材料与试剂

生物材料

1.C. glabrata T-1639，血液分离物（芬兰赫尔辛基赫尔辛基大学中央医院）。如果其他念珠菌属物种与光滑念珠菌细胞壁蛋白附着分子存在结构相似性，则可以通过这些方法进行研究。

试剂

1.沙氏葡萄糖琼脂（Lab M，目录号：LAB009）
2.裂解酶，10 kU （Sigma-Aldrich，目录号：37340-57-1）
3.2-甲氧基-2,4-二苯基-3(2H)-呋喃酮（MDPF）（Sigma-Aldrich，目录号：50632-57-0）
4.Precision Plus Protein TM标准品（ Bio-Rad，目录号：161-0373 ）
5.Tris碱（ Sigma，目录号：T-1378 ）
6.ZnCl 2 （Sigma，目录号：208086）
7.CaCl 2 （Sigma，目录号：10035-04-8 ）
8.Tween 80， BioXtra粘稠液体（Sigma，目录号：P8074）
9.Bacto TM酵母提取物（BD，目录号：212750）
10.蛋白胨， Bacto TM蛋白胨（BD，目录号：211677）
11.葡萄糖（默克，目录号：108337）
12.十二烷基硫酸钠（SDS）（Fisher Scientific，目录号：BP166-500）
13.叠氮化钠(NaN 3 )（ Merck，目录号：6688），用于离子交换柱的长期保存
14.考马斯亮蓝，Serva Blue R （ Serva Electrophoresis GmbH，目录号：35051 ）
15.四硼酸钠（STB）（默克，目录号：6308 ）
16.明胶（ Merck，目录号：1.04070 ）
17.丙酮（默克，目录号： 1.00658 )
18.Na 2 HPO 4 （ Sigma，目录号：137036 ）
19.KCl （ Sigma，目录号： PHR1329 ）
20.氯化钠（Fisher Scientific，目录号： FLS271500 ）
21.KH 2 PO 4 （默克，目录号：104871 ）
22.β-巯基乙醇（ Merck，目录号：M6250 ）
23.TEMED （默克，目录号：411019）
24.丙烯酰胺30% （默克，目录号：A3574）
25.乙醇、乙醇 anhydricum ，Aa （伯纳，目录号：13110124）
26.HCl 1 M（Riedel-de-Haen，目录号：30721）
27.HCl 37%（Sigma，目录号：258148）
28.NaOH 1 M （ Acros Organics，目录号： 15634890 ）
29.甲醇（ Fisher，目录号：M/4057/PB17）
30.乙酸（ Fisher，目录号：A/0400/PB17）
31.过硫酸铵（APS） 10% （ Sigma，目录号：A3678），以 100 µL 等份储存于 -20 °C
32.4x Laemmli 样品缓冲液（Bio-Rad，目录号 1610747）
33.甘氨酸（Merck，目录号：G8898）

解决方案

1.酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPG）（参见食谱）
2.MDPF-明胶（参见食谱）
3.酶凝胶的分离凝胶（下部）缓冲液（参见配方）
4.酶凝胶的堆积凝胶（上）缓冲液（参见配方）
5.8% MDPF-明胶 SDS-PAGE（参见配方）
6.SDS-PAGE电泳缓冲液 5 × （参见食谱）
7.Zymo缓冲液 10 × （参见配方）
8.Zymo凝胶孵育缓冲液（参见R配方）
9.考马斯亮蓝 (CBB) 0.1% （参见配方）
10.IEC 启动缓冲区（参见配方）
11.IEC 洗脱缓冲液 I （参见配方）
12.IEC 洗脱缓冲液 II （参见配方）
13.磷酸盐缓冲盐水 (PBS) （参见配方）
14.10% SDS （参见配方）
15.裂解酶原液（参见食谱）

食谱

使用 1 M NaOH 或 1 M HCl 进行 pH 调节。根据需要提前制备酶凝胶并根据配方制备溶液。建议准备双份的食谱 10-13。

1.酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPG）
0.5%酵母抽提物
1% 蛋白胨
1%葡萄糖
添加 Milli-Q 水 (MQ) 至 4 L
高压灭菌器 121 °C 15 分钟

