法具有更高的转染效率。参见一般注释 6。

图 5. 步骤 C 和 D 的图示。我们将 gRNA-Cas9 和同源定向修复 (HDR) 供体质粒转染到细胞中，培养转染的细胞，使用 FACS 将单个阳性转染细胞分选到各个孔中，然后培养克隆用于进一步筛选。

1.在转染当天准备好 10 厘米的 RAW 264.7 细胞汇合板。
2.将 6 孔板的三个孔填充各 2 mL 的不含抗生素的 DMEM。
注意：此处使用不含抗生素的 DMEM 很重要，因为培养基中含有抗生素会降低转染后细胞的活力。
3.在 Eppendorf 管中，结合 45 μg gRNA-Cas9 质粒和 45 μg供体质粒。理想情况下，供体和 gRNA-Cas9 质粒浓度均超过 1 μg / μL 。
a.在此方案中，我们一式三份转染，因此每次转染每个质粒15 μg 。
注意：我们尝试了不同比例的 gRNA-Cas9 DNA 与供体 DNA、不同体积的 DNA、用 DMSO 预处理细胞、用干扰素-γ 预处理（因为我们的基因是干扰素-γ 诱导型，其想法是在其位点），并且转染后接种到含有 2 μM M3814 的培养基中（ M3814是一种 DNA-PK 抑制剂，可以增加 HDR 编辑与 NHEJ 编辑的比率 [13]）。添加更多 DNA 会降低转染后的细胞活力，并且我们发现 DMSO 预处理或 M3814 后处理几乎没有影响。因此，我们选择不对实验中的细胞进行预处理或后处理。
注意：我们在转染前没有对质粒进行线性化，但我们没有测试线性化如何影响转染或敲入效率。我们没有尝试质粒线性化的一个原因是担心在此过程中可能引入内毒素。因此，我们转染环状质粒DNA。
4.设置 Neon 转染系统机器，将其编程为 1,680 V、20 ms 、1 脉冲，并使用 Neon 电穿孔试剂套件中的 3 mL 缓冲液 E2 设置 Neon 比色皿。
5.准备一个带有 1 mL DPBS 的 Eppendorf 管，用于清洗霓虹灯尖端。
6.将 7.5 × 10 6 RAW 264.7 细胞以 200 × g旋转 3 分钟，并吸出上清液。
a.在此方案中，我们一式三份转染，因此每次转染为 2.5 × 10 6 个细胞。
7.将细胞重悬于 1 mL DPBS 中，再次离心，并吸出上清液。
8.将细胞重悬于Neon 电穿孔试剂盒中的300 μL R 缓冲液中。
注意：该试剂盒表示，延长 R 缓冲液暴露时间可能对细胞有害，因此在执行此步骤后请迅速采取行动。
9.将 R 缓冲液中的细胞添加到含有质粒 DNA 的试管中，并轻轻地上下移液 3-5 次。
10.使用 Neon 移液器上的 100 μL吸头吸取 100 μL细胞-缓冲液-DNA 溶液。确保尖端没有气泡。
11.将吸头放入霓虹灯比色皿中，然后向下推，直至听到咔哒声。
12.按程序上的“开始” （1,680 V，20 ms ，1 个脉冲）。
13.程序完成后，将吸头的内容物轻轻喷射到不含抗生素 DMEM 的 6 孔板的一个孔中。
14.将移液器吸头插入 DPBS 管中，上下吹打 DPBS 5 次以清洗。
15.重复步骤C10-14两次，总共进行 3 次转染，每次转染接种到一个新孔中。
16.所有转染完成后，来回摇动细胞板以使细胞均匀分布。
17.将细胞板放入组织培养箱中。
18.把霓虹机收起来。根据 Thermo Fisher 的说法，吸头不可重复使用，比色皿只能重复使用几次。根据我们的经验，吸头可以重复使用至少五次，但我们为构建的每个新细胞系使用新的吸头以避免污染。为了储存吸头，我们将它们放入 15 mL 锥形管中。重复使用前至少 24 小时，我们使用镊子将内部金柱塞与外部塑料分开，将柱塞和塑料放回 15 mL 锥形管中，并添加过滤的 100% 乙醇至少 2 小时。然后，我们将它们放在组织培养罩中的 Kimwipe 上，在紫外线灯打开下干燥 1 小时。我们还重复使用比色皿至少五次，尽管有时我们确实会看到使用旧比色皿转染后细胞活力下降。我们将比色皿存放在装有过滤后的 100% 乙醇的 50 mL 锥形管中，在重新使用之前，我们将其从锥形管中取出，并通过将其放在组织培养罩中的 Kimwipe 上并在紫外灯开启下干燥 1 小时。

