材料与试剂

材料

三叶期小麦幼苗（艾康58，中国农科院）
Miracloth（Calbiochem，目录号：475855-1R）
50 mL离心管（Corning，目录号：430290）
5 mL 移液器（Corning，目录号：4487）

试剂

管道（BBI，目录号：A600719）
山梨醇（BBI，目录号：A610491）
EGTA（密理博，目录号：324626）
DTT（Thermo Fisher，目录号：R0861）
精胺（Sigma-Aldrich，目录号：S3256）
亚精胺（Sigma-Aldrich，目录号：S2626）
37% 甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：818708）
PMSF（Thermo Fisher，目录号：36978）
甘氨酸（钻石，目录号：A100167）
1 M Tris-HCl（pH 7.5）（Sangon，目录号：B548124）
0.5 M EDTA（pH 8）（Sangon，目录号：B540625）
蔗糖（钻石，目录号：A100335）
MgCl ₂（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
CaCl ₂（Sigma-Aldrich，目录号：C3306）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
SDS（Thermo Fisher，目录号：28364）
苯酚:氯仿:异戊醇25:24:1（Wako，目录号：311-90151）
RNase（Thermo Fisher，目录号：EN0531）
异丙醇（Sangon，目录号：A507048）
1× TE缓冲器（Sangon，目录号：B548106）
甘油（钻石，目录号：A100854）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
Percoll（GE，目录号：17-0891）
MNase（Thermo Fisher，目录号：88216）
蛋白酶 K（Solarbio，目录号：17-0891）
用于 Illumina 的 NEBNext UltraTM DNA 文库制备试剂盒（NEB，目录号：E7645S）
Qiaex II 凝胶提取试剂盒（Qiagen，目录号：20021）

解决方案

细胞核隔离缓冲液（参见配方）
固定缓冲液（参见配方）
Percoll 缓冲液（参见配方）
MNase 消化缓冲液（参见配方）

食谱

注：列出的所有浓度均为最终浓度。

细胞核分离缓冲液

15 mM 管（NaOH，pH 6.8）

0.32 M 山梨糖醇

80 mM 氯化钾

20 毫米氯化钠

0.5 mM EGTA

2 毫米乙二胺四乙酸

1 毫摩尔 DTT

0.15 mM 精胺

0.5 mM 亚精胺
固定缓冲液

细胞核分离缓冲液，新鲜添加 1% 甲醛和 0.1 mM PMSF
Percoll 缓冲溶液

细胞核分离缓冲液中含有 50% (vol/vol) Percoll
MNase 消化缓冲液

50 mM Tris-HCl，pH 7.5

320 mM 蔗糖

4 mM 氯化镁₂

1 mM CaCl ₂

设备

研钵和杵（Avantor，目录号：HALDL55/1/G）
烧杯（30 mL）（PYREX，目录号：1000-30）
磁力搅拌器（Thermo Fisher，目录号：S194615）
杂交炉（格兰仕，目录号：P70J17L-V1）
4°C 离心机（Eppendorf，目录号：5804）
Nanodrop 2000（Thermo Fisher，目录号：13-400-412）

软件

Deeptools v3.4.3（马克斯普朗克免疫生物学和表观遗传学研究所；https://deeptools.readthedocs.io/en/latest/index.html）（2022 年 2 月）
Samtools v1.6（Genome Research Limited；http://www.htslib.org/doc/samtools.html）（2022 年 2 月）
BEDTools v2.29.1（犹他大学；https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/content/bedtools-suite.html）（2022 年 2 月）
R v3.2.2（朗讯科技；https://www.r-project.org/）（2022 年 3 月）
IGV v2.5.0（加州大学；http://software.broadinstitute.org/software/igv/）（2022 年 3 月）
Trimmomatic v0.36（USADEL 实验室；http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic）（2022 年 2 月）
Bowtie2 v2.3.4（约翰霍普金斯大学；http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）（2022 年 2 月）
FastQC v0.11.8（Babraham 生物信息学；https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）（2022 年 2 月）