2.MDPF-明胶
20 mM STB 溶液：每 50 mL MQ 0.3814 g STB，pH 9.2。
将 500 mg 明胶加入温水浴（约 37 °C）的 STB 中，并磁力搅拌。
将 25 mg MDPF 溶解在冰上的 -20°C 丙酮中，并在室温 (RT) 下将 MDPF 添加到明胶-STB 中，磁力搅拌避光 1 小时。分成 500 µL 等份，并在 -20 °C 避光保存。

3.酶凝胶的分离凝胶（下）缓冲液
800 mL MQ
187 克 Tris 碱
将pH值调节至8.8
4克 SDS
添加 MQ 至 1 L

4.酶凝胶的堆积凝胶（上）缓冲液
800 mL MQ
60.5克Tris碱
调节pH值至6.8
4 克 SDS
添加 MQ 至 1 L

5.8% MDPF (1 mg/mL)-明胶 SDS-PAGE（4 块凝胶）
在通风橱中制备凝胶：
底部：分离胶
分离缓冲液 5 mL（配方 3）
30% 丙烯酰胺 5.3 毫升
MQ 7.3 毫升
MDPF-明胶 (1 mg/mL) 2 mL（配方 2）
10% SDS 200 µL
TEMED 20 µL
10% APS 200 µL

顶部：堆积凝胶
堆积凝胶缓冲液 2.5 mL（配方 4）
30% 丙烯酰胺 1.35 毫升
MQ 5.95 毫升
10% SDS 100 µL
TEMED 10 µL
10% APS 100 µL

6.SDS-PAGE电泳缓冲液 5 ×
将 4 L MQ 添加到 Duran 瓶中
723 克甘氨酸
150 克 Tris 碱
20 克 SDS
调节pH值至8.3
添加 MQ 至 5 L

7.酶缓冲液 10 ×
将 800 mL MQ 添加到 Duran 瓶中
60.55克Tris碱
2克NaN 3
33 mL 37% HCl
将 pH 值调节至 7.5
添加 MQ 至 1 L

8.Zymo凝胶孵育缓冲液

酶缓冲液 I
360 毫升 1 × zymo缓冲液（从 10 ×稀释带 MQ 的zymo缓冲区）
40 mL 25% 吐温 80

Zymo缓冲液 II
270毫升 1 × 酶缓冲液
30 mL 25% 吐温 80
30 µL 10 mM ZnCl 2
1530 µL 100 mM CaCl 2

液III
300 mL 1 × 酶缓冲液
30 µL 10 mM ZnCl 2
1530 µL 100 mM CaCl 2

9.考马斯亮蓝 (CBB)，0.1%（在通风橱中染色和脱色）
1 克考马斯亮蓝、Serva Blue R
600 mL MQ
300毫升甲醇
100 毫升乙酸
脱色：40% MeOH + 10% 乙酸的 MQ 溶液

10.IEC 起始缓冲液（20 mM Tris HCl，pH 8.2）
2.4克Tris碱
添加 800 mL 的 MQ
调节pH值至8.2
添加 MQ 至 1 L
无菌过滤和脱气

11.IEC 洗脱缓冲液 I（20 mM Tris HCl-0.5 M NaCl，pH 8.2）
29.22克氯化钠
2.4克Tris碱
添加 800 mL 的 MQ
调节pH值至8.2
添加 MQ 至 1 L
无菌过滤和脱气

12.IEC 洗脱缓冲液 II（20 mM Tris HCl-1 M NaCl，pH 8.2）
14.61克氯化钠
0.6 g Tris 碱
添加 200 mL MQ
调节pH值至8.2
添加 MQ 至 250 mL
无菌过滤和脱气

13.磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，pH 7.4
800 mL MQ
8.0克氯化钠
1.44克Na 2 HPO 4
0.2 克氯化钾
0.24克KH 2 PO 4
使用 HCl 将 pH 调节至 7.4
添加 MQ 至 1 L
过滤并高压灭菌