D.培养细胞，分选单个阳性细胞，并从单个细胞培养克隆集落

1.电穿孔两天后，检查细胞活力。可能有许多漂浮的细胞，其中许多细胞已经死亡，但其中一些可能还活着。
注意：转染后的细胞活力可能因多种因素而有很大差异。它可能取决于电穿孔前的细胞健康状况、试剂的使用期限（缓冲液、比色皿等）以及 DNA 的性质和纯度。我们在同一天将相同的 DNA 平行电穿孔到两个不同的 RAW 264.7 系中，并且它们之间的转染后活力非常不同。我们还在同一天将不同的 DNA 电穿孔到同一细胞系中，并且具有不同的活力。转染后两天，具有良好活力的电穿孔看起来像是细胞约 50% 汇合的孔，但细胞比正常情况下更长，因此此处 50% 汇合的细胞数量少于正常情况下 50% 汇合的细胞数量。生长 RAW 264.7 细胞。活力较差的电穿孔底部看起来像稀疏的单细胞。然而，我们仍然看到在转染后活力较差的情况下成功进行基因组编辑。
2.使用细胞刮刀，然后用力将介质移至孔底部，以收集所有三个孔中的所有细胞。将这些合并到一个 15 mL 锥形管中，以 200 × g旋转锥形管3 分钟，并吸出上清液。
3.将细胞重悬于 2 mL 完整 DMEM 中，并将该悬浮液放入 6 孔板的新孔中（因此您现在已将三个孔合并为一个孔）。
4.监控油井直至其达到汇合；这通常需要 2-5 天，具体取决于细胞活力。
5.将这些细胞扩展到汇合的 10 厘米板中。
6.我们喜欢首先在显微镜下检查细胞，看看它们是否表达敲入的荧光蛋白，然后再对它们进行分选。为此，我们将这些批量转染的细胞铺在 6 孔板的两个孔中，并在 24 小时内每小时对每孔 60 个位置进行成像，并在 2 小时后添加刺激诱导基因的刺激。如果您看到荧光表达，那就太棒了！如果没有，有时实际的基因敲入非常罕见，您只能通过 FACS 发现它们；我们曾经遇到过这样的情况：通过显微镜看不到荧光，但通过 FACS 确实拾取了正确编辑的细胞。确保仅对批量转染群体的一小部分进行成像，并将大部分保留在培养箱中以准备分选（图 6）。

图 6. 批量转染细胞生长至汇合后成像的视野样本，其中基因已用 YFP 标记。在这个视野中，有一组在刺激后表达YFP的细胞，这就是我们要寻找的编辑后的细胞。还有许多细胞不表达YFP。

7.将单个阳性细胞分选至 96 孔板中。
注意：我们一般在转染后 7-9 天进行分选。有时，细胞需要更长的时间才能充分生长；那也没关系。
a.用任何应表达荧光敲入的刺激物诱导 10 cm 板的转染细胞。如果是组成型表达，则跳过此步骤。
b.准备两个 96 孔板，每孔含有 100 μL的条件 DMEM。
注意：使用条件DMEM而不是常规DMEM会导致分选后单细胞更快地生长成集落，并且分选的单细胞存活并生长成集落的比例更高。这是该协议中的关键步骤。
c.收集诱导转染的细胞以及制备它们的细胞作为 FACS 门控的对照。
d.× g旋转3 分钟，重悬于约 3 mL 的 FACS 分选缓冲液中，并通过过滤器进入 FACS 管（ Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带细胞过滤器卡扣帽）。
e.将带有冰上细胞的 FACS 管带到 FACS 机器上。与转染前对照相比，阳性细胞的门控。此处出现一些误报是可以的，因为您将在后续步骤中进一步筛选克隆。将表达荧光蛋白高于对照的细胞分选到 96 孔板中，每孔一个细胞（图 7）。
注意：阳性细胞的比例通常非常小，通常在样本的 2% 到 0.01% 之间（有关此问题的更多讨论，请参见下文）。然而，这个部分通常足以恢复敲入细胞。

