材料与试剂

生物材料

1.THP-1 细胞瓶，已储存在气相液氮 (LN 2 ) 中（ATCC，目录号：TIB-202）
2.源自骨髓或脐带组织的人 MSC，已冷冻保存在冷冻瓶中并维持在 LN 2中的气相（RoosterBio Inc.，Frederick，MD，目录号：RoosterVial-hBM 或由杜克大学 MC3 提供）

试剂

1.RPMI 1640 含有 L-谷氨酰胺和 10 mM HEPES（ATCC，目录号：30-2001）
2.RoosterNourish TM -MSC（RoosterBio Inc，目录号：KT-001）
3.Prime-XV MSC Expansion XSFM（Irvine Scientific，目录号：91149）
4.青霉素/链霉素（P/S）（Millipore Sigma，目录号：P4333）
5.胎牛血清（FBS），热灭活（HI）并表征（Cytiva，目录号：SH30071.01）
6.β-巯基乙醇（BME）（Thermo Fisher Scientific，目录号：21985023）
7.二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：C6164）
8.佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13 乙酸酯（PMA）（Sigma-Aldrich，目录号：P1585）
9.PLASMA-LYTE A（Baxter Intl Inc.，目录号：2B2543Q）
10.人血清白蛋白（HSA）（Albutein）25％（Grifols，目录号：68516-5216-02）
11.磷酸盐缓冲盐水 (PBS)不含Ca 2+ /Mg 2+ ，低内毒素（Millipore Sigma，目录号：TMS-012-A）
12.干扰素-γ（IFN-γ）（Thermo Fisher Scientific，目录号：300-02）
13.脂多糖（LPS）（Millipore Sigma，目录号：L4391）
14.无菌无内毒素水（VWR，目录号：75799-280）
15.TrypLE Express 1 × （Millipore Sigma，目录号：12605028）
16.Zombie UV 可固定活力套件（BioLegend，目录号：423107）
17.Human TruStain FcX TM （BioLegend，目录号：422302）
18.抗体（BioLegend，见表1）

表 1. 细胞表型组的抗体信息
表面标记最终稀释共轭小贩目录克隆
人巨噬细胞/MSC 抗体组HLA-DR1:20（参见一般说明 6）异硫氰酸荧光素生物传奇307620L243
CD1631:20聚乙烯醇生物传奇333606GHI/61
CD731:20PerCP/Cy5.5生物传奇344014AD2
CD2061:20APC生物传奇32111015-2
CD141:20聚乙烯/Cy7生物传奇36711263D3
僵尸紫外线1：1000-生物传奇423107-
补偿珠抗小鼠 Ig +/- 对照珠一滴/500 µL FC 缓冲液-BD552843-
ArC 反应珠与 Zombie UV 配合使用一滴/500 µL FC 缓冲液-赛默飞世尔A10346-

19.抗小鼠阴性和阳性对照珠（Thermo Fisher Scientific，目录号：552843）
20.ArC 反应珠（Thermo Fisher Scientific，目录号：A10346 和 A10628）
21.Cytofix 固定缓冲液（BD Biosciences；目录号： 554655）
22.ELISA 试剂盒 TNFα（例如，Thermo Fisher Scientific，目录号： PO1375）
23.Luminex 细胞因子试剂盒磁性 30 Plex 面板（Thermo Scientific，目录号： LHC6003M）

解决方案

1.THP-1 膨胀介质（参见配方）
2.THP-1 分化培养基（参见配方）
3.稀释缓冲液（参见配方）
4.PMA 稀释（参见配方）
5.LPS 库存（参见食谱）
6.IFN-γ 库存（参见食谱）
7.共培养培养基（参见食谱）
8.僵尸紫外线（参见食谱）
9.封闭缓冲液（参见配方）
10.FC 缓冲器（参见配方）
11.抗体鸡尾酒（参见食谱）

食谱

1.THP-1膨胀介质
试剂最终浓度体积
转速164079%394.5毫升
胎牛血清高水平20%100毫升
压力/压力1%5毫升
生物医学工程0.1%0.5毫升
全部的100%500毫升

2.THP-1分化培养基
试剂最终浓度体积
转速164098%48.5毫升
胎牛血清高水平1%0.5毫升
压力/压力1%0.5毫升
PMA稀释100纳克/毫升0.5毫升
全部的100%50毫升