14.10% 十二烷基硫酸钠
80 mL MQ
10克 SDS
添加 MQ 至 100 mL

15.裂解酶原液
1.6 mL MQ
添加10kU 裂解酶
以 400 µL 等分试样储存于 -20 °C

实验室用品

1.无菌塑料接种环（Greiner Bio-One，目录号：731171）
2.Millipore Express TM Plus 或带 MILLIPORE Express ® PLUS (PES)的过滤装置Stericup ® ， 0.22 µm（Merck Millipore，目录号： X342.1，可选方法：离心）
3.Millipore Millex ，0.22 µm（Merck，目录号：051581）
4.琼脂板，塑料的培养皿，PS（Sigma，目录号：P5731）
5.带旋塞和下部硅管的玻璃色谱柱（9.5 mL）（或Econo Alpha 柱，Bio-Rad，目录号： 12009430) 和立柱
6.玻璃锥形瓶，2 × 3 L，2 × 200 mL
7.Amicon ® Ultra-15 离心过滤装置，10 K和 50 K（Merck Millipore，目录号：UFC901024、UFC905024）
8.玻璃醒酒器 500 mL
9.Eppendorf TM Snap-Cap 微量离心机 SafeLock TM管[ Fisher ，目录号：05-402-18（1.5 mL）和 05-402-18（0.5 mL）]
10.Falcon TM管，15 mL，50 mL （ Fisher，目录号： 14-959-53A、14-432-22)
11.微量移液器和无菌移液器吸头，10 µL–5 mL
12.铝箔
13.Falcon TM和Eppendorf TM试管的试管架
14.HiTrap ® IEX 选择套件（默克公司，GE17-6002-33）
15.Sephadex G-100 和 G-200 （ Pharmacia Fine Chemicals，目录号：01-900-1-1861-03、01-900-1-1863-03）1 g/40 mL 缓冲液
16.10 mL无菌塑料注射器（ Fisher，目录号：14955459）
17.冰，2 × 5 L 塑料盘
18.Duran 瓶，1 L、5 L
19.适合凝胶过滤柱的漏斗

设备

1.加热柜，31 °C、37 °C，可选：Melag Incubat ® 85（或 Merck My Temp Mini 数字培养箱，目录号：Z763357）或SureTemp ®双对流培养箱（Merck，目录号：Z742696）
2.Nanodrop 1000（或 NanoDrop Lite Plus 分光光度计，目录号： NDLPLUSGL ）
3.pH计（VWR®现象®MU 6100 H，目录号：665-0311 ）
4.PAGE 运行装置，20 µL 孔体积，10 个孔 4–6 个梳子（Bio-Rad，型号：Mini-Protean II，目录号：165-2940 ）
5.酶缓冲液孵育的塑料容器（500 mL），一次性 PP，平底（ Marjukka，目录号：6410416249018 ）
6.用于凝胶可视化的灯箱，LX104， Lammex （或 X 射线查看器； Quirumed ，目录号：482-6001.S ）
7.凝胶扫描仪， GS-700 密度计（ Bio-Rad，目录号：170-7601，带有 QUANTITY ONE PROGRAM ）
8.光学显微镜，放大倍数10 – 40倍
9.用于脱气缓冲液和 Sephadex 凝胶的真空抽吸系统
10.用于凝胶可视化和摄影的紫外线（ Uvidoc ，型号：M03 0103 或带有Image Lab Touch 软件的GelDoc Go 凝胶成像系统，目录号：12009077）
11.水平混合器（海道夫 Vibramax 100，目录号：544-21200-00)
12.离心机 SL16R 和用于 15 mL 管的适配器（ Thermo Scientific，目录号：75004030）
13.高压灭菌器（ Systec ，型号：D45）
14.通风柜（ Visukaluste Ltd，型号：VISU ProFocus EN 14175-2）

