材料与试剂

生物材料

1.伯氏疟原虫ANKA (676 m1cl1) – 感染史氏按蚊（乔治亚大学Spor oC矿石）
2.HepG2 人肝癌细胞系（ATCC STR 分析验证）

试剂

1.DMEM（Gibco ，目录号： 10313-021）
2.Pen Strep（Gibco，目录号：15140-122）
3.热灭活胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号：16140-071）
4.GlutaMAX（Gibco，目录号：35050-061）
5.TrypLE Express（Gibco，目录号：12605-028）
6.杜尔贝科氏PBS（DPBS）（Sigma，目录号：D8537）
7.PBS（Sigma，目录号：P3813）
8.Triton X-100（Sigma，目录号：T9284）
9.多聚甲醛（PFA）溶液，4％的PBS溶液（Thermo Scientific，目录号：30525-89-4）
10.青霉素链霉素新霉素（PSN）（100 × ）（Gibco，目录号：15640-055）
11.硫酸卡那霉素（Corning，目录号：30-006-CF）
12.两性霉素B （Gibco，目录号：15290-026）
13.庆大霉素（Gibco，目录号：15750-060）
14.DMSO（Sigma，目录号：D2650）
15.茴香霉素（EMD Millipore-Sigma，目录号：176880）
16.O-炔丙基嘌呤霉素（OPP）（Invitrogen，目录号：10459）
17.O-炔丙基嘌呤霉素（OPP）[Vector labs（以前称为 Click Chemistry Tools），目录号：CCT-1407-5]
18.Click- iT ® Plus Alexa Fluor ® 555吡啶甲基叠氮化物工具包（Invitrogen，目录号：C10642）
19.Click-&-Go ® Plus 555 成像套件（Vector labs，目录号：CCT-1317）
20.牛血清白蛋白（BSA）（Fisher Bioreagents，目录号：9048-46-8）
21.小鼠抗PbHsp70 一抗[13]
22.驴抗鼠 Alexa Fluor ® 488（Invitrogen，目录号：A21202）
23.Hoechst 33342（10 mg/mL）（Thermo Scientific，目录号：62249）
24.70%乙醇

实验室用品

1.25厘米2 细胞培养瓶（康宁，目录号：430168）
2.75 cm 2细胞培养瓶（Corning，目录号：430720U）
3.细胞过滤器，40 μm尼龙（Corning，目录号：431750）
4.细胞过滤器，100 µm 尼龙（Corning，目录号：431752）
5.0.22 µm 过滤器（ Millex ，目录号：SLGV004SL）
6.0.20 µm 过滤器（康宁，目录号：431229）
7.1 mL 注射器（BD，目录号：309659）
8.10 mL 注射器（BD，目录号：302995）
9.带皮下注射针的 1 mL 注射器（BD，目录号：309626）
10.50 mL锥形管（Corning，目录号：430828）
11.24孔细胞培养板（Corning，目录号：3524）
12.12 mm 圆形盖玻片，1.5 厚度（Azer，目录号：ES0117520）
13.Fluoromount -G（ SouthernBiotech ，目录号：0100-01）
14.96孔μClear细胞培养板（Greiner bio-one，目录号：655098）
15.96孔圆底板（Corning，目录号：3799）
16.5 mL 血清移液器（Corning，目录号：4487）
17.10 mL 血清移液器（Corning，目录号：4488）
18.25 mL 血清移液器（Corning，目录号：4489）
19.试剂储存器（Eppendorf，目录号：022265806）
20.活昆虫钳（FST，目录号：26029-10）
21.Dumont #5/45 盖玻片钳（FST，目录号：11251-33）
22.6孔板（Corning，目录号：351146）
23.Neubauer 室（品牌 GMBH，目录号：717805）
24.杵（Fisherbrand，目录号：12-141-363）
25.多通道架式移液器吸头，1,200 µL（Rainin，目录号：17002921）
26.多通道架式移液器吸头，300 µL（Rainin，目录号：30389255）
27.P1000 屏障移液器吸头（Thermo Scientific，目录号：2079）
28.显微镜载玻片 75 × 25 × 1 mm（VWR，目录号：16004-368）
29.1.7 mL 卡口管（Axygen，目录号：MCT-175-A）
30.金湿巾
31.纸巾
32.冰桶

解决方案

1.完整的 DMEM ( cDMEM )（参见食谱）
2.感染 DMEM ( iDMEM )（参见食谱）
3.DMSO 对照处理（参见配方）
4.茴香霉素控制治疗（参见食谱）
5.0.5% Triton-X（参见配方）
6.封闭液（参见配方）
7.Click- iT ® Plus Master Mix（参见配方）
8.1°（初级）抗体溶液（参见配方）
9.2°（二抗）抗体溶液（参见配方）

食谱

1.完整的 DMEM ( cDMEM )
试剂最终浓度数量或体积
DMEM88%（体积/体积）440毫升
胎牛血清
笔链球菌
谷氨酸最大10%（体积/体积）
1%（体积比）
1%（体积比）50毫升
5毫升
5毫升
全部的不适用500毫升

2.感染 DMEM ( iDMEM )
试剂最终浓度数量或体积
DMEM97.5%（体积比）97.5毫升
PSN
硫酸卡那霉素
两性霉素B
庆大霉素1%（体积比）
1%（体积比）
0.33%（体积比）
0.1%（体积比）1毫升
1毫升
334微升
100微升
全部的不适用100毫升

