材料与试剂

生物材料

1.桃欧文氏菌BST187 [13]
2.pGD质粒[13]
3.pET28a-Cas9 质粒 [13]
4.大肠杆菌DH5α 化学感受态细胞（Biomed，目录号：BC102-02）
5.pKNOCK- sacB -km [13]
6.大肠杆菌DH5α λ pir化学感受态细胞（ZOMANBIO，目录号：ZK227）
7.大肠杆菌S17-1 λ pir化学感受态细胞（ANGYUBIO，目录号：G6055-10）

试剂

1.KOD One TM PCR Master Mix（TOYOBO，目录号：KMM-201）
2.琼脂糖（GenStar，目录号：VA10252）
3.核酸染料（ Biosharp，目录号：BS354B）
4.StarMarker D5000（GenStar，目录号：M030-10）
5.StarMarker D8000（GenStar，目录号：M031-05）
6.新型凝胶迷你纯化套件（ZOMANBIO，目录号：ZPN202-3）
7.EZ-HiFi 无缝克隆套件（GenStar，目录号：T196-20）
8.Super Taq DNA 聚合酶（GenStar，目录号：A012-100）
9.快速质粒小量制备试剂盒（ZOMANBIO，目录号：ZPK101-3）

化学品

1.胰蛋白胨（OXOID，目录号：LP0042B）
2.酵母提取物粉末（OXOID，目录号：LP0021B）
3.琼脂粉（Solarbio，目录号：A8190）
4.硫酸卡那霉素（Solarbio，目录号：BS-K8020-5）
5.氨比西林（Solarbio，目录号：BS-A8180-5）
6.蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：V900116）
7.氯化钠（SCR，目录号：10019318）
8.KCl（SCR，目录号：10016318）
9.Na 2 HPO 4 ·12H 2 O（Macklin，目录号：S818120-500 g）
10.KH 2 PO 4 （Macklin，目录号：P815662-500 g）
11.Tris-base（Solarbio，目录号：SJ025）
12.冰醋酸（Macklin，目录号：A801295-500 mL）
13.EDTA （阿拉丁，目录号：E116428-500 g）
14.CaCl 2 （Macklin，目录号：C804986-500 g）
15.甘油（DAMAO，目录号：2294）

解决方案

1.卡那霉素 (50 mg/mL) （参见食谱）
2.氨苄西林 (100 mg/mL) （参见食谱）
3.50% 甘油（参见食谱）
4.0.1 M CaCl 2 （参见食谱）
5.0.85% 氯化钠（参见配方）
6.50 × TAE 电泳缓冲液（参见配方）
7.LB 培养基（参见食谱）
8.10 × 磷酸盐缓冲盐水 ( PBS)（参见食谱）

食谱

1.卡那霉素 (50 毫克/毫升)
将 500 mg 硫酸卡那霉素溶解在 10 mL ddH 2 O 中。使用 0.22 µm 注射器过滤器过滤灭菌，并储存在 -20 °C 使用前。

2.氨苄西林 (100 毫克/毫升)
将 1,000 mg 氨苄西林溶解在 10 mL ddH 2 O 中。使用 0.22 µm 注射器过滤器过滤灭菌并储存在 -20 °C 使用前。

3.50%甘油
2 O中稀释 100% 甘油来制备 50% 甘油溶液，高压灭菌器。

4.0.1 M CaCl 2
将 1.47 g CaCl 2 · 2H 2 O 溶解在 ddH 2 O 中至最终体积 100 mL，并对溶液进行高压灭菌。

5.0.85% 氯化钠
将 0.85 g NaCl 溶解在ddH 2 O 中至最终体积为 100 mL，并对溶液进行高压灭菌。

6.50× TAE 电泳缓冲液 (1,000 mL)
使用前用 1 M HCl 或 1 M NaOH 将pH调节至8.5，并用ddH 2 O 稀释至1 倍。

试剂最终浓度数量
Tris碱基2M242克
冰醋酸1M57.1毫升
乙二胺四乙酸100毫米37.2克
水分子_不适用至 1,000 毫升

7.LB 培养基 (1,000 mL)
– 55 °C 时，将 1 mL 卡那霉素 (50 mg/mL) 或氨苄青霉素 (100 mg/mL) 添加到 1 L LB 肉汤或琼脂中。
注意：蔗糖溶液应在 115 °C 下高压灭菌 30 分钟。
试剂最终浓度数量
胰蛋白胨1%10克
酵母提取物粉0.5%5克
氯化钠1%10克
琼脂粉1.5%15克（琼脂平板）
蔗糖15%150克（蔗糖盘）
水分子_不适用至 1,000 毫升