程序

A.酵母细胞的制备

1.转移光滑念珠菌将细胞从 -80 °C 转移到带有无菌接种环的沙氏葡萄糖琼脂 (SDA) 板上。将板在 37°C 下孵育 24 小时。该孵育时间对于获得足够的稳定期酵母细胞（预期 OD > 2）是最佳的，因为光滑念珠菌不会形成真正的菌丝。然而，24 小时的孵育时间对于形成菌丝的物种可能是个问题，例如白色念珠菌[尝试过夜 (o/n) 培养]。
从培养板中目视检查生长纯度，并使用光学显微镜（放大 10 – 40倍）检查集落和细胞形态。通过挑取一个菌落并按照先前所述进行孵育来制备纯培养物。
2.将带有无菌接种环的一环细胞从纯培养 SDA 板（检查纯度如上）转移到 2 × 2 L YPG（参见配方 1）中，分成两个锥形瓶。用铝箔松散地盖住锥形瓶，置于水平混合器上，并在 37°C 下低速 (65 rpm) 孵育 24 小时。
3.真空吸力的 MILLIPORE Express PLUS 0.22 µm 过滤器的Stericup将细胞悬浮液过滤成 2 L 等分试样。使用第二个过滤器来处理剩余的细胞悬浮液，因为过滤器可能会堵塞。用 150 mL 的 PBS/过滤器将细胞从滤膜中回收到等体积的八个 50 mL Falcon 管中。
4.×离心 g在室温下 10 分钟。弃去上清液。
5.将 40 mL PBS 添加到每个管中的细胞上，并悬浮至均匀组合物。 1,753 ×离心 g在室温下 10 分钟。弃上清，每管加入 40 mL PBS，1,753 ×离心 g ，弃去上清液。
6.用移液器悬浮细胞，用 2.5 mL PBS 回收每个 Falcon 管底部的所有细胞，并将其转移到 100 mL Erlenmeyer 中。添加 40 mL 的 PBS（总悬浮液体积 = 80 mL）。

B.裂解酶治疗

1.将 400 μL 准备好的裂解酶溶液添加到细胞悬浮液中（最终浓度约为 30 U/mL），用铝箔松散地盖上盖子，并在水平摇床上（65 rpm）在 31°C 下孵育 22 小时。（此处，将加热柜放置并绑在水平混合器上；可选择将水平混合器放入更大的培养箱中。）
2.将细胞悬液均分至两个 50 mL Falcon TM管中，并以1,753 ×离心 g在室温下 10 分钟。回收上清液（总体积= 35 mL）并储存在-20°C。
3.将总共 40 mL PBS 的 Falcon 管中的细胞回收到 200 mL Erlenmeyer 中。添加 400 µL裂解酶溶液，用铝箔松散地盖上盖子，并在水平摇床 (65 rpm) 上于 31 °C 孵育 22 小时。
4.重复步骤 B3。冷冻上清液或继续合并冰箱中的上清液。取 500 µL 样品进行酶谱分析和蛋白质浓度测量，并将其余样品储存于 -20 °C。
5.将细胞重新悬浮在 Falcons 中的剩余体积中，并用光学显微镜验证细胞是否完整（见图 1）。

图 1.裂解酶处理后的完整C. glabrata原生质球。光学显微镜，40倍放大倍数。

C.分离 10–50 kDa和 > 50 kDa组分

1.将 PBS 置于冰上。使用配备 MILLIPORE Express PLUS 0.22 µm 过滤器的Stericup过滤装置解冻并过滤合并的上清液 (V = 70 mL)，并真空抽吸或可选地通过离心。取 500 µL 样品进行蛋白质浓度分析和酶谱分析。将上清液分入八个Amicon ® Ultra-15 离心过滤装置 10 K中。 1,753 ×离心 g ，4°C 20 分钟。取出并合并流通液。
2.向每个管中添加 10 mL 冷 PBS，并以1,753 ×离心 g ，4°C 20 分钟。
3.与较早的流通池流通。取 500 µL 样品对合并的总流通量进行酶谱分析，并将其和其余样品储存在 -20 °C的 50 mL Falcon 管中（< 10 kDa分数）。将上层清液均匀转移至两个Amicon ® Ultra-15 离心过滤装置 50 K。 1,753 ×离心 g ，4°C 20 分钟。
4.回收流出物（10–50 kDa分数）。
5.添加 12 mL PBS/过滤器并以1,753 ×离心 g ，4°C 20 分钟。使用 10-50 kDa级分（约 40 mL）进行池流过。取 500 µL 样品，并将其和其余样品以 10 mL 等分试样储存在 Falcon 管中，于 -20 °C 保存。
6.通过悬浮 3 × 5 mL 的 PBS 来回收 > 50 kDa分数，以获得大约 30 mL 的 > 50 kDa分数。取 500 µL样品，将其和其余样品分 8 mL 等份储存在 Falcon 管中，于 -20 °C 保存。
7.测量蛋白质浓度（A 280 nm）并运行 8% MDPF-明胶酶谱法以评估蛋白质回收率。参见图 2。