3.DMSO对照处理
试剂最终浓度数量或体积
DMEM不适用1,998 微升
二甲基亚砜0.1%（体积比）2微升
全部的不适用2,000 µL

4.茴香霉素对照治疗
试剂最终浓度数量或体积
DMEM不适用1,998 微升
10 mM 茴香霉素原液0.1%（体积比）2微升
全部的不适用2,000 µL

5.0.5% Triton-X
试剂最终浓度数量或体积
公共广播公司不适用4,750 µL
10% 海卫一 X-1000.5%（体积/体积）250微升
总计（可选）不适用5毫升

6.封闭液（2% BSA 的 PBS 溶液）
试剂最终浓度数量或体积
牛血清白蛋白2%（重量/体积）1克
公共广播公司不适用50毫升
全部的不适用50毫升

7.Click iT ® Plus 预混液
注意：所有试剂应按照制造商的说明书制备和储存。在制作主混合物之前，应将组分恢复至室温。每种预混液应新鲜配制并在 15 分钟内使用。应按所列顺序添加预混液的每种成分。 CuSO 4和铜保护剂混合物应在添加到主混合物中之前单独混合；这些组分单独储存，以便您可以通过调整 CuSO 4与铜保护剂缓冲液的比例来改变反应主混合物中铜催化剂的浓度。我们发现，与更高比例的铜-铜保护剂相比，1:4 比例的铜-铜保护剂可提供几乎相同的信号。此处报告的总体积是针对具有充足死体积的 96 孔板（32 个孔，每个孔 27 µL）而设计的。

试剂最终浓度数量或体积
分子级H 2 O78.3%（体积比）783微升
10 × Click -iT ®反应缓冲液
500 µM Alexa Fluor ® PCA 溶液
CuSO 4 -铜保护剂混合物
1 × x Click- iT ®缓冲添加剂8.7%（体积比）
1%（体积比）
2%（体积比）
10%（体积/体积）87微升
10微升
20微升
100微升
总计（可选）不适用1,000 µL

8.1°抗体溶液
注意：抗 PbHSP70 工作稀释度取决于抗体浓度；给出的稀释度是针对汉森实验室 2E6 杂交瘤生产的未纯化批次。抗体溶液在使用前使用 0.20–0.22 µm 过滤器进行过滤。
试剂最终浓度数量或体积
封闭液不适用1,592 微升
小鼠抗PbHSP701:200（体积/体积）8微升
总计（可选）不适用1,600 µL

9.2°抗体溶液
注意：抗体溶液在使用前使用 0.20–0.22 µm 过滤器进行过滤。
试剂最终浓度数量或体积
封闭液不适用1595.2微升
驴抗鼠 Alexa Fluor ® 488
赫斯特 33342 (10mg/mL)1:500（体积/体积）
1:1,000（体积/体积）3.2微升
1.6微升
总计（可选）不适用1,600 µL

设备

1.SP8共焦显微镜（徕卡，型号：TCS SP8）
2.解剖立体镜（徕卡，型号：S4E）
3.倒置相差显微镜（Zeiss，型号： Invertoskop 40 C）
4.倒置荧光显微镜（徕卡，型号：DM IL LED）
5.荧光光源（徕卡，型号：EL6000）
6.水浴锅（Thermo，型号：280系列）
7.CO 2培养箱（ Thermo ，型号： Napco Series 8000 WJ）
8.生物安全柜（LABGARD，型号：II级，A2型）
9.带吊桶转子的离心机（ Thermo ，型号： Sorval ST 40R，TX-750 转子）
10.Autotiv定制）
11.小型台式离心机（Eppendorf，型号：5415D）
12.多通道移液器 300 µL LTS（ Rainin ，型号：E4 XLS）
13.多通道移液器 1200 µL LTS（ Rainin ，型号：E4 XLS）

软件和数据集

1.LAS AF 3（徕卡）
2.MatrixScreener （HCS A Developer Full with CAM Leica）
3.CellProfiler (v2.1.1 rev6c2d896 , 7/25/2014)，用于图像分割和特征提取
4.CellProfiler （v2.0.11710，01 /24/2014），用于自动共焦反馈显微镜 (ACFM) 期间的在线图像分割和寄生虫 ID
5.KNIME 版本 4.7.7 及更早的 v4 版本(01/20/2022)，用于数据分析