程序

材料固定
1. 取样：从种子发芽21天后的三叶期小麦幼苗中收获叶或根10g（水漂洗），并立即将组织冷冻在液氮中。储存于-80°C。
2. 研磨：使用研钵和杵在液氮下研磨冷冻材料（预先用液氮冷却）。
3. 固定：在烧杯中准备 100 mL 预冷的固定缓冲液：添加 2.78 mL 37% 甲醛至 1%，以及 102 μL 100 mM PMSF 至 0.1 mM。将研磨好的样品倒入烧杯中，磁力搅拌样品 10 分钟 (100–200× g )。
4. 终止：通过添加 6.87 mL 2 M 甘氨酸储备液至 125 mM 来终止反应，并再磁力搅拌 5 分钟。
核提取
1. 搅拌：缓慢添加 12 mL 10%（体积/体积）Triton X-100 库存至 1%，轻轻搅拌，并孵育 10 分钟。现在预冷冷冻离心机。
2. 过滤：将溶液过滤到装有两层 Miracloth 滤布的烧杯中，并将 15 mL Percoll 缓冲溶液加入到 50 mL 离心管中。用移液器在溶液表面的顶部轻轻添加 35 mL 滤液，并确保液体沿管壁向下流动而不干扰边界层。4°C 3,000× g离心15 分钟（加速和减速应缓慢）（见注 1）。
3. 转移：离心后的Percoll滤液中层含有细胞核；将这一层转移至 50 mL 离心管中（参见注 1），并添加 1 倍体积的 MNase 消化缓冲液。在 4 °C 下以 2,000× g离心10 分钟。
4. 重构：将每 35 mL 的沉淀重新溶解在 2.5 mL 的 MNase 消化缓冲液中，并将样品分配到 5 个管中，每个管 500 μL。使用 Nanodrop 2000 测量并记录 DNA 浓度（大约 50–150 ng/μL）。
5. 显微镜检查：用荧光显微镜观察细胞核的形态。（细胞核可在液氮中快速冷冻，并在 -80 °C 下保存长达 1 个月。）
消化和解交联
1. 消化：将蛋白酶K、MNase和五管细胞核样品置于冰上解冻（细胞核只能解冻一次）；然后，用 10 U/mL MNase（轻）处理两个管样品，用 100 U/mL MNase（重）处理两个管样品，以及一个管样品作为对照。全部在室温下孵育 5 分钟（参见注释 2）。
2. 终止：添加 10.2 μL 0.5 M EGTA 库存至 10 mM，并振动样品以停止消化反应。
3. 去交联：加入 57.5 μL 10% SDS 至 1% 和 5.75 μL 10 μg/μL 蛋白酶 K 至 100 μg/mL，振动样品，并在 65 °C 杂交炉中孵育过夜（>6.5 小时）。
产品提取
1. DNA提取：加入等体积600μL苯酚:氯仿:异戊醇25:24:1，颠倒混匀。室温下以 12,000× g离心 10 分钟。将上清液转移至新的1.5管中，加入5 μL RNase至40 μg/μL，倒置混匀，37℃孵育15 min。添加 400 μL 预冷的异丙醇并轻轻混合。然后，将管置于-20°C 20 分钟以沉淀 DNA。预冷离心机并在 4°C 下以 12,000× g离心10 分钟。弃上清液，加入1 mL 70%乙醇，倒置混匀，洗涤两次。在通风橱中干燥剩余的乙醇 20 分钟。将沉淀物溶解在 30 μL 1× TE 缓冲液中。
2. 片段选择：运行 1% 琼脂糖凝胶（使用单色上样），选择并提取 100–200 bp DNA 片段（图 2，注 2），并使用 Qiaex II 凝胶提取试剂盒纯化 DNA。
图 2. MNase 消化的 DNA 带的阶梯。用不同浓度的 MNase 处理细胞核，从凝胶中纯化 100 至 200 bp 的 DNA 片段并进行测序。
文库制备和测序
1. 文库构建：使用 Illumina ^{®的 NEBNext}^® Ultra ^TM DNA Library Prep 试剂盒按照说明书构建 MNase-seq 文库，其中总 DNA 用量约为 1 μg。
2. 高通量测序：在 Illumina 平台 HiSeq2000 系统（或任何 Illumina 测序仪器）上对文库进行测序，以获得每个六倍体小麦样本（基因组大小约 15 G）的 150 bp 双端读数，其中 3 亿读数（约 90 G））（见注3）。对两个生物复制的文库进行测序。

