材料与试剂

生物材料

1.RPE-1亲代细胞系，已在实验室提供
2.RPE-1 表达内源性标记有 H2B-GFP 和微管蛋白 mRFP，已在实验室中使用
3.表达外源细胞周期蛋白B1-Venus的RPE-1细胞系（Jonathon Pines赠送）
4.表达 cyclinB1-Venus/tubulin-mRFP 的 RPE-1 细胞系，由我们实验室通过含有 pRRL-mRFP- α -tubulin 的慢病毒载体转导产生
5.shRNAi-ROCK1-LV 可耗尽 ROCK1（来自 João Relvas 的礼物）
6.表达外源 cGAS-GFP 的 RPE-1 细胞系（Matthieu Piel 赠送）
7.表达 GFP-NLS/微管蛋白-mRFP 的 RPE-1 细胞系，使用 pCDJ-NLS-copGFP-EF1-BlastiS 质粒通过慢病毒转导创建（Addgene，目录号：132772）
8.表达外源性 LBR-mCherry 和内源性 cyclinB1-Venus/LBR-mCherry 的 RPE-1 细胞系，通过使用质粒 pWPT LBR-mCherry（Stephen Royle 赠送）慢病毒转染产生
9.DN-KASH 质粒（埃德加·戈麦斯赠送）
10.Rap1Q63E 质粒（Jean de Gunzburg 赠送）

试剂

1.RO-3306（Santa Cruz Biotechnology，目录号： sc-358700A），在 9 mM 下使用 16 小时
2.Import唑（Helder Maiato 赠送），40 mM 使用 2 小时
3.Y-37632（Sigma-Aldrich，目录号： Y0503），在 5 mM 下使用 30 分钟
4.AACOCF3（TOCRIS，目录号： 1462），在 20 μM下使用30 分钟
5.BAPTA-AM（Abcam，目录号： ab120503），在 10 μM下使用15 分钟
6.2APB（Abcam，目录号： ab120124），在10μM下使用30分钟
7.对硝基-blebbistatin（MotorPharma，目录号： 1621326-32-6），在 50 μM下使用 30 分钟
8.ML-7（Merck，目录号： I2764），在 50 μM下使用30 分钟
9.细胞松弛素 D（Biogen Cientifica，目录号： TO-1233），在 0.5 μM下使用30 分钟
10.诺考达唑（Merck，目录号： M1404），在 3.3 μM下使用30 分钟
11.BI2536（Axon Med Chem，目录号： AXON 1129），在 200 mM 下使用 2 小时
12.依托泊苷（Selleck Chemicals CO.，目录号： S1225），在 1 μM下使用2 小时
13.胸苷（Sigma-Aldrich，目录号： T1895），以 2 mM 使用 16 小时，然后释放 10 小时
14.二甲亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号： D4540）
15.Lipofectamine 2000（Invitrogen，目录号： 11668019）
16.Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen，目录号： 13778150）
17.Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）（康宁，目录号： 10-013-CV）
18.胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号： 11550356）
19.纤连蛋白（FBN）（Sigma，目录号： F1141）
20.Leibovitz's-L15 培养基（Life Technologies，目录号：11415064）
21.抗生素抗真菌剂100 × （Life Technologies，目录号： 15240096）
22.结合硅烷（Sigma，目录号： M6514）
23.乙酸（冰）100%（Merck，目录号： 1.00063）
24.40%（w/v）丙烯酰胺储备液（Bio-Rad，目录号： 1610140）
25.2%（w/v）双丙烯酰胺储备液（Bio-Rad，目录号： 1610142）
26.PDMS交联剂A + B（Momentive，目录号： RTV615）
27.异丙醇（Merck，目录号： 1.09634）
28.水分子_
29.胰蛋白酶（TrypLE Express Enzyme 1 × ）（Thermo Fisher Scientific，目录号： 12605010）
30.台盼蓝溶液 0.4%（Gibco，目录号： 15250061）
31.碳酸氢钠（NaHCO 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号： S6014）
32.氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号： 31434）
33.氯化钾（KCl）（Merck，目录号： 1.04936)
34.磷酸氢二钠（ Na 2 HPO 4 ）（ Merck，目录号： 1.06586）
35.磷酸二氢钾（ KH 2 PO 4 ）（ Merck，目录号： 1.04873）
36.无水乙醇（Sigma-Aldrich，目录号： E7148）
37.盐酸（HCl）37％（ Merck，目录号： 1.00317）
38.氢氧化钠（NaOH）（Merck，目录号： 1.06498）