程序

A.针对成像优化的 HepG2 细胞培养物

注意：涉及活 HepG2 细胞的所有步骤均在生物安全柜中进行。
1.准备cDMEM （配方 1）。
2.确保cDMEM 、DPBS 和TrypLE处于室温 (RT)。
3.将含有 HepG2 细胞的 T75 细胞培养瓶从 5% CO 2 、37 ℃ 培养箱中取出，从培养瓶中倒出培养基，并用 10 mL 的 DPBS 轻轻洗涤细胞单层两次。
关键：这些 DPBS 洗涤对于去除残留的cDMEM非常重要，残留的 cDMEM 可能会阻碍 TrypLE 消化步骤中细胞与细胞连接的破坏。
4.倒出第二次 DPBS 洗涤并添加 7.5 mL 室温 TrypLE。将烧瓶放回 5% CO 2 、37 ℃ 培养箱中 10 分钟。
重要：在孵育过程中请勿干扰烧瓶，也不要试图通过敲击烧瓶来破坏 HepG2 单层。破坏细胞与基质的附着比破坏细胞与细胞的连接要容易得多，而后者对于维持细胞的单层状态至关重要。
5.取出烧瓶，使用血清移液器将 7.5 mL 的cDMEM添加到 TrypLE ，使用分配液体的剪切力反复清洗细胞单层，以去除附着的细胞并分解任何连接的细胞团或细胞组。
6.从塑料基质中取出所有细胞后，使用血清移液器吸出细胞悬浮液，并通过无菌Ø 40 µm 过滤器分配到 50 mL锥形管中。
关键：过滤可去除任何可能干扰连续培养中或接种细胞进行感染时单层形成的大细胞团或细胞片。
7.将过滤后的细胞悬液以 315 ×离心 g (1,200 rpm) 5 分钟。
8.cDMEM重新悬浮颗粒（> 30 个上下循环）。
9.添加 9.1 mL 的cDMEM至重悬细胞中，并翻转数次以充分混合细胞悬浮液。
10.通过去除 10 µL 细胞悬浮液并将其添加到卡扣顶管中的40 µL cDMEM中，制备 1:5 稀释的细胞悬浮液。
11.将大量细胞悬浮液置于 4°C，同时对细胞悬浮液稀释度进行计数。
12.将 10 µL 1:5 稀释的细胞悬浮液分配到 Neubauer 室中，并对所有四个外象限进行计数（参见插图）。使用这四个象限的平均值，使用图 1 所示的公式计算悬浮液中的细胞浓度。

图 1. 计数室示例公式。计数室插图，显示用于计数的四个象限，并解释计算细胞/μL 和悬浮液中的细胞总数。

13.以所需的接种浓度制备细胞悬浮液，以便细胞持续繁殖（参见表 1）。

表 1. HepG2 细胞传代时间表。我们总是在每次细胞传代期间接种一个备用烧瓶，以防蚊子到达延迟、传代过程中主烧瓶受到污染等。我们通过主烧瓶的两次传代将每个备用烧瓶保持在培养箱中。我们在 p2 至 p15 的测定中使用 HepG2 细胞。 M = 百万。
周一周二周三周四星期五
T-75 初级烧瓶为周四分裂播种 2.4 m 细胞为周一分裂播种 1.8 m 细胞
T-25备用瓶0.8 m 细胞0.6 m 细胞

14.使用剩余的细胞悬液，继续进行 B 部分。

B.接种 HepG2 细胞进行感染
注意：该方案详细介绍了 96 孔板格式中伯氏疟原虫感染的 HepG2 细胞中肝脏阶段翻译和小分子诱导的翻译抑制的量化，但这也可以以盖玻片格式进行。详情请参阅一般注释 3。

1.计算实验所需的细胞数，并在cDMEM中制备适当稀释的接种溶液。在 24 孔板中接种 150,000 个 HepG2，体积为 500 µL [(24 孔 + 1 孔死体积) × 150,000 个细胞] = 3,750,000 个细胞悬浮在 (25 孔× 500 µL) = 12.5 mL悬浮播种。
注意：HepG2 细胞绝不应该成为限制试剂。由于在解剖之前无法完全预测子孢子产量，因此我们接种的 HepG2 孔总是多于我们预测所需的数量。
2.颠倒含有细胞悬浮液的试管几次，以确保其正确混合。
3.将 500 μL 细胞悬液分配到 24 孔板的每个孔中。
4.通过描画 ∞ 10-13 次，小心地重新分布每个孔内的细胞，将板旋转 180°，并再描画 ∞ 10-13 次。
关键：细胞分布不均匀会影响侵袭成功并阻碍成像。
注意：使用低倍显微镜检查几个孔的细胞分布。通过调整焦平面并在 Z 轴上移动孔内容，您可以很好地了解细胞分布。如果目视检查时细胞分布不均匀，请再次重复图 ∞ 步骤。
5.在第二天预计感染时间之前将板放回培养箱 20-24 小时。

C.伯氏疟原虫子孢子感染
注意：在 HepG2 感染之前，只要不直接处理溶液，将子孢子保持在冰上至关重要。和以前一样，涉及活 HepG2 细胞的所有步骤都在生物安全柜中进行。有关蚊子解剖和子孢子分离的更多信息，请参阅一般说明 1。