3.稀释缓冲液
试剂最终浓度体积
血浆溶解液A96%48毫升
HSA (25%)4% (1%)2毫升
全部的100%50毫升

4.PMA稀释
在 1 mL DMSO 中制备 5 mg PMA 的储备溶液。然后，将 5 µL 库存添加到 2.5 mL 的 RPMI 1640（无添加剂）中。通过 0.2 µm 过滤器过滤灭菌，然后按上述方法添加到 1% FBS 培养基中。
试剂最终浓度体积
PMA 库存（5 mg/mL，溶于 DMSO）10微克/毫升5微升
中等转速 16402.5毫升
全部的100%2.5毫升

5.脂多糖库存
试剂最终浓度数量
脂多糖1毫克/毫升1毫克
无菌水1毫升
全部的100%1毫升

6.IFN-γ 库存
试剂最终浓度数量
干扰素-γ100微克/毫升100微克
无菌水1毫升
全部的100%1毫升

7.共培养培养基
试剂最终浓度体积
转速164098%49毫升
胎牛血清高水平1%0.5毫升
压力/压力1%0.5毫升
脂多糖100纳克/毫升5微升
干扰素-γ100纳克/毫升50微升
全部的100%50毫升

8.僵尸-紫外线
试剂最终浓度体积
Zombie-UV（重组）0.1%5微升
PBS Ca 2+ /Mg 2+ (1×)99.9%5毫升
全部的100%5毫升

9.封闭缓冲液
试剂最终浓度体积
TruStain FcX10%1毫升
FC缓冲器90%9毫升
全部的100%10毫升

10.FC缓冲器
试剂最终浓度体积
胎牛血清高水平2%2毫升
不含PBS Ca 2+ /Mg 2+ (1 × )98%98毫升
全部的100%100毫升

11.抗体混合物（70 孔）
试剂最终浓度体积
抗体（每种 350 µL）50%1.75毫升
FC缓冲器50%1.75毫升
全部的100%3.5毫升

实验室用品

1.未经处理的 T-25、T-75 和 T-175 悬浮瓶（例如，Corning，超低附件，目录号：4616、3814）
2.组织培养处理的 T-225 烧瓶（例如，Corning，CELLBIND，目录号：3293）
3.用于气相的低温瓶（例如，Corning，Fisher Scientific，目录号：431386）
4.冷冻容器（例如，Corning，Millipore Sigma，型号：CoolCell LX，目录号：CLS432002）
5.血清移液器[例如，VWR，目录号：414004-266（5 mL）； 414004-267（10毫升）； 414004-268（25毫升）]
6.微量移液器吸头，P10 P1000 µL [例如，Fisher Scientific，Biotix uTIP 过滤器，目录号：12-111-000 (10 µL)； 12-111-004（300 µL）； 12-111-132 (1,000 µL)]
7.Via-1-Cassette TM墨盒（Chemometec，目录号：941-0012）
8.CELLBIND 96孔细胞培养板（Corning，Millipore Sigma，目录号：CLS3300）
9.用于培养基储存的 96 孔培养板（例如，Corning，经过组织培养处理，目录号：3894）
10.V形底96孔板（Corning，Millipore Sigma，目录号：CLS3894）
11.封口膜（例如，Sigma-Aldrich，目录号：P7793）
12.预饱和酒精湿巾（例如，VWR，目录号：33503-136）

设备

1.生物安全柜 (BSC) A2 级（例如 Thermo Fisher Scientific，目录号：1377）
2.培养箱设置为 5% CO 2和 37 °C （例如 Thermo Fisher Scientific，型号：HeraCell VIOS）
3.细胞计数器（例如 Chemometec，型号：NucleoCounter NC-200 TM ）
4.冷冻离心机可达500 × g并使用50 mL锥形管和微孔板（例如，Thermo Fisher Scientific，型号：Megafuge 8R，目录号：75007214）
5.微量移液器 P10 – 1,000 µL（例如，Eppendorf，Research Plus 系列，目录号：312300020）
6.移液器控制器（例如，Eppendorf，型号：Easypet，目录号：2231000955）
7.倒置显微镜（例如，Thermo Fisher Scientific，型号 EVOS M5000，目录号：AMF5000）
8.微孔板吸光度读数器（例如 Cytation 5）
9.流式细胞仪，例如 CytoFlex (Beckman Coulter)、LSRFortessa (BD)
10.发光酶标仪（例如，Bio-Rad，型号：Bioplex 200）