使用离心装置分离 10–50 kDa和 > 50 kDa蛋白酶后 8% MDPF-明胶酶谱的紫外照片。泳道： 1.以kDa为单位的分子量标准品。 2.裂解酶处理的级分。 3.用 1 µL β-巯基乙醇裂解酶处理的级分。 4.裂解酶处理的 10–50 kDa级分。 5.裂解酶处理的> 50 kDa级分。 6.用 1 µL β-巯基乙醇对 > 50 kDa 的裂解酶进行处理。选择泳道 5 中的级分用于离子交换色谱，因为需要 > 50 kDa大小的蛋白酶具有强明胶分解活性。可以看到β-巯基乙醇作为还原剂在泳道 6 中 > 50 kDa级分中断裂二硫键的活化作用。

D.凝胶过滤的准备

1.量取 1 g Sephadex G-200，并在无菌倾析器（用铝箔覆盖）中在 40 mL 的 20 mM Tris HCl、0.5 M NaCl、pH 8.2 中于室温下溶胀 3 天。
2.用真空抽吸对凝胶和缓冲液进行脱气，直至没有气体冒泡。使用前将它们储存在 4°C 下。

E.MDPF-明胶酶谱法

1.制备 8% MDPF 明胶标记的酶凝胶。准备底部分离胶。在浇注装置的玻璃之间添加 4.45 mL 该溶液，并在凝胶顶部添加 MQ，以防止干燥并获得凝胶的线性顶部水平。静置 30 分钟。在浇注浓缩胶之前，通过倾倒并用纤维素吸水纸轻轻吸收来除去 MQ。准备顶部堆积凝胶。添加浓缩凝胶并梳子，并在凝胶凝固时避光干燥（30 分钟）。使用前，将其储存在 MQ 润湿的纸包装和塑料袋中，避光保存在 4°C 下。凝固过程中和凝固后应避光。凝胶可以用 MQ 润湿的纸包裹在塑料袋中避光保存在 4 °C 下最多一周。
2.将 15 μL 样品与 5 μL 4 × Laemmli 样品缓冲液在 0.5 mL Eppendorf 管中在 RT 下在非摇动条件下孵育 2 小时。
3.使用 1× SDS-PAGE 运行缓冲液（用 MQ 从 5× 运行缓冲液稀释）填充运行室。使用预染色的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准品（10 µL，Precision Plus Protein TM标准品）评估蛋白质大小，移取标准品，并将样品孵育到凝胶孔中。
4.设备避光并在冰水中进行 110 V 电泳。
5.在平台秋千上，将凝胶在酶缓冲液 I 中室温孵育 30 分钟，然后在酶缓冲液 II 中室温孵育 30 分钟。然后，在zymo buffer III 中过夜或在加热柜中 37°C 下孵育 1-7 天，并用铝箔避光。
6.用紫外灯跟踪明胶分解反应 1-2 天（照片），在所需的明胶降解阶段停止，然后用 0.1 CBB 对凝胶进行染色、脱色、扫描图像并分析。凝胶在扫描之前可以存储在 MQ 中。
7.选择具有最高明胶分解活性和蛋白质浓度的级分。如果下一步需要，合并和/或浓缩馏分（参见图 3）。

图 3. 8% MDPF-明胶酶谱 (A) 和考马斯亮蓝染色后(B) 的紫外照片，用于评估离子交换色谱法。泳道： 1. 以kDa为单位的分子量标准品。 2. 离子交换层析前的蛋白酶样品。 3 和 5. 流通。 4 和 6. 洗脱级分。选择泳道 6 中的洗脱级分进行凝胶过滤，因为其具有最强的明胶分解活性，并且所需蛋白质大小的A 280最高。