1.目视检查前一天接种的细胞，确保它们粘附并正常生长，并且没有孔被污染。
2.准备iDMEM （配方 2）。
3.将待解剖的蚊子收集到 50 mL 锥形管中，在 -20 ℃ 下冷麻醉 5 分钟，然后取出并将蚊子管水平放置在台式冰桶中的冰上。
关键：长时间暴露在 -20 °C或较低温度下会影响子孢子的活力。
4.使用昆虫钳，小心地将约 50 只蚊子转移到Ø µ m细胞过滤器中。使用 6 孔板作为清洗站，将其浸入含有 70% 乙醇的孔中（5-6 秒），用纸巾吸干多余的乙醇，然后浸入两个连续的孔中，在 HBSS 中冲洗。
注意：此清洗程序有助于减少蚊子表面微生物组的污染。
5.将蚊子转移到玻璃显微镜载玻片上的一大滴 DMEM 中，并使用非惯用手用皮下注射针的钝侧轻轻按下胸部来固定蚊子。使用惯用手中的另一根针，轻轻地将蚊子头（附有唾液腺）拉离胸部，并用针的锋利边缘将唾液腺从头部切开。
注意：如果唾液腺不与头部分离，则对胸部施加轻微压力将使唾液腺从胸部开口处移除。有关蚊子解剖和解剖学的其他资源和教学指南，请参阅一般说明 1。
6.将每组腺体转移到含有 100 μL DMEM 的 1.6 mL 卡口管中，并保存在冰上。
注意：在整个解剖过程中，冷麻醉的蚊子和唾液腺应保持在冰上，并且应尽量减少解剖所花费的总时间，以确保子孢子的活力。
7.使用无菌杵研磨分离的唾液腺 15-30 秒，释放子孢子，并用额外的 DMEM 清洗管壁和杵，保持 DMEM 的总体积低于 1 mL。
注意：必须破坏蚊子唾液腺才能将子孢子释放到介质中。如果此步骤未正确完成，子孢子将保留在唾液腺中，并在下一步中通过过滤去除。有关从唾液腺释放子孢子的其他资源和替代方法，请参阅一般说明 1。
8.将子孢子材料通过Ø 100 µm 细胞过滤器放入 50 mL 锥形管中。使用微量移液器，非常轻轻地从过滤器底部回收任何剩余的培养基，并将其添加到集合中。
9.将子孢子溶液离心 100 × g 30 s，以确保收集所有液体并将其转移到 1.6 mL 卡口管中。
10.准备1:5的计数稀释液，用手轻弹管子剧烈混合子孢子溶液；然后，取出 10 μL 的子孢子溶液，并将其添加到 40 μL 的 DMEM 中。使用转移子孢子的同一吸头用力移液混合该溶液。然后，将 10 µL 该溶液转移到 Neubauer 室中，将室放入湿润的、箔覆盖的培养皿中，并让子孢子沉降 8 分钟；然后，如图 1 所示计数子孢子。
注：如果单个 4 × 4 计数网格中的子孢子计数超过 100 个子孢子，最好进一步稀释计数稀释液，然后重复此处的步骤并重新计数（例如，将 40 µL 培养基添加到剩余 40 µL 计数中）溶液会产生 1:10 的稀释度）。
11.根据回收的子孢子总数，计算每孔可感染 100,000 个子孢子的孔数。
12.将浓缩子孢子稀释到iDMEM中，使用 300 μL 的总体积感染每个孔。假设在 800 µL 总体积中回收 100 万个子孢子，则 10 个孔可能被感染。为了达到 3 mL 的最终体积，将含有 1 × 10 6子孢子的 800 µL 添加到 2.2 mL 的iDMEM中。
13.从培养箱中取出 HepG2 细胞板，小心地从每个孔中吸出cDMEM ，并替换为上一步中制备的 300 μL 子孢子悬浮液。
14.离心板 2,000 × g ( 3,000 rpm) 5 分钟，然后将板放回5% CO 2 、37 °C培养箱中2小时。
注意：记录板返回培养箱的确切时间，因为这将对应于 t0，并且未来的步骤将在感染后设定的小时数（ hpi ）进行。
15.在 2 hpi时，从培养箱中取出板，使用 p1000 过滤头微量移液器从每个孔中提取iDMEM ，并添加 1,000 μL 的室温 DPBS。
16.取出dPBS ，并用 200 μL 的 TrypLE 替换。返回 5% CO 2 、37 °C 培养箱 10 分钟。
17.将板从培养箱转移至无菌罩，并向含有 TrypLE 的每个孔中添加 200 µ L 新鲜iDMEM 。
18.µ L的过滤头 P1000 ，在整个孔底部重复上下移液，使用流体力将受感染的 HepG2 (iHepG2) 从基质中移出到单细胞悬浮液中。然后，将整个 400 μL转移到50 mL 收集管中，并立即将 200 μL的iDMEM添加到孔中。
19.处理完所有孔后，逐孔检查板，以确保成功收获单层中的所有 iHepG2。
关键：一旦暴露于子孢子溶液，HepG2 甚至比正常情况更粘，缺乏经验的研究人员可能会发现每个孔中残留有许多细胞。如果是这样，请重复洗井步骤，用微量移液器通过流体力分离细胞，然后添加到收集管中。
20.使用血清移液器，将悬浮的 iHepG2 通过Ø 40 µm 过滤器转移到 50 mL 锥形管中，以去除任何大的细胞团和蚊子碎片。
21.×离心 G ( 1,200 RPM) 5 分钟。
22.丢弃上清液，并使用带有过滤尖端的 p1000 用 900 μL iDMEM重新悬浮颗粒（至少 50 个上下循环，因为与未感染的细胞相比，受感染的 HepG2 更难分离）。
23.iDMEM添加至最终体积等于 1 mL × 胰蛋白酶消化的孔数；因此，收获 10 个孔后，添加 9.1 mL。
24.取出少量受感染细胞悬液样本进行计数，并在计数时将大量细胞悬液置于 4°C。
25.将 10 µL 未稀释的受感染细胞悬浮液分配到 Neubauer 室中，并按先前所述对受感染细胞进行计数（图 1）。
26.根据回收的 iHepG2 细胞数，计算重新接种所需的孔和板数，并准备用于接种的 iHepG2 细胞悬液。 96 孔板的每个孔将接种 25,000 个 iHepG2，每孔总体积为 200 µL。典型的 iHepG2 回收率是24 孔板每孔约 2 00,000 个细胞，因此浓度将为 200 个细胞/μL。在本例中，我们将接种一块 96 孔板进行成像。由于所用显微镜物镜的空间位阻，我们仅在每个板的内部 32 个孔中进行操作，并且对于用电子 8 通道移液器接种的每个板，添加对应于一个孔的死体积。为此，总体积为 6.6 mL，需要(33 孔× 25,000 个细胞) = 825,000 个 iHepG2；需要 825,000 iHepG2/200 = 4.13 mL 的 iHepG2 悬浮液，将其添加到 2.35 mL 的iDMEM中。
27.将 iHepG2 接种悬浮液转移至无菌试剂槽中，并使用血清移液器上下移液 3-5 次，彻底混合溶液。
28.使用 p1200 8 通道电子移液器，将 200 µL iHepG2 悬浮液分配到所需数量的孔中。
29.让细胞在室温下避光沉淀 10 分钟，然后将板放入 5% CO 2 、37 °C培养箱中。