8.10× 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) (1,000 mL)
使用 1 M HCl 或 1 M NaOH 将 pH 调节至〜6.8。当稀释到1×PBS时，溶液的pH值应调整至7.4。
将 10× PBS 稀释为 1× PBS，然后在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟，对溶液进行灭菌。 4℃保存。将 1 mL 的 1× PBS 溶解在 99 mL 的 ddH 2 O (0.01 M) 中，并在使用前在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟进行灭菌。
试剂最终浓度数量
Na 2 HPO 4 · 12H 2 O100毫米35.814克
KH 2 PO 418毫米2.4496克
氯化钠1.37米80.0669克
氯化钾27毫米2.0129克
水分子_不适用至 1,000 毫升

实验室用品

1.培养皿，90 mm × 15 mm（Biosharp，目录号：BS-90-D）
2.1.5 mL Eppendorf 管（Biosharp，目录号：BS-15-M）
3.0.2 mL PCR 管（LABSELECT，目录号：PST-0208-FT-C）
4.移液器吸头（Biosharp，目录号：BS-10-T、BS-200-T、BS-1000-T）
5.细胞涂布器（Biologix，目录号：65-1001）
6.封口膜（封口膜，目录号：PM996）
7.12 mL 聚丙烯试管（Biosharp，目录号：BS-PPT-12-S）
8.10 mL 注射器（MOTUO，目录号： MT-ZSQ-04）
9.注射器过滤器（0.22 µm）（Merck Millipore，目录号：C134954）
10.无菌 50 mL 锥形管（LABSELECT，目录号：CT-002-50A）
11.96孔细胞培养板（Corning，目录号：CLS351172）
12.蓝盖试剂瓶（SHUNIU，目录号：250 mL，500 mL）

设备

1.移液器（Eppendorf，型号：3121000023、3121000090、3120000267）
2.超纯水系统（ZHIANG，型号：Best-D）
3.PCR仪器（BIO-GENER，型号：GET3XG）
4.微波炉（美的，型号：2105210600）
5.DNA电泳仪（Tanon，型号：EPS-300）
6.凝胶成像系统（Tanon，型号：Tanon 1600R）
7.UV胶水切割仪（Miulab，型号：DUT-48）
8.电热恒温（MIULAB，型号：DTC-100）
9.水浴锅（上海一恒，型号：DK-8D）
10.液氮容器（东亚，型号：YZD-50）
11.超净工作台（AIRTECH，型号：SW-CJ-1FD）
12.制冰机（雪客，型号：IMS-70）
13.恒温振荡培养箱（上海智初，型号：ZQZY-78AES）
14.涡旋（DLAB，型号：VJ218AG0003297）
15.4℃冰箱（中科都灵，型号：MPC-5V656）
16.-20℃超低温冷冻柜（中科都灵，型号：MDF-25V278W）
17.-80℃超低温冷冻柜（海尔，型号：DW86L626）
18.高压灭菌锅（BioNation，型号：CT-90A）
19.离心机 5424R（Eppendorf，型号：CENTRIFUGE 5424R）
20.高速冷冻离心机（Eppendorf，型号：CENTRIFUGE 5810R）
21.电子天平（RADWAG，型号：WTC-2000）
22.超微紫外可见分光光度计（BIO-DL，型号：微滴5803032204）
23.烘烤炉（CIMO，型号：DHG-9143BS-II）
24.烤箱培养箱（CIMO，型号：SPX-250BSH-II）
25.酶标仪（Molecular Devices，型号：SMP7）
26.pH计（Sartorius，型号：PB-10）

软件和数据集

1.SnapGene® （SnapGene， https ://www.snapgene.com/ ）
2.Tanon 1600 凝胶成像系统 (Tanon)
3.SoftMax Pro 7（分子设备， http://www.moleculardevices.com ）

程序

A.遗传转化

1.构建红色荧光蛋白（RFP）过表达盒
将多个具有重叠末端的 DNA 片段无缝连接的方法，能够构建更大、更复杂的 DNA 分子 [14]）构建 pET28a-P J23119 :: rfp质粒，该质粒在组成型启动子J23119 的控制。矢量图谱由SnapGene生成，详细过程如下：
a.使用 KOD 通过聚合酶链式反应 (PCR) 扩增目标片段。使用引物 F1/R1 从 pGD 质粒扩增 RFP 基因 (765 bp)。使用引物 F2/R2 从 pET28a 质粒扩增质粒主链 (3,651 bp)。 PCR的组成部分和程序描述如下（表1和表2）。
注：菌落 PCR。