软件和数据集

1.数据分析需要流式细胞术软件。这可以是 FlowJo TM (BD Biosciences) 或 CytoBank (Beckman Coulter) 软件
2.Prism 9（GraphPad，圣地亚哥，加利福尼亚州）
3.JMP统计软件(Pro 17)

程序

A.巨噬细胞培养物的建立

1.解冻一小瓶 THP-1 细胞（7 × 10 6 个细胞）。将细胞瓶放入 37°C 水浴的泡沫浮子中，时间为 2 分钟。在将其从水浴中取出之前，检查 90% 的冰已消失。
2.用预饱和酒精擦拭小瓶。使用 1,000 μL 微量移液器将细胞添加到 9 mL 的 THP-1 扩展介质中，该介质已在 50 mL 锥形管中预热至 37°C，并使用 10 mL 血清移液器重新悬浮细胞。
3.将 60 µL 细胞悬浮液放入 Via-1 盒中并将盒放入 NucleoCounter 中，对细胞进行计数。记录细胞计数和细胞活力。
4.将细胞在 4 ℃ 300× g下离心5 分钟 °C。吸出上清液，并向沉淀中添加 30 mL 膨胀介质。使用 10 mL 血清移液器重新悬浮颗粒。
5.将 30 mL 新鲜预热的扩增培养基添加至 T-175 悬浮培养瓶中，并添加 30 mL 细胞悬浮液，总计 60 mL。这将以 1.2 × 10 5 /mL的细胞密度接种细胞。
6.将烧瓶在 37 °C 和 5% CO 2的培养箱中孵育。每周饲喂细胞培养物两次，使用 25 mL 血清移液器将烧瓶中的所有培养基移至 2 × 50 mL 锥形管中，在 4°C 下以 300× g离心管 5 分钟，然后将每个细胞沉淀重悬于 30新鲜培养基毫升数。总共使用 60 mL 已预热至 37 °C 的介质对于每个媒体更改。
7.如上所述，在 Via-1 盒中取出 60 µL 细胞悬浮液，检查每次补料时的细胞密度。一旦培养物达到 1 × 10 6 /mL，它们可以进一步划分如下（参见图 1 和故障排除 1 和 2）。

图 1. 佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13 醋酸酯 (PMA) 处理 48 小时后，THP-1M 细胞松散贴壁 (20 × )。比例尺 = 150 µm。

8.将 THP-1 细胞悬液按 1:5 分装至 T-175 悬浮培养瓶中（每个瓶中装有 60 mL 培养基），并进一步将细胞培养至 1 × 10 6 /mL。
9.使用 25 mL 血清移液器从烧瓶中取出所有介质，离心以获得颗粒，并将颗粒重新悬浮在包含 10% DMSO: 90% FBS HI 的 10 M 细胞/的 1 mL 冷冻保存介质中，收获 THP-1 细胞小瓶。可以将小瓶放入-80°C 的冷冻容器中过夜，然后储存在气相 LN 2中，从而冷冻保存。
10.共培养开始前五天（第-5天），如上所述在扩增培养基中解冻THP-1细胞。
11.g离心5 分钟。
12.计数细胞。在 T-25 悬浮烧瓶中以 8 × 10 5 /mL的 6 mL 扩展介质重新悬浮 THP-1 细胞，直立以限制可用的表面积。在 37°C 和 5% CO 2下孵育 72 小时。
13.第-2天，从T-25烧瓶中收获THP-1细胞。对细胞进行计数以检查活力 (> 90%) 和细胞大小 (~13–14 µm)。
14.g离心5 分钟，并在分化培养基中以 5 × 10 5 /mL重悬 THP-1 细胞（PMA 处理）。
15.CELLBIND 96 孔平底板的每孔（10 5 个/孔）中接种 200 µL 细胞悬浮液。
对照设置额外的孔。
16.2下孵育48 小时以生成幼稚巨噬细胞（现在称为巨噬细胞 THP-1M）。