D.复合处理、OPP 标记和固定
注意：我们开发此协议是为了量化翻译抑制剂的活性，并将其与 DMSO 对照（测试化合物载体）和已知的活性对照（如茴香霉素）进行比较。下面列出的方案步骤是一种测定方式的详细演示 - 急性预处理形式，其中测试化合物和对照物应用于 24-28 hpi的 iHepG2 ；在处理期的最后 30 分钟，将 OPP 添加到每个孔中，并在处理化合物持续存在的情况下对新生蛋白质组进行标记。该测定可以通过多种方式进行修改；参见一般注释 2。

1.准备测试化合物处理、DMSO 对照处理和茴香霉素对照处理，将它们转移到与所需测定板布局匹配的 96 孔圆底板（如果尚未采用此格式）。执行此操作需要足够的时间，以确保解决方案处于 24 hpi的 RT 状态。
关键：无论测试的化合物浓度如何，处理、阳性对照和 DMSO 对照之间 DMSO 溶剂的浓度必须相同。每孔中的 DMSO 浓度应为 0.1%（参见配方 3-4）。
注意：我们在每个板上包括四个 DMSO 对照孔和一个茴香霉素活性对照孔，以确保后期分析过程中稳健的标准化。
2.在 24 hpi时，使用 p300 多通道移液器小心地从每个孔中吸出所有iDMEM ，并用步骤 D1 中准备的复合板中的 200 μL 含处理介质替换。然后将测定板恢复至 5% CO 2 , 37 °C 培养箱。
3.在 26.5 hpi时，在iDMEM中制备 250 µL 20× (400 µM) OPP 溶液，将 30 µL 转移到圆底 96 孔板的 A1–A8 孔中，并在 5% CO 2中预热，37 °C 培养箱。
关键： OPP 标签需要在 37 °C 下进行，才能实现高效且有效的标签。确保样品和 OPP 标签介质在贴标前适当加热至 37 °C。
注意：我们使用了两种不同来源的 OPP（参见试剂列表），并且未检测到标记存在差异。
4.在 27 hpi时，使用多通道移液器从每个孔中取出 105 μL 的处理介质，在每个孔中留下 95 μL。
5.将处理量减少的处理板返回培养箱 30 分钟。
注意：在添加 OPP 之前减少培养基体积并将样品放回培养箱 30 分钟，有助于确保添加 OPP 时样品的温度为 37 °C。
6.在 27.5 hpi时，将样品板和含有 OPP 标记溶液的板转移到生物安全柜。使用多通道移液器，将 5 µL 20× OPP 溶液分配到每个孔中。
注意：此步骤应快速执行，以防止介质冷却。
7.轻轻旋转培养板 5-6 次，快速将培养板放回培养箱，并启动 30 分钟计时器。
8.30 分钟后（在 ~28 hpi ），从培养箱中取出板，取下盖子，并将板面朝下放入吊桶转子液体去除室中。通过在 79× g下离心板15 秒去除介质。
关键：吊桶转子除液室需要按重量配对制造，在处理单个板的情况下，应通过向其他液体中添加等量体积（此处为 3.2 mL）的水来平衡离心机去除室并在其顶部放置匹配的空 96 孔板。
9.通过在已预热至 RT 的 PBS 中分配 100 µL 4% PFA 来固定细胞；让样品在 RT 下固定 15 分钟。
10.固定后，弹出 PFA，并用 200 μL PBS 清洗样品 3 次。
11.将板密封在封口膜中并在 4°C 下保存过夜。
注意：也可以通过点击化学直接进行透化和荧光团添加。我们已经成功地对4℃保存数天的样品进行了点击反应，并且没有降低点击反应的荧光信号强度或保真度，但应及时处理样品，以避免样品降解。如果板在 4 °C 下保存几天，则在 PBS 中添加 0.05% 叠氮化钠有助于减少细菌污染。