表 1. KOD PCR 反应组分
成分体积最终浓度
KOD One TM PCR 预混液10微升1×
正向引物 (10 µM)1微升0.5微米
正向引物 (10 µM)1微升0.5微米
模板1微升-
水蒸气_ _至 20 µL-

表 2. KOD PCR 反应的热循环条件
步温度（°C）期间循环次数
初始变性983分钟1
变性9810秒35
退火塔5秒
扩大68每 kb 10 秒
最终延期682分钟1
抓住4无穷大-
Ta：PCR 选择的退火温度 (Ta) 直接取决于引物的长度和组成。引物的详细信息列于表S1中。

b.在 1× TAE 电泳缓冲液中通过 1% 琼脂糖凝胶电泳纯化 PCR 产物，然后使用凝胶纯化试剂盒进行凝胶提取。
c.测量 260 nm 处的吸光度并估计 DNA 浓度。
d.使用 EZ-HiFi 无缝克隆试剂盒构建质粒。重组反应混合物（10 µL）含有 5 µL 2× HiFi Seamless 克隆混合物和 5 µL 目标片段混合物（载体：插入片段摩尔比为 1:3；计算详情列于表 S2）。将合并的反应混合物在 50°C 下孵育 30 分钟，然后立即置于冰上或保持在 -20°C 直至使用。
e.按照制造商的说明，通过热休克方法将 10 μL 连接反应转化为 100 μL大肠杆菌DH5α 感受态细胞。这种热处理（通常约为 42°C）增加了细菌细胞膜的渗透性，允许外源 DNA 进入细胞。将转化混合物铺在 LB 琼脂培养基 (K + ) 上，并在 37°C 下孵育平板过夜。
f.用 2.5 μL 移液器吸头挑取菌落，并将挑取的菌落转移到 500 μL 液体 LB (K + ) 中。将 1.5 mL 管在旋转摇床（200 rpm）上于 37°C 孵育 12 小时。
g.使用 Super Taq DNA 聚合酶和引物 F3/R3 通过 PCR 确认转化体并使用 Tanon 1600 凝胶图像系统 (Tanon) 捕获凝胶图像。 PCR 生成的预期片段大小为 1,131 bp（图 2）。 PCR 的组成部分和程序描述如下（表 3 和表 4）。
注意：应将 2–5 µL 的 PCR 产物上样到凝胶上。

图2.携带 pET28a-P J23119 :: rfp的大肠杆菌DH5α 转化体的 PCR 扩增
表 3. Super Taq DNA 聚合酶 PCR 反应的组分
成分体积最终浓度
2× SuperTaq PCR StarMix5微升1×
正向引物 (10 µM)0.5微升0.5微米
正向引物 (10 µM)0.5微升0.5微米
模板1微升-
水蒸气_ _至 10 µL-

表 4. Super Taq DNA 聚合酶 PCR 反应的热循环条件
步温度（°C）期间循环次数
初始变性95℃2分钟1
变性95℃15秒35
退火58℃15秒
扩大72℃每 kb 30 秒
最终延期72℃5分钟1
抓住4无穷大-

h.使用桑格测序评估组装的准确性（ GENEWIZ公司）。测序数据可以通过 SnapGene 进行分析。
i.使用快速质粒小量制备试剂盒培养正确的菌落并提取质粒。将 pET28a-P J23119 :: rfp质粒储存在 -20°C 直至使用。