数据分析

可以通过以下指令实现任意 MNase-seq 数据的分析，只需对给定代码进行少量修改。本协议使用的软件可以通过anaconda的conda命令（https://www.anaconda.com/products/individual）轻松安装，或者从官网下载并按照说明安装。在执行程序之前，请确保您的Linux设备已安装软件并正常设置环境。

上传数据：创建一个新的工作目录来存储所有MNase-seq相关的数据和文件，并将所有原始数据保存到该目录下的专用文件夹中。

cd data1/user/path #进入你的工作目录

mkdir MNase_seq

cd MNase_seq

mkdir raw_data # 将所有测序数据移至此目录
质量控制：利用FastQC对测序得到的原始数据的质量进行评估，包括基础统计、碱基和序列质量、GC含量、序列长度分布、接头内容等数据指标。

mkdir ./fastqc_结果

对于我在./raw_data/*.fq.gz

做

fastqc -o ./fastqc_结果 $i

完毕
Reads过滤：使用Trimmomatic等软件对原始数据进行过滤，得到干净的数据。此步骤的主要目标是去除接头序列、前导和尾随低质量或 N 碱基以及长度过短的序列。重命名过滤后的数据时，应考虑组织、消化和复制。例如，“leaf_light_rep1”可用于表示在叶子中进行轻度消化的第一个重复，“root_heavy_rep2”可用于表示在根中进行重度消化的第二个重复。

mkdir clean_data

java -jar trimmomatic-0.36.jar PE -phred33 \

./raw_data/*.r1.fq.gz \

./raw_data/*.r2.fq.gz \

./clean_data/$name.1P.fq \

./clean_data/$name.1U.fq \

./clean_data/$name.2P.fq \

./clean_data/$name.2U.fq \

ILLUMINACLIP:data1/用户/工具/Trimmomatic-0.36/适配器/\

TruSeq3-PE-2.fa:2:30:10:1:true \

前导：5 尾随：5 MINLEN：20 >trimmomatic.$name.log
质量控制：再次使用FastQC评估干净数据的质量。如果有任何不理想的情况，可以调整上一步的参数并重新过滤，直到reads可以用于下一步的比对。

对于我在./clean_data/*.fq.gz

做

fastqc -o ./fastqc_结果 $i

完毕
序列比对：使用Bowtie2软件将过滤后的干净数据与参考基因组比对。在此之前，使用 Bowtie2-build 构建基因组库并使用 Samtools faidx 索引 fasta 文件。使用与玉米中建议的相同参数进行对齐。

Bowtie2-build ref_genome.fa ref.genome

samtools faidx ref_genome.fa

Bowtie2 --phred33 -p 10 --重新排序-5 6 \

--no-mixed --no-discordant --no-unal --dovetail \

-x /index_path/ref.genome \

-1 ./$name.1P.fq \

-2 ./$name.2P.fq \

-S ./$name.sam >bowtie2.$name.log
非唯一和重复对齐去除：根据对齐结果中的MAPQ值进行筛选。MAPQ 值越大，唯一比对的置信度越高。这里，我们提取MAPQ > 20的部分。之后，去除由于PCR文库扩增而导致的重复reads。不同的软件（例如 Picard、Sambaba 或 Samtools）可以删除 PCR 重复项。这里，我们使用Samtools markdup，之前将双端测序数据按照reads名称和坐标依次排序。之后应该为大基因组建立bam文件的大索引。