E.透化和点击化学荧光团添加

1.从 4°C 取出板并使其升温至 RT。
2.要透化，请弹出 PBS，并用 100 µ L 0.5% triton X-100 的 PBS 溶液（配方 5）替换，在 RT 下 20 分钟。
注意：Triton 溶液每次应使用 10% 的原液配制。
3.弹出透化溶液并用 100 µL PBS 清洗细胞 3 次。
4.将细胞在 100 µL 封闭溶液中孵育（配方 6），同时制备点击反应预混液（室温下至少 5 分钟）。
5.制作点击反应预混液 (MM) (Invitrogen click- iT ® Alexa Fluor ® 555 picolyl 叠氮化物）根据制造商的协议。要标记 32 个孔，每孔至少 27 µL，且死体积充足，您需要准备 1,000 µL（详见配方 7）。
关键：在制作 MM 之前，所有组件均应恢复至室温。
关键：准备预混液时，请按照制造商的建议，按照配方 7 中列出的顺序混合各个成分。
注意：我们还成功使用 Vector Labs Click-&-Go ® Plus 555 成像试剂盒进行点击反应，在荧光标记中未检测到差异。
6.弹出封闭溶液并将 27 µL 点击反应分配到每个孔中。让反应在室温下避光进行 30 分钟。
7.弹出点击反应MM，用封闭液洗板3次。
8.使用荧光显微镜，目视检查点击样品的每个孔，以确保 DMSO 对照在进行 DNA 或免疫荧光标记之前被明亮地标记。
9.在免疫标记之前，通过在封闭溶液中在室温下孵育 1 小时来封闭样品。
10.封闭后，甩出封闭液，更换为1°抗体溶液（配方8），室温避光孵育4小时。
11.除去1°抗体溶液，用封闭液清洗样品3次。
12.甩出封闭液并更换为 2° 抗体和 Hoechst 溶液（配方 9）。
13.将样品在 2° 抗体溶液中室温避光孵育 1 小时。
14.除去2°抗体溶液并用PBS洗涤样品3次。
15.继续进行图像采集步骤或用封口膜密封板并储存在 4°C 直至成像。
注意：板在 PBS 中成像。

F.图像采集
注意：我们在计算机辅助显微镜许可的 Leica SP8 共焦上使用自动共焦反馈显微镜 (ACFM)，运行MatrixScreener ，通过插件直接与早期版本的 Cell Profiler (v 2.0.11710) 连接 ( https://github.com/ VolkerH/MatrixScreenerCellprofiler/wiki ） [14] 。这些协调CellProfiler和MatrixScreener之间的任务控制，允许对低分辨率单层图像进行实时在线图像分割，以根据荧光和尺寸特性识别样品中的潜在寄生虫。然后，将识别的每个低分辨率 EEF 对象的中心坐标从CellProfiler传递到MatrixScreener ，这会触发每个 EEF 对象的高倍率自动对焦 Z 堆栈，其中 X 和 Y 位置由初始中心坐标设置，然后是高倍率，高分辨率多通道图像采集。该过程已在[15]中详细描述。反馈显微镜的不同实现方式是可能的，并且该过程允许收集大型、无偏见的单寄生虫图像集；然而，许多实验室无法使用这样的设置，但仍然可以通过传统的用户控制的图像采集来实现宿主和寄生虫新生蛋白质组的 OPP 成像。因此，我们在此介绍与用于控制图像采集过程的软件和硬件无关的过程中的关键步骤。无论自动还是手动图像采集，用户都应该是（或咨询）经验丰富的显微镜专家，能够确定其样品和系统的最佳图像采集设置。我们在安装的玻璃盖玻片、光学塑料底96孔板和384孔板以及各种玻璃底成像皿上进行ACFM成像实验；细胞单层基质、封固剂等的选择都会影响物镜的选择，最好由熟悉用户可用选项的经验丰富的显微镜专家来确定。在这里，我们将展示一个光学塑料底 96 孔板样品，其中含有测试化合物、DMSO 载体对照和茴香霉素处理的对照，该样品将抑制 HepG2 和伯氏疟原虫的翻译。

1.将板固定到载物台后，使用 63 ×水物镜检查 DMSO 对照样品，寻找最亮的 OPP-A555 荧光，并手动对一些寄生虫进行成像，以确定激光功率和 PMT 增益的适当设置，以便没有像素已饱和。重复此过程以确定 DNA 图像和 EEF 标记 ( P. berghei HSP70) 图像的最佳设置。
注意：为了评估 OPP-A555 标记的敏感性和特异性，可以按照 McLellan 等人，2023 年的图 S1 中所述的成像设置进行对照标记实验。所需的关键对照是 1) 未经 OPP 处理但经过点击标记和免疫染色的孔，以及 2)经 OPP 处理和点击标记但省略 Alexa Fluor555 picolyl的孔从反应混合物中取出叠氮化物。
2.保存这些设置后，移至茴香霉素对照井，并验证 EEF 标记图像是否可以轻松视觉识别使用 1) 中保存的设置获取的图像中的寄生虫。如果没有，请稍微调整 EEF 标记图像采集设置，直到实现此目标并保存设置。
3.图像文件的命名方案必须在开始图像采集之前决定，以便可以在数据分析过程中将图像明确分配给下游的特定井。我们建议咨询 REMBI 框架[16]来确定合适的图像命名方案，以促进元数据捕获。对于手动采集 96 孔板多个孔中的数据，我们建议使用 Experiment#_96wpANcooperative_YYYYMMDDimaged_Parasite#，例如 E15_C7_20230803_P12，其中实验编号可以与实验室笔记本中的完整实验详细信息相匹配，孔 ID 可用于将图像与平台图中接受的治疗相匹配，成像日期确保可以轻松识别适当的对照图像，而无需求助于图像编码元数据检查，并且为每个成像寄生虫分配一个从 1 开始的整数，允许每个寄生虫井中的图像集易于区分。
4.图像必须以公正的方式获取。如果手动获取图像，则除了寄生虫标记外无需可视化任何东西，并根据模拟计算过程的预定义规则系统地获取寄生虫图像，例如，从每个孔的左上角的起点开始，向右移动对遇到的前五种寄生虫进行采样并获取图像。然后，在样本中向下移动，使成像的最后一个寄生虫位于视野之外，并重复向左移动的过程。继续直到获取约 30 个图像集。
5.遇到寄生虫时，如果可能，请使用自动聚焦算法确定 Z 平面，或者手动聚焦每个寄生虫以最大化寄生虫区域（除了寄生虫标记之外无需目视检查任何东西），然后使用保存的设置顺序采集每个通道。
6.对板上的每个孔重复此过程。
关键：所有要直接比较的图像都应从单个成像会话中收集，并与上述 A-C 部分进行相同的处理。生物和技术变量都会导致实验之间的差异，这需要下游步骤中的数据标准化。在每次成像过程中收集可靠的 DMSO 控制图像集是绝对必要的。