B.MSC 培养物的制备

1.在 PMA 治疗的同一天（第 -2 天），在稀释缓冲液或培养物拯救 (CR) 组选择的培养基 (RoosterNourish/XSFM) 中解冻 MSC。
2.将每个 MSC 供体的一瓶细胞在水浴中解冻 2 分钟。然后，将小瓶中的细胞添加到预热至 37°C 的 9 mL 稀释缓冲液或介质中，并使用 10 mL 血清移液器重新悬浮。
3.如前所述计数，并以 2,000 (XSFM) 或 3,700 (RoosterNourish) 细胞/cm 2 的密度将 MSC 接种到含有 MSC 生长培养基的 T-225 烧瓶中。所需介质的体积通常为 40 – 42 mL。
注意：所需的 MSC 接种密度可能因制造商/供应商而异。遵循供应商的建议。
4.在 37°C 和 5% CO 2下孵育 48 小时。
5.Ca 2+ /Mg 2+的 PBS 清洗烧瓶，吸出 PBS，然后添加 10 mL TrypLE 溶液，收获 MSC。
6.将烧瓶在 37 ℃ 下孵育 5 分钟 °C 允许细胞分离。在显微镜下检查，看到所有细胞都从烧瓶表面脱落。
7.将细胞悬液转移至试管中，并用 MSC 生长培养基洗涤烧瓶。计算 MSC。
8.以 500× g离心10 分钟，并以 2.5 × 10 6 /mL 或 1.25 × 10 6 /mL 在选择的稀释缓冲液/介质中重悬 CR MSC。
9.在 MSC 收获当天（第 0 天），在解冻 (OOT) 组选择的稀释缓冲液或培养基中解冻额外的 MSC。
10.g离心10 分钟，并以 2.5 × 10 6 /mL 或 1.25 × 10 6 /mL 在所选稀释缓冲液/介质中重悬 OOT MSC（参见一般说明 1）。

C.共培养的建立

1.第 0 天，将幼稚巨噬细胞板在 4°C 下以 300× g离心5 分钟。轻轻吸出 PMA 介质而不干扰细胞。
2.将 40 µL MSC 细胞悬液（CR 或 OOT）添加到每个孔中，产生1:1 或 1:2 的MSC:THP -1M（1 × 10 5 MSC:1 × 10 5巨噬细胞或 0.5 × 10 5 MSC： 1 × 10 5巨噬细胞）。设置含有两种细胞类型的额外孔，用于 FMO 进行流染色（参见一般说明 2）。
3.通过将 LPS 和 IFNγ 添加到 1% FBS RPMI 1640 中制备共培养介质，预热至 37°C。
注意：小心避免皮肤接触 LPS。
4.将 200 μL 共培养介质添加到仅 THP-1 M 的井中。将 160 μL 共培养介质添加到含有 MSC 的孔中。
关键：将细胞研磨三次以确保 MSC 和巨噬细胞均匀分布。由于离心，巨噬细胞板的松散贴壁细胞分布在孔的一侧。
5.将共培养板在 37°C 和 5% CO 2下孵育 24 小时。

D.条件培养基的取出和储存

1.第一天，将共培养板带到 BSC，但不要离心。
2.从每个孔（不是 FMO）收集 60 μL 上清液，并将其放入另一个 96 孔板的相应孔中，以使板图相同。从每个孔中收集另外 40 µL 上清液并放入第二个 96 孔板中。用板密封剂和封口膜固定板。将板储存在 -20°C 下进行 Luminex 和 ELISA 测定。
3.IFNγ的新鲜共培养介质（参见一般说明 3）。
4.将共培养板在 37°C 和 5% CO 2下再孵育 48 小时。