2.E. persicina感受态细胞制备
a.E. persicina BST187 最初在 100 mL LB 肉汤中生长并在 28 °C 下以 200 rpm 振荡孵育 12 小时，直至 600 nm (OD 600 ) 处的光密度为 0.4–0.8（使用 SoftMax Pro 7）。
b.将培养物转移到两个预冷的 50 mL 锥形无菌聚丙烯离心管中，并将其置于冰上 20 分钟。
c.将培养物在 4°C 下以 1,503× g离心 5 分钟。
d.将细胞沉淀重新悬浮在 5 mL 预冷的 0.1 M CaCl 2溶液中，并在冰上孵育 20 分钟。
e.将细胞在 4°C 下以 1,503× g离心 5 分钟。
f.将细胞沉淀重新悬浮在 2 mL 预冷的 0.1 M CaCl 2和 1 mL 预冷的 50% 甘油溶液中。两种成分在一个步骤中添加在一起。
g.上下移液或轻弹试管 4 – 5 次，轻轻混匀。将 100 μL 产生的感受态细胞储存在 -80°C 的 1.5 mL 离心管中，以进行进一步的转化步骤。
3.细胞转化
a.从 -80 °C 取出感受态细胞并在冰上解冻（大约 3-5 分钟）。将10 µL过表达质粒（约 50 ng/µL）添加到 100 µL 感受态细胞悬浮液中，并通过轻轻敲击管进行混合。
b.将感受态细胞置于冰上 30 分钟。
c.将混合物在42℃下加热90秒；然后，立即将其转移至冰上并孵育 2 分钟。
d.将 500 µL LB 肉汤添加到混合物中，并在 28°C 下以 200 rpm 的转速在摇床上孵育 60 分钟。
e.将混合物以 1,878× g离心 1 分钟。
f.弃去 500 µL 上清液，并将 100 µL 混合物涂在 LB 琼脂培养基 (K + ) 上。将板在 28°C 下孵育 24 小时以上，以获得转化体。
g.将菌落挑入 1 mL LB 肉汤 (A + +K + ) 中，并在旋转摇床 (200 rpm) 上于 28 °C 孵育 12-24 小时。将细胞以 4,509× g离心5 分钟，并在 UV 胶切割仪器下检查它们，以便于肉眼观察（图 3）。

图 3.携带pET28a-P J23119 :: rfp的 BST187 转化子

B.自杀质粒介导的基因组编辑

1.lacZ敲除质粒的构建
通过用NdeI消化位点片段（CATATG CATATG）替换染色体中的靶基因来进行基因敲除。基因敲除和染色体整合的载体构建示意图如图1所示。载体图谱由SnapGene生成，详细流程如下：
a.使用 KOD 通过 PCR分别扩增三个片段（ lacZ上游、 lacZ下游和 pKNOCK- sacB -km）。用于扩增每个片段的特异性引物对列于表S1中，PCR如上所述。
b.Gibson组装方法如上所述；将 10 µL 连接反应液转化为 100 µL 通过热休克法培养大肠杆菌DH5α λ pir感受态细胞。参见一般注释 3。
c.使用引物 F7/R7 通过 PCR 验证转化体（使用 Tanon 1600 凝胶成像系统）。 PCR 生成的预期片段大小为 2 , 081 bp（图 4）。 PCR的组成部分和程序如上所述。
d.使用快速质粒小量制备试剂盒培养正确的菌落并提取质粒。将 pKNOCK- sacB -km- lacZ质粒储存在 -20°C 直至使用。

图 4.携带 pKNOCK- sacB -km- lacZ的大肠杆菌DH5α λ pir转化体的 PCR 扩增

2.供体菌株的构建
a.按照制造商的说明，通过热休克方法将 10 μL 的lacZ敲除质粒转化为 100 μL 的大肠杆菌供体菌株 S17-1 λ pir感受态细胞。参见一般注释 3。

3.亲本共轭转化
a.供体菌株的制备：将大肠杆菌S17-1 λpir接种于 5 mL LB 肉汤 (K + ) 中，37°C 过夜，并以 200 rpm 摇动。
b.受体的制备：将E. persicina BST187 接种于 5 mL LB 肉汤 (A + ) 中，28 °C 下以 200 rpm 摇动过夜。
c.C将两种培养物以2,254× g离心 5 分钟并除去上清液。
d.用 3 mL 0.01 M PBS 缓冲液重悬细胞沉淀，并再次离心以除去上清液。重复PBS重悬和离心步骤两次，除去上清液。
e.将细胞沉淀重悬于 0.01 M PBS 缓冲溶液中，将 OD 600调整至 0.6–0.8 （使用 SoftMax Pro 7）。
f.、200 rpm 的转速下孵育混合物约 10 – 12 小时。
g.将 1 mL 缀合悬浮液在1,878× g下离心2 分钟，并保留 100 µL 上清液以重悬沉淀。
h.将 100 μL 重悬颗粒置于 LB 琼脂培养基 (A + +K + ) 上，并将板在 28°C 下孵育超过 24 小时。
4.重组交换
a.第一次重组交换：挑选接种在 500 µL LB 肉汤 (A + +K + )中的单菌落（图 5A），在 28°C 下以200 rpm摇动10 – 12 小时。参见一般说明 4。