G.图像分割和特征提取
CellProfiler中执行批量图像分割和特征提取。 cellprofiler.org上提供了学习使用该软件的资源。对于分析中的每个步骤（在CellProfiler中称为模块），有许多选项和参数设置调整，可以根据您的需求和特定样品进行优化。批量处理意味着必须在整个 Cell Profiler 分析流程中使用相同的设置来处理来自同一感染的所有样本，并且在该过程的每个步骤中都以相同且并行的方式处理这些样本。由于实验之间的技术和生物学差异，重复之间的图像强度可能会有所不同，并且需要对实验之间的设置进行小调整；然而，应始终使用相同的管道。对于在CellProfiler中分析的每个图像集，都会生成相应的平铺图像，通过文件名将元数据链接到相应的数据，并与提取的所有特征和专门配置的管道一起保存。有关定量生物成像的更多信息，请参阅生物学家规划和执行定量生物成像实验的指南 [17] .

1.将单个实验的所有图像集加载到CellProfiler中进行批量分析。每个图像集由来自不同荧光通道的三幅图像组成：1) 寄生虫和 HepG2 DNA，2) PbHSP70 标记的寄生虫，3) OPP-A555 标记的寄生虫和宿主的新生蛋白质组。
2.使用文件名中编码的元数据字段（在图像采集中描述），定义CellProfiler中的每个图像通道。
3.使用井位编码元数据，过滤图像以仅包含 DMSO 寄生虫，这些寄生虫用于建立管道每个分析步骤的设置。
4.首先，使用Smooth模块通过高斯滤波器减少数字噪声。典型的伪影直径设置将取决于您的图像分辨率和特征空间，但对于我们的大部分 ACFM 成像，我们使用的伪影直径为 2。
5.使用RescaleIntensity模块，对 EEF 图像和 DNA 图像执行强度重新缩放，以提高对比度并进一步减少分割噪声。我们通常根据多个 DMSO 图像集定义强度最小值和最大值，然后将像素重新缩放到完整强度范围。分割需要图像重新缩放，但不用于生成荧光强度指标。
6.使用IdentifyPrimaryObjects模块识别EEF 对象。我们使用全局阈值策略和二类 Otsu 方法。我们根据给定时间点已知的寄生虫大小范围定义 EEF 对象区域的下限和上限（以像素为单位），以减少伪影的产生。此外，我们排除任何接触图像边界的 EEF 对象。
7.使用ExpandOrShrinkObjects模块生成扩大和缩小几个像素的 EEF 对象。
注意：通常，EEF 非常靠近HepG2 细胞核，通常会在此处发现 HepG2 中最强烈的 OPP 信号；这些缩小和扩展的 EEF 对象用于后续掩蔽步骤，以消除宿主-寄生虫界面处的像素，从而准确定量寄生虫与 HepG2 新生蛋白质组的荧光。例如，请参见图 2。

图1 。在CellProfiler中生成的平铺图像示例。平铺图像提供原始图像、识别的对象和遮罩的视觉概览。它们对于理解如何优化给定数据集的批量分割参数非常有帮助。每个平铺图像都通过元数据链接到相应的数据，并且通过交互式 KNIME 工作流程 ( https://hub.knime.com/-/spaces/ ) 定期检查质量控制或探索性数据分析中感兴趣的数据点的图像平铺。 -/~TZCrKvv3sbJwM_xP/当前状态/ ）。此平铺图像中的代表性寄生虫来自感染后 48 小时 ( hpi ) 时间点。橙色箭头指示的收缩的外红细胞形式 (EEF) 轮廓位于蓝色箭头指示的扩张的 EEF 轮廓内部。 OPP，邻炔丙基嘌呤霉素。