E.共培养后收获细胞

1.第 3 天，从每个孔中吸出 100 µL 共培养上清液并丢弃（参见一般说明 4）。
2.研磨剩余的上清液并移至 96 孔 V 底板。
3.用 100 μL 的 PBS 清洗一次孔，然后按照板图将 PBS 转移到 V 底板。
4.将 V 底板在 4°C 下以 500× g离心 5 分钟，并倒出上清液。最好的倾析方法是，旋转后立即从离心机中取出板，用一只手取下板盖，同时用另一只手快速而坚定地将板液体弹入水槽/生物危害容器中。然后将板摆正，并盖上盖子。板底部的颗粒应保持完整。
5.添加 50 µL TrypLE 加入共培养板的每个孔中，并在 37°C 下孵育 5 分钟以分离细胞（参见一般说明 5）。
6.收集细胞悬液并将其转移至 V 形底板。
7.使用 50 µL 新鲜共培养介质（不含 LPS 或 IFNγ）清洗每个孔并将介质转移至 V 底板。
8.重复步骤 E7 进行另一次清洗。
9.将 V 底板在 4°C 下以 500× g离心 5 分钟，并倒出上清液。
10.将 200 µL PBS 添加到 V 底板的样品孔中。将 50 µL PBS 添加到 FMO 孔中，将所有样品汇集在微量离心管中，然后在 FMO 和未染色样品的八个孔之间划分。

F.巨噬细胞表型的流染色

1.将 V 底板在 4°C 下以 500× g离心 5 分钟，并倒出上清液。
2.在 PBS 中准备 Zombie-UV live-dead 染料（参见配方 8）。
3.将 100 μL 的 Zombie UV 添加到除未染色和 Zombie FMO 之外的每个细胞颗粒中。
4.将 100 µL PBS 添加到未染色和 Zombie FMO 中。
5.将细胞重新悬浮在每个孔的染色溶液中。
6.在室温 (RT) 下黑暗中孵育 15 分钟。
7.将 V 底板在 4°C 下以 500× g离心 5 分钟，并倒出上清液。
8.用 200 μL FC 缓冲液清洗每个井。
9.将 V 底板在 4°C 下以 500× g离心 5 分钟，并倒出上清液。
10.准备 Fc 块染色溶液。将 50 µL Fc 块染色溶液添加到所有孔中并重悬 3 次（参见配方 9）。
11.在室温下黑暗中孵育 5 分钟。
12.使用 FC 缓冲液（参见配方 10）加上 10% v/v 的 HLA-DR、CD163、CD73、CD206 和 CD14（有关稀释度、缀合物和目录号，请参见表 1）制备抗体混合物。
13.在不去除 Fc 块的情况下，向每个样品孔中添加 50 µL 抗体混合物。
14.通过添加 5 µL 每种抗体（列出的抗体除外）来处理 FMO（FITC FMO 没有 FITC 抗体）。
15.将 50 μL FC 缓冲液添加到未染色的井中。将所有孔重新悬浮 3 次。
16.4°C 黑暗中孵育 20 分钟。
17.添加 100 µL FC 缓冲液进行洗涤，将 V 底板在 4°C 下以 500× g离心 5 分钟，并倒出上清液。
18.重复步骤 F17 进行另一次清洗。
19.将 100 µL CytoFix 固定缓冲液添加到沉淀中并重悬 3 次。 4°C 避光孵育 15 分钟。
20.每孔加入 100 µL FC 缓冲液进行清洗，将 V 底板在 4°C 下以 500× g离心 5 分钟，并倒出上清液。
21.将细胞颗粒重新悬浮在 100 μL FC 缓冲液中。将板保持在 4°C，并在三天内使用流式细胞仪进行分析。如果流式细胞仪没有用于板的高通量系统，请在流式之前将样品转移到适合您系统的试管中。
22.通过向六个试管中的每一个中添加一滴阳性抗小鼠珠子和一滴阴性抗小鼠珠子（参见表 1），并向每个单染色管中添加 1–5 µL 单一抗体，为抗体组准备补偿珠子，留下一个一样未染色。涡旋 5 秒，然后在黑暗中室温孵育 15-30 分钟。添加 2 mL FC 缓冲液进行清洗。 500× g离心5 分钟。小心去除上清液并重新悬浮在 400 μL FC 缓冲液中。
23.使用 ArC 反应珠代替抗小鼠珠，准备用于Zombie 染色的补偿珠，并且仅将 Zombie 染料与阳性珠（组分 A）一起孵育。如上所述清洗后，将阴性珠子添加到管中。使用所有珠子进行流量补偿。