解决方案（见注1）

1.10% 乙酸（参见配方）
2.结合硅烷溶液（参见配方）
3.磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 10 × （参见注释 2）（参见食谱）
4.纤连蛋白 (FBN) 溶液（参见注释 3）（参见配方）
5.70% 乙醇（参见配方）

食谱

1.10%醋酸
试剂最终浓度数量或体积
醋酸（冰醋酸）100%10%（体积/体积）10毫升
无水乙醇不适用90毫升
全部的不适用100毫升

2.结合硅烷溶液
试剂最终浓度数量或体积
醋酸10%5%2.5毫升
结合硅烷0.3%15μL _ _
无水乙醇不适用2.485毫升
全部的不适用5毫升

3.磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 10 ×
试剂最终浓度数量或体积
氯化钠1.37米80克
氯化钾0.027米2克
Na 2 HPO 40.1M14.4克
KH 2 PO 40.018M2.4克
水分子_不适用补充体积为 1 L
全部的不适用1升

4.纤连蛋白 (FBN) 溶液
试剂最终浓度数量或体积
FBN25毫克/毫升25毫克
NaHCO 3 pH 8.6a100毫米加满体积为 1 mL
全部的不适用1毫升
a将 84 mg NaHCO 3 (MW = 84.01 g/mol) 稀释在 10 mL ddH 2 O 中，并将 pH 值调节至 8.6。室温保存。

5.70%乙醇溶液
试剂最终浓度数量或体积
无水乙醇70%700毫升
水分子_不适用补充体积为 1 L
全部的不适用1升

实验室用品

1.荧光皿（WPI，目录号：FD-35-100）
2.圆形玻璃盖玻片 10 毫米厚 #1.5（Fisher Scientific，目录号：NC1272767）
3.方形玻璃盖玻片 22 mm × 22 mm 厚度 #1.5（Corning，目录号：2850-22）
4.带有限制柱的微加工盖玻片
5.6孔细胞培养板（Corning，目录号：CLS3516）
6.6 孔静态限制器（4DCell，目录号：CSOW 620）
7.T25细胞培养瓶（Sarstedt，目录号：83.3910）
8.Scotch 魔术贴（3M、目录号： 8-1933 ）
9.Parafilm M（Fisher Scientific，目录号：10018130）
10.手术刀刀片或剃须刀刀片
11.精细镊子（Fine Science Tools，目录号：11254-20）
12.带微柱设计的 SU-8 模具（定制设计或从法国 MesoBioTech 订购）
13.Harris Uni-Core 打孔机（0.75 毫米）（WPI，目录号：504529）
14.一次性 5 mL 无菌移液器（nerbe plus，目录号：12-441-9105）
15.一次性 10 mL 无菌移液器（nerbe plus，目录号：12-461-9108）
16.一次性 50 mL 离心管（Corning，目录号：734-1868）
17.一次性 15 mL 离心管（Corning，目录号：734-1812）
18.细胞计数载玻片（Bio-Rad，目录编号： 1450011)

设备

1.温控 TE2000 显微镜，配备改进的横河 CSU-X1 转盘头（横河电机）、电子倍增 iXon+ DU-897 EM-CCD 相机（安道尔）和滤光轮（尼康）
2.浸油 60 × 1.4NA Plan-Apo DIC 物镜（尼康）
3.动态细胞限制器（改编自 Le Berre 等人 [7]）
4.AF-1 双真空/压力控制器 (Elveflow)
5.6孔限制装置（4DCell，法国）
6.低压等离子清洗机（Zepto，Diener Electronics，德国）
7.离心机
8.热板
9.酸碱度计
10.电子TC10 TM /TC20 TM细胞计数仪
11.真空脱气机（可选）
12.37 °C加湿CO 2 (5%) 培养箱
13.层流罩