函数 samtools_scripts(){

samtools视图-q 20 -bhS $name.sam -o $name.Q20.bam

samtools 排序 -n $name.Q20.bam -o $name.Q20.nsort.bam

samtools fixmate -m $name.Q20.nsort.bam $name.Q20.nsort.ms.bam

samtools 排序 $name.Q20.nsort.ms.bam -o $name.Q20.ms.psort.bam

samtools markdup -r $name.Q20.ms.psort.bam $name.Q20.psort.markdup.bam

samtools索引-c $name.Q20.psort.markdup.bam

}

samtools_scripts $name >samtools.$name.log
差异核酸酶敏感性（DNS）识别：在此处及后面的代码中，我们以“leaf_light_rep1”和“leaf_heavy_rep1”为例进行演示；您可以在运行其他示例时替换该名称。使用deepTools中的bamCompare从轻消化中减去重消化的映射读数，然后通过CPM方法标准化以输出bedgraph格式的DNS分数文件。这一步使用10-bp的bin进行划分和统计，然后使用50-bp的窗口进行平滑。

bamCompare -b1 leaf_light_rep1.bam -b2 leaf_heavy_rep1.bam \

--scaleFactorsMethod 无 --normalizeUsing CPM --操作减法 \

--binSize 10 --smoothLength 50 --outFileFormat bedgraph \

-o leaf_diff_rep1.bdg
贝叶斯因子计算：这里计算轻消化和重消化样本的reads覆盖率，并使用CPM方法进行标准化；然后，计算 10 bp 间隔内的读数覆盖率的贝叶斯因子。您可以通过运行分割的文件并分别计算它们的贝叶斯值来加速程序。

bamCoverage -b leaf_light_rep1.bam \

--binSize 10 --smoothLength 50 \

--normalizeUsing CPM --outFileFormat bedgraph \

-o leaf_light_rep1.bdg

bamCoverage -b leaf_heavy_rep1.bam \

--binSize 10 --smoothLength 50 \

--normalizeUsing CPM --outFileFormat bedgraph \

-o leaf_heavy_rep1.bdg

床具 Unionbedg \

-i leaf_light_rep1.bdg leaf_heavy_rep1.bdg \

-header -names 轻重 \

>leaf_rep1.unionbdg

# 运行R脚本获取名为“leaf_rep1.unionbdg.bayes”的文件

Rscript bayes_factor_caculator.R leaf_rep1.unionbdg
可访问染色质区域识别：根据“leaf_rep1.unionbdg.bayes”文件中的贝叶斯值，识别“leaf_diff_rep1.bdg”文件中的 MNase 敏感足迹 (MSF) 和 MNase 抗性足迹 (MRF)。DNS值大于0且Bayes值大于0.5的部分被定义为重要的MSF；DNS 值小于 0 且 Bayes 值大于 0.5 的部分被定义为重要的 MRF（参见注释 4）。将 200 bp 内的重要 MSF 或 MRF 信号合并为一个 MSF 或 MRF 信号。重要的 MSF 也称为 MNase 超敏 (MNase HS) 区域或 ACR（参见注释 5）。