F.离子交换色谱 (IEC)
通过 pH 优化（测试 10-50 kDa级分的 pH 值为 6.4；对于 > 50 kDa级分，pH 为 7.5 和 8.2）以及弱和强阴离子和阳离子交换剂来评估阳离子和阴离子交换剂，以找到捕获的最佳组合所需的蛋白质（ HiTrap® IEX选择试剂盒）。该过程取决于蛋白质的等电点，并根据蛋白质的净电荷影响与柱的结合和洗脱。蛋白质的聚集在等电点 ( pI )时达到最大。我们通过使用等电聚焦和 2D-MDPF-明胶酶谱法的早期研究获得了估计pIs的先验知识。协议其余部分描述了缓冲液 pH 8.2 的 DEAE FF（弱阴离子交换剂）作为获得 > 50 kDa分数的最佳回收率的示例。
1.准备 IEC 起始缓冲液、 IEC 洗脱缓冲液 I 和 IEC 洗脱缓冲液 II（参见配方）。过滤缓冲液 (0.22 µm)、脱气并置于冰上。
2.将 8 mL > 50 kDa级分在 4 °C 下以 1753× g离心 10 分钟（级分 C6）。弃去上清液并用 IEC 起始缓冲液将体积恢复至 8 mL 。根据需要通过1753× g离心浓缩样品 4°C 20 分钟。将样品置于冰上。
3.起始缓冲液以 1 mL/min清洗 DEAE FF 柱（ HiTrap® IEX 选择套件），然后用 5 mL IEC 洗脱缓冲液 II，然后再次用 5 mL IEC 起始缓冲液清洗。避免气泡。
4.使用注射器以 1 mL/min 的速度涂抹样品。开始将 0.5 mL 级分收集到 1.5 mL Eppendorf 管中。用5 mL IEC 起始缓冲液清洗柱，然后添加 5 mL IEC 洗脱缓冲液 I。
5.根据制造商的说明存放色谱柱。
6.使用 Nanodrop 1000 测量蛋白质浓度，并运行酶谱凝胶以找到具有明胶分解活性和最高蛋白质浓度的级分。参见图 3。

G.凝胶过滤
凝胶过滤设备的设置如图4所示。

图 4. 设置凝胶过滤设备的示例。将样品保存在冰上。请记住硅胶管中的安全环。

1.用 IEC 洗脱缓冲液 I 填充 500 mL 倾析器。将倾析器放置得足够高，使其硅管端部高于连接到玻璃柱下部的硅管端部，以启用缓冲液流动。确保管道中有安全环，以避免缓冲液用完时凝胶脱水（参见图 4）。
2.取一根带有下部硅管的 9.5 mL 柱（15 厘米长，半径 = 4.5 厘米）。打开柱子的下部阀门，用漏斗连续倒入凝胶直至柱子充满 4/5，以避免气泡。让它沉降，这样凝胶的上层就不会下降。用注射器将 10% EtOH 从柱下端填充到柱的一半处，以排除气泡。
3.长度，将 2 × 10 mL IEC 洗脱缓冲液 I 的缓冲液流速调整为每 30 秒一滴。将缓冲液排至凝胶顶部上方。关闭下部阀门。如果不立即使用，该色谱柱可在 4 °C 下保存大约一周。如需延长储存时间，请添加 0.02% 叠氮化钠，并在使用前用大约 2倍柱体积洗涤。
4.建议的样品体积为床体积的1% – 5%。从离子交换色谱中选择最佳洗脱分数（参见图 3），并使用Amicon ® Ultra-15 离心过滤装置 50 K将 5 mL 浓缩至 500 µL。
5.涂抹 500 µL > 50 kDa分数，避免溅到凝胶床的顶部。打开下部阀门，让样品沉入其中。将 IEC 洗脱缓冲液 I 一直填充到色谱柱顶部，关闭色谱柱上盖，并将硅管从倾析器连接到色谱柱顶部。打开下部阀门，观察缓冲液流是否连续。
6.收集大约 24 × 0.5 mL 分数。对管子进行编号。测量蛋白质浓度并选择最高浓度（如有必要，合并分数）。运行酶谱凝胶以检测最高酶活性以进行进一步分析。参见图 5。选择的级分可以用 Sephadex G-100 进一步纯化（如上所述），并在传统的 8% SDS-PAGE 和平行银染凝胶上运行以进行 LC-MS/MS 分析（图 6）。

图 5. 凝胶过滤后 8% MDPF-明胶酶谱的紫外照片。泳道： 1.以kDa为单位的分子量标准品。 2.离子交换色谱后> 50 kDa级分。 3 – 8. G-200 凝胶过滤后的洗脱组分 1–6。使用 Sephadex G-100 对 > 50 kDa级分进行凝胶过滤，酶谱分析未显示任何活性。泳道 5 中的级分 3 进一步用于 LC – MS/MS 分析。