G.条件培养基中生长因子、细胞因子和趋化因子的分析

1.解冻条件培养基板并使用等分试样进行 TNFα ELISA 和 Luminex 测定（参见制造商的说明）。

数据分析

TNFα ELISA 的结果包括吸光度值，通过测定中生成的标准曲线将吸光度值转换为 TNFα 浓度。建议仅为 THP-1M 以及 MSC 和 THP-1M 的每个样品组设置 6 个重复孔（生物重复）。将结果标准化为不存在 MSC 时巨噬细胞释放的 TNFα，并计算为 THP-1M 反应的抑制百分比。数据表示为平均值± 平均值的标准误差。使用 Prism 9（GraphPad，圣地亚哥，加利福尼亚州）使用单向方差分析 (ANOVA) 以及配对比较的事后 Tukey 检验进行统计分析。
Luminex 30 Plex Panel 的结果包括荧光强度测量值，根据 30 种分析物生成的标准曲线将其转换为浓度。建议仅针对 THP-1M 以及 MSC 和 THP-1M 的每个样品组设置 4 个重复孔（生物重复）。如果读数落在标准曲线的线性部分之外，则被视为异常值。可以使用 JMP 统计软件 (Pro 17) 对浓度进行标准化，以给出 Z 分数热图。
由于极化测定位于激活测定的下游，因此每个 MSC 供体使用相同数量的生物重复 (n = 6)。偏振测定生成流数据，可以在仪器上进行补偿（使用单染色），并使用 FMO 和使用 FlowJo 或 CytoBank 软件的未染色样品进行门控。一旦群体建立，数据就会以 HLA-DR +细胞占 CD14 +活细胞 (M1) 或 CD206 + /CD14 + （单阳性 M2）、CD163 + /CD14 + （单阳性 M2）的百分比的形式呈现。或CD206 + /CD163 + /CD14 + （双阳性M2）细胞。

协议验证

巨噬细胞活化测定

Medrano-Trochez 等人之前描述和验证了激活测定的工作。（[20]，图6 和 7），以及 Pradhan 等人。（[21]，图 2 和 6）。
可以通过相对简单的 ELISA 来寻找 TNFα 抑制作用的证据。一旦确定，即可将条件培养基置于 Luminex 中以比较多种分析物。本测定中使用了来自不同培养批次（B1 = 批次 1，B2 = 批次 2）的两个 THP-1 细胞瓶。 THP-1 B1 和 B2 的外形相似。该方案稳健且可重复，因为每种共培养物均与其仅 THP-1M 对照进行比较。使用骨髓来源和脐带组织来源的 MSC 验证了激活测定[21,20]（Pradhan 等人，2020 年；Medrano-Trochez 等人，2021 年）。图 2 显示了三个 MSC 供体的单独数据。总体而言，与新鲜解冻的 MSC 相比，培养拯救的细胞对巨噬细胞释放 TNFα 的抑制较小。

图 2. 间充质基质细胞 (MSC) 供体对肿瘤坏死因子-α (TNFα) 的抑制百分比和条件培养基中分析物的 Z 评分。 A. 使用 ELISA 测量培养基中 TNFα 浓度的值，并用作计算添加 MSC 时反应的抑制百分比的基线。 THP-1M 仅是巨噬细胞； OOT = 未解冻/新解冻； CR = 文化被拯救。所有供体样本均与 THP-1M 显着不同。 B. 对于六名供体 OOT 和 CR，共培养介质中存在的一组分析物以 Z 分数表示，其中橙色为高浓度，蓝色为低浓度。

巨噬细胞极化测定

收获时通过流式细胞术对细胞进行表型分析。在> 30K获得事件上，按照前向和侧向散射>单峰>活细胞（僵尸UV活/死区分）的初始门控策略，分析了方法部分中概述的表达表面标记的细胞的百分比。在含有 MSC 的孔中，CD73 表面标记物表达较高，这可用于排除 MSC。然后鉴定表达 CD14 的细胞群并用于测量 THP-1M 和 THP-1M 和 MSC 供体的 HLA-DR 水平。门控策略在图 3 中以单元格图的形式详细显示，在图 4 中以门控层次结构的形式详细显示。该协议使用骨髓来源和脐带组织来源的 MSC 对解冻细胞和培养物拯救的细胞进行了验证。以 1:2 的比例添加的五个供体的数据（MSC：THP-1M）如图 5 所示。总体而言，显示 HLADR 阳性损失更大的 MSC 表现出更大程度的 M2 极化，至少对于 CD163 而言积极性。