床具 Unionbedg \

-i leaf_diff_rep1.bdg leaf_rep1.unionbdg.bayes \

>leaf.diff_rep1_bayes

猫叶.diff_rep1_bayes | awk '$4>0 && $5>0.5' | \

切-f1-3 | bedtools合并-d 200 \

>叶.MSF_rep1_bayes_0.5_merge_200.bed

猫叶.diff_rep1_bayes | awk '$4<0 && $5>0.5' | \

切-f1-3 | bedtools合并-d 200 \

>leaf.MRF_rep1_bayes_0.5_merge_200.bed
信号可视化：通过deepTools可以将不同消化处理得到的样本的reads覆盖深度和灵敏度印记DNS值生成bigwig文件，然后加载到Integrative Genomics Viewer（IGV浏览器）中进行浏览。MSF 或 MRF 位置文件也可以加载到 IGV 浏览器中。

bamCoverage -b leaf_light_rep1.bam \

--binSize 10 --smoothLength 50 \

--normalizeUsing CPM --outFileFormat bigwig \

-o leaf_light_rep1.bw

bamCoverage -b leaf_heavy_rep1.bam \

--binSize 10 --smoothLength 50 \

--normalizeUsing CPM --outFileFormat bigwig \

-o leaf_heavy_rep1.bw

bamCompare -b1 leaf_light_rep1.bam -b2 leaf_heavy_rep1.bam \

--scaleFactorsMethod 无 --normalizeUsing CPM --操作减法 \

--binSize 10 --smoothLength 50 --outFileFormat 大佬\

-o leaf_diff_rep1.bw
附计算贝叶斯因子的R脚本：使用前将脚本上传到“leaf_rep1.unionbdg”同一文件夹中，然后根据自己的实验修改工作路径、nh、nf等赋值。

### 贝叶斯因子计算器 1.0 ###

setwd(“data1/用户/路径/MNase_seq”)

中号=100000

NH=2

nf=2

bayes_factor_caculator <- 函数（旧，新）{

lkd.model1=函数(y,n,lambda){ return(exp(-n*lambda+y*log(lambda))) }

lkd.model2=函数(y1,n1,y2,n2,lambda1,lambda2){ return(exp(-n1*lambda1+y1*log(lambda1)-n2*lambda2+y2*log(lambda2))) }

BF_MC=函数(a,b,y1,n1,y2,n2,M){

lambda1=rgamma(M,a,b)

m1=cumsum(lkd.model1(y1+y2,n1+n2,lambda1))/(1:M)

lambda2.1=rgamma(M,a,b)

lambda2.2=rgamma(M,a,b)

m2=cumsum(lkd.model2(y1,n1,y2,n2,lambda2.1,lambda2.2))/(1:M)

回报(m2/m1)

}

con <- 文件（旧的，“rt”）

行 <- readLines(con,n=1)

而（长度（线）> 0）{

行 <- unlist(strsplit(行,split = "\t"))

qh <- as.numeric(行[5])

qf <- as.numeric(行[4])

设置.种子(1)

贝叶斯 <- BF_MC(10,1,qh,nh,qf,nf,M)[M]

newline=t(c(行[1],行[2],行[3],轮(贝叶斯,5)))

write.table(换行符、新行、col.names = F、row.names = F、sep = '\t'、quote=F、append =T)

行 <- readLines(con, n = 1)

}

关闭（反）

# BF_MC(10,1,qh,nh,qf,nf,M)[M]

# qh：重度消化的映射读取总数

# nh：重度消化的重复次数

# qf：光消化的映射读数总数

# nf：轻消化的重复次数

}

参数=命令参数(T)

bayes_factor_caculator（args [1]，paste0（args [1]，'.bayes'））

笔记

将滤液添加到Percoll垫中时应小心，沿管壁顶部缓慢添加滤液，不要引起界面的剧烈波动和液体之间的混合。离心时加速和减速一定要慢。离心后，应取出Percoll与滤液界面处含有细胞核的浑浊液体层，而不是离心管底部的沉淀。
应精确控制消化反应过程中 MNase 和 EGTA 添加的时间。此外，100-200 bp 片段的选择应该在不同样品和重复中精确且一致。
我们建议使用 PE150 对文库样本进行测序，在这种情况下，每个片段都可以被完全读取。测序深度可以根据基因组的大小来确定，其中小麦采用6×的覆盖度，最终的实际表现良好。具体实施时，可以预先测量一部分数据，然后根据效果确定深度测序数据量。
在识别显着的MSF和MRF时，如果背景信号过高，可以提高贝叶斯因子的阈值或者直接过滤掉长度过短的信号，以获得更加真实有效的信号，并可以组合反复调整以IGV浏览器实际显示为准。
在进行MNase-seq时，我们建议对组蛋白修饰进行ChIP-seq，例如激活修饰H3K9ac，这是一些ACR的显着特征，并且与ACR信号具有良好的共定位，可用于辅助识别。