图 7. 分选阳性细胞时的 FACS 图示例。在此示例中，iRFP+ 亲本细胞被转染以敲入 YFP 标签。这些图显示了每个被分选细胞的 YFP 与 iRFP。左边是亲本细胞，右边是批量转染的细胞。 P5 是用于收集 YFP 高于亲本群体中任何细胞的阳性细胞的门。在此示例中，在大量转染细胞中，P5 占活单细胞群的 0.3%，占总细胞群的 0.2%。真正的 YFP 阳性人群可能会延伸到此处所示的 P5 门的左侧，但我们在此处绘制门是为了尽量减少误报。在其他情况下，可能值得采取一些假阳性以避免丢弃真阳性，并在稍后通过显微镜筛选克隆时筛选出假阳性。

8.将单个菌落培养成克隆群体。
a.分选七到九天后，在常规组织培养倒置显微镜下观察每个板，并识别其中生长有菌落的孔。
注意：我们通常有 30% 到 60% 的孔有生长中的菌落。
b.使用荧光显微镜，对通道中您希望看到敲入荧光的每个生长菌落进行成像。
c.如果您正在寻找刺激响应表达，请添加刺激，等待基因开启的适当时间，然后再次在荧光显微镜上成像。
d.根据荧光图像，识别荧光阳性的克隆。我们通常还会根据菌落大小进行筛选，并选择较大的菌落。选择 12 个菌落进行培养（图 8）。
注意：通常，如果编辑有效，您筛选的大多数（~70%–100%）克隆都会呈荧光阳性。如果编辑不起作用并且您最终对假阳性进行了排序，那么没有克隆将是阳性的，或者即使没有诱导诱导基因，那些克隆也将是阳性的。

iRFP +) 背景中敲入 YFP 标签的阳性克隆和阴性克隆

e.当96孔板中的菌落变大时（一般分选后10-12天；等到培养基变黄就可以，但如果选择等那么久，则应在之后立即移动菌落），使用 P200 移液器用力吹打培养基以移出集落并将细胞悬浮液移至 24 孔板中。
f.继续生长，并在细胞汇合时将其从 24 孔板转移至 6 孔板至 10 cm 板。

E.筛选克隆

1.对于您培养的 12 个集落，从汇合的 10 厘米板中离心沉淀两个细胞沉淀，并储存在 -80 ° C 下。此外，冷冻细胞冷冻管，以便您可以回收以后想要使用的细胞。
2.从每个克隆的细胞沉淀中提取基因组 DNA；我们使用 Zymo Quick-gDNA 小量制备试剂盒。
3.使用 PCR 扩增插入位点从左侧到右侧同源臂的区域。我们使用我们设计的引物来确定上述 gRNA 切割效率。使用足够长的延伸时间来延伸插入的 DNA。我们还对未经编辑的野生型 DNA 进行了对照 PCR。
4.在凝胶上运行该 PCR 产物。注意条带：如果有两条带，则该克隆可能是敲入杂合的；如果只有一个大条带，则它很可能是敲入纯合的；如果只有一个小带，则可能没有敲入（图 9）。

图 9. 筛选凝胶的卡通示例。野生型未编辑细胞有一条小条带，未插入敲入的克隆有一条小条带，纯合敲入有一条大条带，杂合性敲入有一条大条带和一条小条带。

5.使用 QIAquick 凝胶提取试剂盒凝胶提取 DNA 的每个条带，并将每个条带送去测序，以对整个扩增子进行测序。我们使用 PCR 所用的相同引物进行测序。
6.分析该测序数据。对于小条带，目标是 DNA 序列与未切割的基因组 DNA 相同，而不是使用非同源末端连接进行切割和修复以产生插入缺失。对于大条带，目标是精确查看按照您设计插入的荧光蛋白的内源序列。在纯合敲入中，如果两个等位基因略有不同，有时会导致 .ab1 测序文件具有重叠峰，因为其中有两个序列。在这种情况下，从另一侧测序或内部引物会有所帮助。您还希望任何纯合敲入都相同，因此具有重叠峰测序的克隆可能不是最佳选择，您可以丢弃它们（图 10）。