软件和数据集

1.NIS Elements AR 软件（尼康）
2.ImageJ（版本 1.54）
3.用于核孔分析的定制设计 MATLAB 算法（The MathWorks Inc，美国；v2018b）

程序

A.细胞限制装置的准备（见注释 4）

1.准备 PDMS 吸盘（图 1A）
a.将 PDMS 交联剂 A 与 PDMS 交联剂 B 以 10/1 混合物 (w/w) 混合。
b.混合直至均匀，然后离心 (150× g ) 5 分钟以去除所有气泡。或者，在真空脱气机中将 PDMS 混合物脱气 5 分钟。
c.将混合物倒入定制模具的顶部（从 Le Berre 等人获得的设计说明。[7]）并让它在 80°C 的热板上烘烤 1 小时。
d.使用 Harris Uni-Core 打孔器（0.75 毫米）在 PDMS 吸盘侧面创建一个孔。

图 1. 准备动态细胞限制装置的总体工作流程。 A. 使用模具准备 PDMS 吸盘（Le Berre 等人提供的设计说明 [7]）。 B. 准备用于具有所需微柱高度的刚性约束的 PDMS 约束载玻片或用于弹性约束的聚丙烯酰胺 ( PAA) 约束载玻片。 C. 将限制滑块绑定到 PDMS 吸盘。 D. 将种子细胞置于 35 mm 培养皿中，预先涂有纤连蛋白(FBN)。 E. 取下 35 mm 培养皿的盖子，并将限制装置组装在培养皿顶部。打开真空泵以将限制装置固定到位并限制细胞。 F. 有丝分裂期间经历多轮动态压缩的细胞的代表性延时图像。延时拍摄时间为 2 分钟，比例尺为 10 毫米。

2.准备用于刚性约束的 PDMS 约束幻灯片（图 1B）
a.制备 PDMS 与交联剂 A/B 混合物的混合物，比例为 10/1 (w/w)。
b.混合直至均匀，然后离心 (150× g ) 5 分钟以去除所有气泡。或者，在真空脱气机中将 PDMS 混合物脱气 5 分钟。
c.对 10 mm 玻璃盖玻片进行等离子处理 2 分钟。此步骤将激活盖玻片的一侧，并促进下一步玻璃与 PDMS 层的结合。
d.将 PDMS 混合物滴分布在 SU-8 晶圆模具上，并具有所需高度（在本例中为 8 μm）的微柱，并在每个滴的顶部放置盖玻片，确保等离子体处理的一侧面向 PDMS。确保盖玻片下有非常薄的 PDMS 层非常重要。
e.将带有盖玻片的晶片在 95°C 的热板上烘烤 15 分钟。用异丙醇清洗并使用手术刀和镊子去除多余的 PDMS，小心不要刮伤 SU-8 模具。
f.将一滴异丙醇放在载玻片旁边的晶片上，以剥离限制载玻片。使用刀片或手术刀，小心地从晶圆上提起带有 PDMS 柱（8 μm 高度）的玻璃盖玻片。
3.使用 PAA 水凝胶准备限制幻灯片以进行弹性限制（图 1B）
a.限制载玻片在 10 mm 盖玻片上制备。盖玻片最初使用等离子清洁器用空气等离子处理 2 分钟。
b.清洁后，将盖玻片与 0.3% 结合硅烷 + 5% 乙酸的乙醇溶液一起孵育。将混合物铺在盖玻片顶部，并确保盖玻片的整个表面都被溶液覆盖。让溶液蒸发干燥。
c.用 70% 乙醇冲洗盖玻片一次，然后再次干燥。
d.准备相当于大约 15 kPa 硬度的凝胶混合物。完整的详细信息可参见 Le Berre 等人。 [7]。将一滴混合物 (25 μL) 放在封口膜条上，并在顶部放置硅烷化盖玻片（硅烷化面朝向混合物）。让凝胶聚合。
e.使用刀片或手术刀小心地将带有凝胶的盖玻片从石蜡膜上提起，确保凝胶仍然附着在盖玻片上。
f.用至少 1 mL PBS 水合凝胶 5 分钟，然后与细胞培养基一起孵育至少 30 分钟（参见注释 5 和 6）。