图 3. 建立巨噬细胞表型（HLA-DR + 、CD163 + /CD14 + 、CD206 + /CD14 +或 CD163 + /CD206 + /CD14 +细胞）所需的门控步骤以及间充质基质细胞 ( MSC)的存在(CD73 + )。 CytoBank的面板序列中显示了门控策略。

图 4. 用于分离细胞群的门控层次结构图。最后一个门是用于 CD163 和 CD206 标记物分析的象限。

图 5. 通过流式细胞术测定收获时的巨噬细胞表型。收获时测定 THP-1M 和与间充质基质细胞 (MSC) 共培养的巨噬细胞表型。 A. HLA-DR 阳性（M1 样）巨噬细胞占 CD14 +活细胞的百分比，使用和不使用 MSC 进行测量，除供体 2 外，所有组均显示 M1 标记物显着减少。 B. CD206 阳性（M2 样）巨噬细胞CD14 +活细胞的百分比。 C. CD163 阳性（M2 样）巨噬细胞占 CD14 +活细胞的百分比。供体 4 和 5 显示出较低的 HLA-DR 阳性率。 D. 双阳性 CD206/CD163（M2 样）巨噬细胞占 CD14+ 活细胞的百分比。所应用的统计检验是采用 Tukey 事后检验的单向方差分析； *（p < 0.05），**（p < 0.001），***（p < 0.001），****（p < 0.0001）； * 表示与THP-1M组相比具有显着性。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.MSC 可以在稀释缓冲液或培养基中递送。两者均已成功用于该协议。重要的是，所有 MSC 样品中应使用相同的递送载体，具有相同的细胞浓度和相同的体积，以便进行比较。
2.该方案演示了骨髓来源的 MSC 和脐带组织来源的 MSC 的测定。如果使用源自其他组织来源的 MSC 以及 MSC 与 THP-1M 的比例，则可能需要对解冻、培养和收获进行额外优化。
3.在我们看来，THP-1M M1 状态的维持需要培养基中持续存在 LPS 和 IFNγ。 TNF-α 的释放与 M1 表型的建立相结合，可用于优化测定中所需的 LPS 浓度。
4.从共培养板中成功收获需要两个阶段的过程。松散粘附的巨噬细胞将位于孔底部的介质中，因此在不干扰最低层的情况下去除介质非常重要。在洗涤步骤中收集巨噬细胞后，需要进行酶消化以将 MSC 从平板上分离。
5.如果 THP-1Ms 的表型是唯一正在研究的细胞类型，则可以避免此步骤。如果流式分析中需要 MSC，则可以使用 TrypLE。
6.由于在添加抗体混合物之前，每个孔中都留有 50 µL Fc 块，因此 5 µL 抗体的最终稀释度为 1/20。建议首先滴定抗体浓度以测试特定细胞仪的检测限。对于五组抗体中的每一个，每孔抗体浓度低至 1 µL (1:100)，已被证明在此测定中效果良好。

故障排除

1.之前已描述过培养 THP-1 单核细胞的方法 [22]，并进行了修改以解决扩展和维持这些细胞时遇到的许多问题 [23]。细胞对冷冻很敏感，如果扩张过多，可能会耗尽；如果密度不够，则增殖能力较差。经验法则是观察细胞的直径。使用细胞计数器测定，健康的活细胞为 13–14 µm，死亡/垂死细胞为 6–7 µm。一旦细胞尺寸减小，它们在我们手中就变得无法挽回。然而，一旦扩增，它们可以为功能测定提供非常一致的细胞系。
2.如果 THP-1 单核细胞在扩增阶段增殖减慢，请在每次饲喂时向新鲜培养基中添加 1:1 条件培养基。

致谢

这项工作得到了 Billi 和 Bernie Marcus 基金会以及国家科学基金会细胞制造技术工程研究中心 (NSF EEC 1648035) 的支持。 Medrano-Trochez 等人之前描述和验证了激活测定的工作。 [20] 和普拉丹等人。 [21]。使用BioRender.com创建的图形概述。
利益争夺

作者没有可能影响本协议中提供的材料的竞争利益。

道德考虑

本研究中的任何实验均未使用人类受试者。所有使用源自脐带组织的 MSC 的程序均由杜克大学的合作者根据道德标准提供，并得到佐治亚理工学院和杜克大学机构审查委员会伦理委员会的批准（IRB 协议号 H17348）。

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