图 10. 具有这些重叠峰的 Sanger 测序色谱图示例。这个例子来自标记 CXCL10（而不是用于本协议其余部分的 IRF1 示例），因为我们在 IRF1 中没有纯合敲入，并且从未在那里看到这种重叠峰现象。根据该色谱图，我们选择不再继续研究该特定克隆。箭头指向重叠峰的特定区域。

7.选择具有正确插入序列的克隆以进行进一步筛选。
8.对于其余的筛选，筛选方式取决于您标记的基因功能是什么以及您要寻找什么。对于诱导基因，我们筛选荧光诱导并选择在所有克隆中具有代表性荧光的克隆。我们还进行 qPCR 和蛋白质印迹，以确认标记等位基因的近内源 RNA 和蛋白质表达水平和时间。如果标记的基因具有功能（例如作为转录因子），我们就筛选基因功能；对于转录因子，这意味着确认转录因子下游的基因表达处于接近内源的水平。
9.根据所有这些数据，选择您喜欢的克隆并使用该克隆。

F.设置成像实验

1.在您想要成像的前一天（最好是大约 20 小时），将 4 × 10 4 个编辑过的 RAW 264.7 细胞播种到完整 DMEM 中 24 孔板的每个孔中。我们通过在 13 mL 培养基中准备一个含有 104 × 10 4 个细胞的试管，充分混合该试管，然后向每个孔中添加 500 μL该混合物。将细胞添加到所有孔后，在 TC 罩的地板上来回摇动板，足以真正搅动液体，但不足以使其溢出孔之间。这对于确保细胞均匀分布很重要。将板在组织培养箱中孵育约 20 小时，以使细胞沉淀在板上。
注意：此接种密度足以使细胞满意，但相对稀疏，因此细胞可以在培养箱中放置 20 小时，然后成像 48 小时而不会开始相互生长。您可能需要根据成像时间修改此密度。
2.在成像之前，吸出每个孔中的介质，并用 500 μL无酚红 DMEM 替换以进行成像。
3.将板带到显微镜并在显微镜上设置，包括温度和CO 2孵育。
4.选择曝光时间和频率；我们每 10 分钟拍摄一次相位和 iRFP 图像，以便每六个周期（每 60 分钟）在其他通道中进行跟踪和荧光，以最大限度地减少光毒性。
5.选择位置，确保位于每个孔的中间（应该看起来像背景最暗的部分）。我们每孔拍摄两张图像，总共 48 张图像；我们的显微镜无法在 10 分钟的图像频率内为每个孔拍摄更多图像。我们还以“S”模式穿过板，以避免平台不必要地来回移动板。
6.运行你的实验！