B.动态细胞限制

1.播种 RPE-1 细胞用于限制
a.使用等离子清洁器对荧光皿进行等离子处理（暴露在空气中 2 分钟）。
b.在干净的荧光皿上涂上 50 – 100 mL 的 FBN 至少 30 分钟。用 2 mL dH 2 O轻轻冲洗。
c.用 5 mL 室温 PBS 清洗 T25 烧瓶上生长的细胞。吸出 PBS，添加 2 mL 胰蛋白酶，并在 37°C 下孵育细胞 5 分钟（参见注释 7、8 和 9）。
d.轻轻上下吹打重悬细胞，收集细胞悬液，并添加 5 mL 新鲜培养基。
e.使用电子细胞计数器确定样品中的细胞数量。计算每个荧光皿推荐的接种密度 1.5 × 10 5 个细胞所需的细胞悬液体积。
f.将相应数量的细胞放入先前涂覆的氟盘中（参见注释 10），并添加 2 mL 补充有抗生素的细胞培养基（图 1D、E）。
g.让细胞在 37°C、5% CO 2的加湿培养箱中生长过夜。
h.一旦 RPE-1 细胞贴壁，必要时，根据制造商的说明，使用 Lipofectamine2000 或 Lipofectamine RNAiMAX 进行 DN-KASH、Rap1Q63E 或 shRNAi-ROCK1-LV 质粒的转染。
2.使用动态细胞限制器（图 1E、F）
a.成像前，将 RPE-1 细胞的培养基更换为补充有抗生素的 Leibovitz's-L15 培养基（500 μL，参见注释 11）。如果使用试剂部分（试剂 1-13）中描述的任何药物或其相应的 DMSO 对照，则应在此时添加它们，并按照试剂列表中的描述将细胞孵育相应的时间。
b.用吸水纸小心地擦干限制载玻片的背面，并将其连接到吸盘装置的活塞上。如果限制载玻片的玻璃面未完全干燥，它就不会粘在吸盘的 PDMS 活塞上，导致其在成像过程中分离。
c.将 PDMS 吸盘连接到真空发生器装置并将压力设置为零（参见注释 12 和 13）。
d.将装有 RPE-1 细胞的 35 mm 培养皿放在显微镜上。开始实验时，小心地取下荧光皿的盖子，将吸盘放在荧光皿的顶部，并将真空发生器的压力降低到-30毫巴，直到吸盘牢固地附着在荧光皿的底部，而无需压缩细胞。
e.开始成像。
f.降低真空发生器上的压力直至达到 -100 mbar。
g.在显微镜上确认细胞是否保持在焦点上并且压缩是否可见。
h.当向细胞中添加药物时，缓慢增加真空发生器上的压力，以使 PDMS 吸盘分离。
i.在不拆下 PDMS 吸盘的情况下，将药物添加到成像介质中，并通过轻轻上下移液小心混合。
j.要再次压缩细胞，请将真空发生器上的压力降低至 -100 mbar。
k.可以通过降低或增加真空管线上的压力随时调节限制（参见注释 12 和 13）。

C.静态细胞限制器

对于静态限制实验，我们使用市售的 6 孔限制装置和定制设计的限制载玻片（见注 4），该载玻片使用 10 mm 标准圆形显微镜盖玻片制备，并设计有规则孔阵列（直径 449 μm，间距 1 mm）），类似于 Le Berre 等人之前发表的内容。 [7] .