图 6. 纯化结果概述，8% SDS-PAGE 凝胶，银染。泳道： 1.以kDa为单位的分子量标准品。 2. IEC 之前的分数> 50 kDa 。 3.凝胶过滤前> 50 kDa级分。 4−10。 > 50 kDa凝胶过滤级分。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：
•Pärnänen, P.、Sorsa, T.、Tervahartiala, T. 和 Nikula-Ijäs, P. (2020)。光滑念珠菌细胞壁兼职蛋白酶的分离、表征和调控。微生物。病原体。 149：104547。https ://doi.org/10.1016/j.micpath.2020.104547 （图 1 和 2）。
•Pärnänen, P.、Meurman, JH 和 Nikula-Ijäs, P. (2015)。一种新型光滑念珠菌细胞壁相关丝氨酸蛋白酶。生物化学。生物物理学。资源。交流。 457：676 – 680。https : //doi.org/10.1016/j.bbrc.2015.01.047 （图 1 和 2）。
•Pärnänen, P.、Kari, K.、Virtanen, I.、Sorsa, T. 和 Meurman, J. (2008)。念珠菌蛋白酶降解人层粘连蛋白 332 。 J。口腔病理学。医学。 37：329-35。 https://doi.org/10.1111/j.1600-0714.2008.00638.x （图 1）。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.适当时将级分和样品置于冰上，以免失去活性。
2.无菌过滤器或高压灭菌器并对缓冲液脱气并储存在 4 °C 下。
3.离子交换层析和凝胶过滤也可用于样品中的 10 – 50 kDa蛋白质，其原理与> 50 kDa组分相同。
4.使用无菌实验室设备以避免污染。
5.建议提前了解这些方法的原理。

故障排除

A.酵母细胞的制备

事实证明，二十四小时是确保有足够的细胞用于研究的最佳孵育时间。光滑念珠菌不会形成真正的菌丝，但在其他念珠菌属物种中，孵育时间应较短，以保持细胞处于非菌丝形式；可能必须另外使用抗菌丝物质。 OD 600应远大于 2。孵育时间过长通常会导致细胞开始破裂或转化。

B.裂解酶处理

1.如果通过光学显微镜观察酵母细胞不完整，则裂解酶浓度可能过高或处理时间过长。在这种情况下，细胞内蛋白质已经泄漏，必须培养新细胞。
2.裂解酶处理后没有留下或留下较低的明胶分解活性（酶谱），请检查孵育温度是否太低/太高。其他念珠菌与光滑C. glabrata不同的物种可能具有不同的细胞壁明胶分解蛋白酶的键合，这些蛋白酶不被裂解酶水解。

C.分离 10–50 kDa和 > 50 kDa组分

1.如果离心过滤装置后留下的级分没有或显示出较低的明胶分解活性（酶谱），则可能无法从过滤器中回收蛋白质。尝试用移液器吸头轻轻地将缓冲液悬浮在过滤器上（避免起泡），以分离卡住的蛋白质。
2.盐浓度过高可能会沉淀蛋白质。
3.将馏分置于冰上以避免酶活性逐渐丧失。

D.MDPF-明胶酶谱法

1.如果 CBB 染色的凝胶不是蓝色，请检查 MDPF 明胶浓度或有效期。将MDPF-明胶保存在黑暗中；否则，荧光就会消失。
2.请勿在电泳前煮沸酶谱样品，否则酶活性将会丧失。
3.kDa 的蛋白质可参见图 3、4、6 和 7。这被认为是由蛋白质较小亚基的自降解或解离引起的。

E.国际电工委员会

1.过滤和脱气缓冲液以避免杂质或气泡堵塞色谱柱。
2.酶谱分析无活性或活性低：蛋白质浓度太低（浓缩样品，但请记住浓度过高会聚集蛋白质）；缓冲液 pH 值错误或离子交换柱基质不合适。

F.凝胶过滤

1.如果没有发生适当的尺寸依赖性分离，则过滤柱的高度或直径可能是错误的。您可能还必须小心地用基质填充色谱柱，并等待基质稳定在色谱柱顶部的水平位置。将样品轻柔地加入柱中（不干扰沉淀的基质）可确保更清晰的级分分离。
2.如果没有缓冲液流过色谱柱：凝胶基质中存在杂质或气泡（由色谱柱不连续填充引起）或缓冲液瓶位置相对于色谱柱太低（无静水压）。
3.收集足够的级分并运行所有级分的酶谱以回收/检测所需的蛋白质。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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