致谢

该方案应用于我们的小麦开放染色质研究（Kong et al., 2024），该研究得到了中央公益性科研机构基础研究基金（Y2021YJ01）、国家自然科学基金（重大项目，31991213）的支持。）和国家自然科学基金（31971882）。我们主要参考了玉米的开放染色质研究文章（Vera et al., 2014; Rodgers-Melnick et al., 2016）。在该程序的开发过程中，我们得到了 Eli Rodgers-Melnick 和 Daniel L. Vera 的帮助。康奈尔大学的邹成教授为我们的算法提供了帮助。非常感谢他们的帮助！

利益争夺

不存在利益冲突或利益竞争。

参考

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Chereji, RV、Ocampo, J. 和 Clark, DJ (2017)。酵母中的 MNase 敏感复合物：核小体和非组蛋白屏障。摩尔。细胞。65(3)：565-577.e3。
Cook, A.、Mieczkowski, J. 和 Tolstorukov, MY (2017)。核小体占据和染色质可及性的单次分析分析。电流。协议。摩尔。生物。120、21 34 21-21 34 18。
方Y.、王X.、王L.、潘X.、肖J.、王XE、吴Y.和张W. (2016)。水稻双向启动子中开放染色质的功能表征。 科学。代表6：32088。
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克莱因 (Klein)，DC 和海纳 (Hainer)，SJ (2020)。分析 DNA 可及性和因子定位的基因组方法。染色体。资源。28（1）：69-85。
Lu, Z.、Marand, AP、Ricci, WA、Ethridge, CL、Zhang, X. 和 Schmitz, RJ (2019)。植物调控元件的流行、进化和染色质特征。纳特。植物。5（12）：1250-1259。
Mieczkowski, J.、Cook, A.、Bowman, SK、Mueller, B.、Alver, BH、Kundu, S.、Deaton, AM、Urban, JA、Larschan, E.、Park, PJ 等。（2016）。MNase 滴定揭示了核小体占用率和染色质可及性之间的差异。纳特。交流。7：11485。
Rodgers-Melnick, E.、Vera, DL、Bass, HW 和 Buckler, ES (2016)。开放染色质揭示了功能性玉米基因组。过程。国家。阿卡德。科学。美国 A.113 (22)：E3177-3184。
Schwartz, U.、Nemeth, A.、Diermeier, S.、Exler, JH、Hansch, S.、Maldonado, R.、Heizinger, L.、Merkl, R. 和 Langst, G. (2019)。表征人类细胞中 DNA 的核酸酶可及性，以绘制染色质的高级结构图。核。酸。资源。47：1239-1254。
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Vera, DL、Madzima, TF、Labonne, JD、Alam, MP、Hoffman, GG、Girimurugan, SB、Zhang, J.、McGinnis, KM、Dennis, JH 和 Bass, HW (2014)。染色质的差异核酸酶敏感性分析揭示了与玉米基因表达和功能 DNA 元件相关的生化足迹。植物。细胞。26（10）：3883-3893。
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赵红、张文、张天、林Y.、胡Y.、方成、姜J. (2020)。全基因组 MNase 超敏测定揭示了拟南芥中与 H3K27me3 和 DNA 甲基化相关的不同类别的开放染色质。基因组。生物。21（1）：24。

补充资料

数据和代码可用性：所有数据和代码均已存入 GitHub： https: //github.com/Bio-protocol/ACRs_by_MNase-seq。