1.准备限制幻灯片
要准备约束载玻片，请使用上面步骤 A2 或 A3 中概述的相同方法，具体取决于您需要刚性约束还是弹性约束。
2.用于限制的种子细胞
a.根据您的需要，用空气等离子体对6 孔板或 22 mm × 22 mm方形盖玻片进行等离子体处理 2 分钟。
b.在 6 孔板或盖玻片上涂上 FBN（参见注释 10），并在室温下孵育至少 30 分钟。用 dH 2 O冲洗。
c.如果您的实验需要使用 22 mm × 22 mm 方形盖玻片，请使用细镊子在 6 孔板的每个孔中放置一个盖玻片。
d.用 5 mL 的室温 PBS 清洗细胞。弃去 PBS，添加 2 mL 胰蛋白酶，并在 37°C 下孵育细胞 3-5 分钟（参见注释 7、9 和 14）。
e.添加补充有FBS的新鲜DMEM培养基，重悬并收集细胞悬浮液。
f.使用电子细胞计数器确定样品中的细胞数量（参见注释 15）。计算每孔1.5 × 10 5 个细胞的推荐接种密度所需的细胞悬液体积。
g.将相应数量的细胞放入孔中，并添加 2 mL 补充有抗生素的细胞培养基（见注释 8）。
h.2的加湿培养箱中让细胞粘附到基质上。
3.6 孔限制装置的组装
a.用 70% 乙醇冲洗微制造的限制幻灯片，并用压缩空气风干。
b.用 70% 乙醇清洁静态限制器（4DCell、CSOW 620）随附的 PDMS 活塞。如果 PDMS 活塞有灰尘颗粒，请用 Scotch Magic 胶带将其清除，并用 70% 乙醇再次冲洗（参见注释 16）。
c.将 PDMS 活塞放在 6 井限制装置的盖子上。确保 PDMS 垫片与盖子上的孔对齐（参见注释 17）。
d.通过小心地将限制滑块的玻璃侧压在 PDMS 活塞上，将每个限制滑块连接到 PDMS 活塞。确保滑块位于活塞的中心，并避免在两个表面之间产生气泡。
e.为了平衡 PDMS，将包含 PDMS 活塞和限制滑块的限制装置的盖子放在常规 6 孔板上。确保限制装置设置为“静止位置”。添加足够的细胞培养基以浸没载玻片，并在 37°C、5% CO 2的加湿培养箱中孵育至少 1 小时（参见注释 18）。
4.使用静态限制器成像
a.使用细胞前约 30 分钟，将 RPE-1 细胞的培养基更换为补充有抗生素的 Leibovitz's-L15 培养基。
b.平衡 PDMS 限制载玻片（参见步骤 C3e）后，将限制装置的盖子转移到接种细胞的 6 孔板中。轻轻地向下拉动限制盖上的金属弹簧，将其固定在 6 孔板的底部。
c.将细胞放在显微镜上并开始成像。
d.要限制细胞，请同时轻轻按下限制盖两侧的锁。此时，盖子施加在 PDMS 活塞上的压力将导致细胞受到限制。
e.如果实验需要添加药物（试剂 1-13）或相应的 DMSO 对照，可以通过限制装置盖子上的孔添加它们（参见注释 17 和 18）。添加药物后，小心摇动 6 孔板进行混合。
f.要释放限制，请轻轻拉出 6 孔限制装置盖子上的锁。这将释放 PDMS 活塞上的压力。
5.使用静态限制器进行固定细胞分析
a.对于涉及固定细胞成像的实验，请按照前面部分（步骤 C1-C4）中提供的说明进行操作，直到向细胞添加固定剂。
b.通过限制装置盖子上的孔添加固定剂。或者，可以在释放限制后立即取下盖子并固定细胞。
c.将细胞与固定剂在室温下孵育 10 分钟。
d.固定后，使用标准免疫荧光方案来标记细胞。