数据分析_

由于该协议描述了细胞系的创建，因此没有数据分析。

协议验证

我们使用该方案将几种不同的构建体插入 RAW 264.7 细胞中的 Tigre 和 Rosa26 安全港位点。此外，我们还用它来标记基因 IRF1、CXCL10、CXCL9、IRF8 和 GBP1，所有这些都是第一次尝试。我们曾尝试使用此协议（及其相关的故障排除步骤）来标记 NOS2 和 FCGR1，但没有成功，当我们标记 STAT1 时，其功能受到干扰。 Naigles 2023 的图 1A 中描述了一篇论文，该论文描述了一种细胞系，其中 EF1alpha-NLS-iRFP 敲入了IRF1、CXCL10 和 CXCL9 上的 Ti gre 位点和标签，并在那里得到了广泛使用 [11]。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.有一个 pSpCas9(BB)-2A-GFP 质粒可以用来代替 pSpCas9(BB)-2A-puro 质粒。这将允许通过 Neon 转染两天后表达 GFP 的细胞分数来目视评估细胞转染效率。如果担心转染效率低，这对于排除故障很有用。根据您的实验设计，如果您想在当时选择不使用嘌呤霉素的转染细胞，这也可能有用。使用 pSpCas9-GFP 质粒不会干扰下游筛选（即使是 GFP 插入），因为 GFP 的瞬时表达将在本协议中通过 FACS 筛选细胞时的 7-9 天时间点结束。然而，如果您尝试使用 pSpCas9-GFP 质粒评估转染效率，组成型表达 GFP 的细胞系将不是合适的背景，因为组成型 GFP 会掩盖 Cas9-GFP 构建体瞬时表达的 GFP。如果您在没有功能启动子的情况下敲入 GFP 构建体，则供体质粒的表达不会干扰通过筛选 Cas9-GFP 质粒的 GFP 表达来评估转染效率。然而，如果您的供体质粒表达 GFP 并包含 GFP 启动子，那么在转染后 2-3 天的时间点，您将看到 Cas9-GFP 和供体 GFP 构建体的表达。
2.在此方案中，在选择细胞成功敲入荧光蛋白之前，不会选择细胞进行成功转染。这意味着成功敲入呈阳性的细胞比例非常低，因为只有一小部分细胞成功转染，然后只有一小部分细胞成功进行了 CRISPR 切割和 HDR 修复。我们的初步实验表明，使用此处描述的 Neon 系统的转染效率约为 40%–60%，但荧光蛋白敲入基因座的细胞比例范围为 2% 至 0.01%，最常见的是 0.4% 左右–0.1%。这个 2% 到 0.01% 的范围足以从 FACS 中获得阳性细胞。可以使用嘌呤霉素来选择转染的 RAW 264.7 细胞，因为它们会暂时表达嘌呤霉素抗性。这种方法需要优化，以免转染后进一步降低细胞活力，但如果尝试敲入非荧光构建体，则值得尝试。
3.我们没有尝试线性化供体 DNA，因此无法评论这将如何影响 HDR 效率。我们没有这样做是因为担心引入内毒素，并且因为没有它，该协议足以满足我们的目的。
4.根据我们的经验，尽管付出了巨大的努力，我们仍然无法标记两个基因。虽然这些基因之一处于封闭染色质环境中，但我们已经成功标记了其他封闭染色质基因。在转染前用 DMSO 或干扰素-γ 预处理细胞以尝试打开该位点的染色质，但没有成功标记。一个基因具有正确的基因组序列，表明标记成功，但荧光太弱而无法成像。这使我们得出结论，荧光标记需要一定的最低水平的蛋白质表达才能成为有用的策略。
5.我们尝试了此处描述的 Neon 转染的许多变化，包括改变电穿孔设置、细胞数量和 DNA 数量。这里描述的协议最适合最大化敲入效率和最小化电穿孔后的细胞死亡。在我们确定了电穿孔设置和每次电穿孔的细胞数（2.5 × 10 6 ），我们尝试用DMSO预处理细胞24小时，用IFNγ预处理2小时，将供体DNA增加到30μg而不是15μg ，并将转染后的细胞铺板到含有2μg的培养基中MA3814 ，抑制 DNA 依赖性蛋白激酶 (DNA-PK)。 DNA-PK 在非同源末端连接 (NHEJ) 中发挥作用，一些研究表明，它的抑制会减少 NHEJ，从而促进 HDR 作为双链断裂后的解析途径[13-15] 。总的来说，我们发现用 IFNγ 预处理或使用 30 µg供体 DNA 会降低转染后的细胞活力，而 DMSO 预处理则不会。 DMSO 预处理 + 30 μg供体和无预处理 + 15 μg供体 + 平板接种到 M3814 培养基中的敲入率均略高于我们在此介绍的无预处理 + 15 μg供体情况。由于细胞毒性，我们选择不使用较高数量的供体 DNA，并且后来的实验显示接种到含有或不含 M3814 的培养基中的差异较小，这也促使我们选择停止使用 M3814。然而，如果需要专门提高 HDR 效率，那么使用 M3814 电镀到介质中值得尝试。
6.我们尝试了多种其他转染RAW 264.7细胞的方法，但在所有情况下，转染效率都比Neon系统差。当使用组成型荧光蛋白表达质粒测试转染效率时，FuGene 的转染效率为 5%–10%，TransIT-X2 的转染效率高达 30%，但更常见的是 10%，聚乙烯亚胺 (PEI) 的转染效率为 10%，使用聚乙烯亚胺 (PEI) 的转染效率为 20% Lipofectamine 2000，使用 GeneJet 时 <10%。对于所有这些方法，我们尝试了各种条件和 DNA：试剂比率，包括供应商针对 RAW 264.7 细胞建议的条件和 DNA：试剂比率。我们使用 Neon，因为它的转染效率更高（40%–60%）；然而，如果另一种瞬时转染方法适用于您手中的 RAW 264.7 细胞，那么它也可能可用于为这种内源标记方法递送质粒。