图5. 第一次重组交换筛选和抗性验证的菌落。 A.第一次重组交换。 B. 电阻验证。

b.使用引物 F7/R8 通过 PCR 确认第一个交叉菌株（使用 Tanon 1600 凝胶成像系统）。 PCR产生的预期片段大小是1、794bp或4,866bp(图6A) 。
c.第二次重组交换：离心在1,878× g下单交换菌株2 分钟并除去上清液。
d.0.85% NaCl 溶液重悬细胞沉淀并进行梯度稀释（10,000倍）。将 100 µL 稀释液涂在 LB 琼脂培养基（15% 蔗糖）上，并将板在 28°C 下孵育 24 小时以上。
e.将单菌落挑入 500 μL 液体 LB（15% 蔗糖）中，并在 28°C 下在旋转摇床（200 rpm）上孵育12 小时。参见一般说明 5。
f.（使用 Tanon 1600 凝胶图像系统）通过 PCR确认第二重组交换菌株。 PCR 生成的预期片段大小为1887 bp 或 4,971 bp（图 6B）。
g.吸出条带大小为 1,887 bp 的 2.5 μL培养物，并将其分配到 LB 琼脂培养基（K + ）上，在 28°C 下培养 24 小时。获得的敲除菌株 (Δ lacZ )不在K + LB 琼脂培养基上生长（图 5B）。参见一般说明 6。

图 6. BST187 的 PCR 扩增完成重组交换。 A.第一次重组交换。 B.第二次重组交换。

数据分析

要验证基因组编辑事件，请通过菌落 PCR 扩增目标区域。
编辑效率=正确突变体数量/突变体数量测试的菌落数。

协议验证

有关该协议的使用和执行的完整详细信息，请参阅Zhao等人。 [13]。微调调节剂 AdmX 的基因表达，以改善桃欧文氏菌BST187 中 andrimid 的生物合成。应用微生物学和生物技术（图 3）。
一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.当用于构建E. persicina BST187 中的过表达盒时，T7 启动子不起作用。
2.当 J23119 启动子过度表达时，影响细菌生长的基因很容易发生突变。建议使用诱导型或中等强度的启动子 J23116。
3.重组自杀载体（复制子：R6K）依赖于感受态细胞中的 λ pir基因。
4.大肠杆菌S17-1 可以在 A +平板上生长并挑选异常大的菌落（图 5A）。
5.BST187将在蔗糖平板上快速生长，挑取菌落后，将平板置于4°C。
6.成功敲除菌株需要在 LB 琼脂培养基 (K + ) 中进行抗性验证，以避免残留抗性片段（图 5B）。
7.敲除效率与目的基因有关，根据我们的经验，编辑效率约为10% – 80%。
8.凝胶纯化片段时通常不需要DpnI 。

故障排除

在LB琼脂培养基（A + +K + ）上没有生长。
可能的原因：氨苄青霉素不稳定，导致 S17-1 菌株覆盖 BST187。
溶液：即用型氨苄青霉素平板。

问题2：第二次交换后，敲除菌株含有残余抗性。
可能原因：不完全自杀和蔗糖选择并不完全有效。
解决方案：选择阳性菌株并在15%蔗糖LB中重复筛选。

致谢

该工作得到了中科院百人计划（E3J56201）、天津市合成生物技术创新能力提升项目（TSBICIP-CXRC-027）和国际博士后交流奖学金项目（人才引进计划）的资助中国博士后理事会办公室信息（YJ20210438）。
我们要感谢我们的原始出版物 [13]。

利益争夺

作者没有竞争利益。

参考

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2.Gálvez, L.、Gil-Serna, J.、García-Díaz, M. 和 Palmero, D. (2015)。欧洲首次报道由桃欧文氏菌引起的大蒜球茎腐烂。植物病害99(5)：723–724。
3.Cho, H.、Park, JY、Kim, YK、Sohn, SH、Park, DS、Kwon, YS、Kim, CW 和 Back, CG (2019)。导致洋葱粉红软腐病的桃欧文氏菌B64的全基因组序列。微生物。资源。宣布。 8(1)：e01302–18。
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7.Wasendorf, C.、Schmitz-Esser, S.、Eischeid, CJ、Leyhe, MJ、Nelson, EN、Rahic-Seggerman, FM、Sullivan, KE 和 Peters, NT (2022)。桃欧文氏菌的基因组分析揭示了对植物软腐病致病性的影响。正面。微生物。 13：e1001139。
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补充资料

在此处下载以下支持信息：
1.表 S1。本研究中使用的信息引物
2. 表S2。同源重组连接