数据分析

1.使用 ImageJ 对动态单细胞限制后的细胞参数进行量化。最初，通过测量细胞高度来确定限制效率。
a.使用 ImageJ 打开图像。
b.通过单击图像>调整>亮度和对比度>自动来调整亮度和对比度。
c.准备横向投影。单击图像>堆栈> 3D 项目。对 xz 和 yz 轴进行横向投影。
d.将横向投影合并到电影的 SUM 投影中。
e.通过确定横向投影中细胞占据的大小来测量细胞高度。选择高度最大限制为 8 毫米的单元格（参见注释 19）。
2.在我们的具体案例中，我们想要分析机械限制对细胞周期蛋白 B1 核转位的影响。为了量化细胞核内细胞周期蛋白 B1 的水平，使用了 ImageJ：
a.绘制一个小的感兴趣区域 (ROI) 并将其添加到管理器（编辑>选择>添加到管理器）。
b.通过选择“分析” > “测量”来测量细胞周期蛋白 B1 强度。将值复制到 Excel 工作表。
c.使用 Manager 中的相同 ROI，选择细胞外部的区域并测量背景荧光强度。将值复制到 Excel 工作表。
d.通过从 2b 中测量的细胞周期蛋白 B1 荧光强度中减去背景荧光强度来对荧光强度值进行背景校正。
e.通过将每个时间点的荧光强度除以细胞周期蛋白 B1 的最低强度水平来标准化核细胞周期蛋白 B1 荧光强度。
f.为了测量细胞周期蛋白 B1 核易位率，请将所有细胞的荧光值相对于最低核强度进行对齐。对应于最低核荧光强度的时间点定义为零。
g.为了将细胞周期蛋白 B1 易位与核膜透化 (NEP) 时间相关联，将荧光强度值标准化并相对于细胞核中微管蛋白的积累进行对齐，微管蛋白作为核屏障功能丧失的代表。

建议至少进行 3 次独立实验，每种条件至少分析 30 个细胞。使用柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验评估样本的正态性。在比较具有正态分布的多个组时，进行了参数单向方差分析 (ANOVA)。在其他情况下，进行非参数方差分析 (Kruskal-Wallis)。没有使用功率计算。有关数据分析的所有具体细节都可以在原始手稿中找到[6]。