故障排除

该协议出现的主要问题是您执行了整个过程并且没有阳性克隆。在这种情况下，最好返回并确保前面的每个步骤都有效。以下是获得最终敲入所需的一些中间步骤。然而，如上所述，即使在故障排除后，我们也无法使用此协议标记一些位点。
步如何测试可能的修复方法
DNA 的 gRNA-Cas9 切割返回到测试 NIH3T3 细胞切割效率的数据；您还可以使用相同的方案在 RAW 264.7 细胞中进行测试，以防单核苷酸多态性 (SNP) 导致每种细胞类型的效率不同。选择不同的引导顺序。
氖转染使用组成型表达荧光蛋白的质粒确认转染效率。调整细胞或 DNA 的数量，确保细胞在转染前处于正常状态，尽量减少在 R 缓冲液中的时间，尽量减少细胞在试管而不是平板中的时间，尝试新的 Neon 吸头或比色皿，更换 Neon 缓冲液。
轨迹处的 HDR没有直接的方法来测试不良的 HDR，因为我们只在转染和 HDR 后进行筛选，但如果切割和转染效率良好，但仍然没有敲入细胞，这可能是由于该位点缺乏 HDR。值得尝试用 DMSO 或可打开您所在位点染色质的刺激物进行预处理，或用 M3814 接种到培养基中。如果您的基因可以选择标记另一个末端，那么也可能值得尝试，因为某些末端由于我们不明白的原因似乎很难标记。您还可以培养一些相对较亮的单细胞克隆，使用 PCR 扩增基因座，并分析测序，因为 HDR 可能是成功的，但荧光强度很低。

下面描述了可能发生的一些其他问题。
问题建议的解决方案
您只有杂合克隆并且想要纯合克隆尝试筛选更多克隆。根据我们的经验，大多数敲入要么都是纯合子，要么都是杂合子，但我们有一个案例（在安全港基因座），其中存在混合，可以通过筛选更多克隆来看到。
所有中间步骤都有效，但您仍然没有克隆这可能有多种原因。虽然有些基因我们从未能够标记，但这里我们提供了一些可以尝试的选项。 1) 该基因座处的染色质可能非常封闭，因此用可打开该基因座处染色质的物质（DMSO 或特定诱导剂，如果该基因是可诱导的）进行预处理可能会有所帮助。 2) 考虑尝试标记另一个终点站。 3) 基因可能表达太弱而看不到荧光，或者蛋白质可能太分散在细胞中以致荧光不可见。在这种情况下，一种选择是在内源蛋白和荧光蛋白之间添加T2A序列，并向荧光蛋白添加NLS以将荧光蛋白信号集中在细胞核中，从而制作转录报告基因。另一种选择是使用更亮的荧光蛋白或荧光蛋白的多个拷贝。通常，您可以通过分选相对较亮的细胞并通过 PCR 筛选这些菌落来评估是否有正确的标记但荧光较弱，以查看 DNA 序列是否插入到该位点 - 如果正确的 DNA 存在但您看不到荧光，它可能太暗了。
您的标记基因似乎功能受到干扰考虑标记另一个末端，添加更长/不同的接头，或添加 T2A，使其成为转录报告基因。您还可以研究较小的标签。

致谢

我们感谢 Murre 实验室使用他们的 Neon 转染系统，感谢许多朋友的建议并让我们在开发该方案时借用不同的转染试剂。我们感谢桑福德联盟人类胚胎干细胞核心的工作人员在细胞分选方面提供的帮助。这项工作得到了 NIH 资助的定量综合生物学培训补助金 (T32GM127235) 的支持，其中 BN 是实习生，以及 NIH F31AI161903（对 BN）、NIH R01GM111458（对 NH）和 NIH R01 GM144595（对 NH）。 JS 得到勃林格殷格翰基金会博士奖学金的支持。我们为 Naigles 等人[11]（量化单个巨噬细胞中的动态促炎基因表达和异质性）开发了该协议，并在该论文中广泛使用了通过该协议创建的细胞系[11]。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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