协议验证

Dantas 等人使用并验证了该协议。 [6]。 doi：10.1083/jcb.202205051。图 1、2、3、5、S1、S2 和 S3 中使用了动态单元限制器。图 4 中使用了静态细胞限制器。
此外，该方案或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：
•勒贝尔等人。 [7] 二维细胞限制方法。方法细胞生物学。
•兰卡斯特等人。 [8] 有丝分裂变圆改变细胞几何形状，以确保有效的双极纺锤体形成。开发单元（图 1、4 和 6）。
•刘等人。 [9] 限制和低粘附力诱导缓慢间充质细胞的快速阿米巴迁移。细胞。
•马乌里等人。 [10] 肌动蛋白流介导细胞速度和细胞持久性之间的普遍耦合。细胞。
•勒贝尔等人。 [11] 核限制的精细控制确定了导致核膜破裂和特定基因诱导的阈值变形。整合生物（Camb）。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.如有必要，应使用 HCl 或 NaOH 仔细调节溶液的 pH 值。对于 NaHCO 3溶液，这是极其相关的，因为碱性 pH 值有利于 FBN 粘附到盖玻片上。
2.PBS 10×溶液的pH值应调整至7.4，然后对溶液进行高压灭菌。
3.重构后，FBN 溶液应在 4°C 下保存最多两周。
4.用于静态限制器的细胞限制器和细胞限制载玻片可以通过商业途径获得（4DCell）。动态限制器是在实验室中使用先前描述的协议的改编进行微加工的 [7]，以将限制器载玻片的直径调整为 10 毫米直径的盖玻片。根据实验目的调整设备和实验室用品。
5.用于创建限制载玻片的 PAA 水凝胶可以在 4°C 下保存一周，用 PBS 覆盖并用封口膜密封。
6.使用药物时，为每个实验条件准备一个新的吸盘，因为 PDMS 可以从细胞介质中吸收疏水性分子。清洗不足以有效地将它们从 PDMS 中去除。
7.应避免在细胞培养基中连续使用抗生素。仅在准备用于成像或固定细胞分析的细胞时才建议使用抗生素。
8.使用层流罩执行所有细胞操作方案。根据材料安全数据表 (MSDS) 指南准备、使用、储存和处置所有试剂。除非另有说明，用于细胞培养的所有培养基和缓冲液均应预热。
9.细胞应以低传代数使用，并经常检测可能的支原体感染。
10.对于 22 mm × 22 mm 盖玻片和荧光皿，使用 100 μL FBN 25 mg/mL；对于 6 孔板，每孔使用 500 μL FBN 25 mg/mL。对于其他尺寸，请相应调整音量。
11.使用动态细胞限制器时添加少量细胞培养基（通常小于 500 mL），以避免将培养基吸入连接到压力/真空发生器的真空管线中。
12.经常检查真空发生器的管道，以避免产生气泡。这将影响真空的产生，从而影响压缩效率。
13.经常校准真空/压力控制器。
14.根据细胞培养皿的尺寸，可以使用不同的体积。例如，对于 T75 烧瓶，使用大约 10 mL 的 PBS 进行清洗，使用 3 mL 的胰蛋白酶分离细胞，并使用至少 6 mL 补充有 10% FBS 的新鲜培养基来重悬细胞。
15.灰尘颗粒会干扰玻璃与 PDMS 的附着。确保玻璃彻底清洁。强烈建议使用 Scotch 魔术胶带，因为它可以有效去除灰尘，且不会留下残留物。
16.要使用自动细胞计数器对细胞进行计数，请制备 10 μL 细胞悬浮液和 10 μL 台盼蓝溶液的混合物。轻轻混匀，将 10 μL 涂在细胞计数玻片上。然后，将计数滑片放在电子计数装置上。
17.细胞限制装置的盖子上的孔允许移液器穿过玻璃板，并且可用于添加或吸出培养基和/或药物。如有必要，可以使用套件中提供的盖子封闭这些孔。
18.每当实验中使用药物时，都应在此孵育步骤中添加，因为 PDMS 可以吸收介质中的小分子。
19.限制实验在限制在最小 8 μm 高度的细胞中进行。这是 RPE-1 细胞在不诱导细胞死亡的情况下可以应对的最小高度。其他细胞类型需要进行测试。

故障排除

问题 1：吸盘未附着在 35 毫米盘上。
可能的原因：未产生真空。
解决办法：检查管道内是否有气泡。校准真空/压力发生器。检查吸盘的完整性，因为它需要平坦的表面才能工作。

问题2：单元高度变化且控制不准确。
可能原因：微柱高度不正确或PDMS层不平坦。
解决方案：检查 SU-8 模具的完整性，因为它会随着使用而恶化。确保在准备限制载玻片时使用非常薄的 PDMS 层，并均匀地按压整个盖玻片以确保其平放。

问题3：限制滑轨与吸盘分离。
可能原因：载玻片未干燥。
解决方案：在将限制载玻片连接到 PDMS 活塞之前，确保其玻璃面彻底干燥。任何湿气都会阻止玻璃与 PDMS 的结合。

致谢

该协议与论文相关： Dantas等人。 [6] “核张力通过调节细胞周期蛋白 B1 核易位控制有丝分裂进入”，最初发表于《细胞生物学杂志》(DOI: 10.1083/jcb.202205051)。
这项工作由葡萄牙基金在 PTDC/BIA-CEL/6740/2020 项目框架内通过 FCT-Fundação para a Ciência ea Tecnologia/Minisério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior 提供资助。

利益争夺

作者没有竞争利益。
道德考虑

不存在与该协议相关的道德考虑。

参考

1.Champion, L.、Linder, MI 和 Kutay, U. (2017)。有丝分裂进入期间的细胞重组。趋势细胞生物学。 27（1）：26-4。
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