8.使用MaskImage模块将反向收缩的 EEF 对象掩模应用于 DNA 和 OPP-A555 图像，以分析寄生虫特异性荧光。
关键：您需要为CellProfiler模块中生成的每个对象和遮罩图像创建唯一且明确的名称，因为这些对象和遮罩图像用于对象面积和图像强度的下游测量。
9.在另一个MaskImage中模块中，使用扩展的 EEF 对象来掩盖 DNA 和 OPP-A555 图像，以分析 HepG2 特征。
10.将IdentifyPrimaryObjects模块应用于屏蔽图像以进一步定义任何其他感兴趣的特征，例如EEF DNA 对象和HepG2 DNA 对象。
11.使用“Tile”模块构建一个平铺图像（图 2），其中包含原始图像、合并通道、关键分割步骤中的对象轮廓、遮罩图像等。然后，使用 SaveImages 模块定义平铺图像所在的文件夹位置使用元数据编码的输入文件名编写并定义平铺图像输出名称。平铺图像（图 2）为质量控制 (QC) 和图像内容的地面实况确定提供了单点参考，我们通常使用交互式 KNIME 工作流程（在第 1 节中描述）进行检查 H）;可以在 KNIME 中心下载示例工作流程 ( https://hub.knime.com/-/spaces/-/~TZCrKvv3sbJwM_xP/current-state/ )。
12.使用MeasureObjectSizeShape 、 MeasureImageAreaOccupied和MeasureImageIntensity模块提取上游模块中定义的对象和蒙版图像的特征。
13.最后，使用ExportToSpreadsheet模块定义输出文件位置、命名方案以及要将哪些功能导出到电子表格。
注意：与对象相关的所有测量值将写入单独的 CSV，图像测量值将写入图像 CSV。
重要：如果您手动选择要包含哪些特征测量，请务必在 H 节中的数据分析步骤期间包含所有必要的元数据，以将对象特征连接到图像 CSV。
14.当管道准备好运行时，将副本保存到磁盘并单击“分析图像” 。

H.数据分析
注意：我们使用KNIME进行所有数据清理和探索性分析。我们的 ACFM 工作流程会生成任何被识别为满足低分辨率、低放大倍率图像中定义 EEF 对象的荧光和尺寸属性的图像，但并非从中提取数据的每张图像都符合我们纳入下游数据分析的标准。为此，图像必须在 HepG2 单层中包含单个、居中、聚焦良好的寄生虫。由于我们努力有意义地量化蛋白质合成中单一寄生虫的变异，因此我们迭代优化了我们的 QC 过滤器（图 3）来实现我们的目标。根据图像所包含内容的基本事实，某些图像将无法通过质量控制，而其他图像将在识别出分割失败时被过滤。在我们的分析中，每一行包含来自单个 ACFM 图像的数据。因此，每个图像都通过提取的数据通过 QC 过滤器，并且在不满足 QC 标准的情况下，整行将被第一个过滤器标记并从主数据集中删除。分析完所有数据后，过滤后的图像将构成一个单独的数据集，通过交互式仪表板进行探索，以识别任何系统问题并确保数据完整性。（请参阅“验证”部分，获取 KNIME 中心上的 QC 和探索性数据分析工作流程的链接。）一旦我们获得了由通过 QC 的所有图像组成的最终数据集，我们还会在 KNIME 中执行探索性分析和可视化，并为任何统计准备数据。其他平台中的测试或可视化。

图 3.带有示例图像的图像数据质量控制步骤。在数据标准化或分析之前，旨在识别和去除混杂图像数据的质量控制过滤器会一致地应用于整个数据集。示例图像代表感染后 28 小时 ( hpi ) 数据集的图像伪影和图像分割伪影。多种类型的伪影将被多个过滤器识别并去除。 ACFM，自动共焦反馈显微镜； EEF，红细胞外形式。

1.CellProfiler中提取的关键特征是寄生虫和图像内 HepG2 细胞中 OPP-A555（对应于 30 分钟新生蛋白质组）的荧光强度值。在我们的 96 孔板中，我们有四个 DMSO 对照孔。计算四个孔中所有 DMSO 处理的 EEF 寄生虫的 OPP-A555 平均荧光强度 (MFI)。该值设置为 100。
2.同样计算四个孔中所有经 DMSO 处理的图像内 HepG2 的 OPP-A555 平均荧光强度 (MFI)。该值也设置为 100。
3.HepG2的数据标准化为相关 DMSO 对照 OPP MFI 的百分比；例如，如果控制 OPP MFI 为 0.27（设置为 100），则 OPP MFI 为 0.11 的孔将标准化为 [(0.11/0.27) × 100] = 40.7
注意：在 KNIME 中，我们使用标准化板 (POC) 节点对数据进行标准化。
4.例如，使用归一化数据来比较茴香霉素对照在三个独立实验中抑制伯氏疟原虫肝脏阶段和 HepG2 翻译的能力。
5.对于 KNIME 之外的分析或可视化，请使用CSV 写入器节点将数据集写入磁盘。

协议验证

该协议已在以下研究文章中使用和验证：
•McLellan 等，2023。伯氏疟原虫肝脏阶段转化的单细胞定量生物成像。 mSphere 。 DOI： https: //doi.org/10.1128/msphere.00544-23 （整篇论文）。
•McLellan & Hanson，2023。翻译抑制功效并不能决定蛋白质合成抑制剂的伯氏疟原虫肝期抗疟原虫功效。 BioRxiv 。 DOI： https://doi.org/10.1101/2023.12.07.570699 （图1、2、3、6C、S1、S2、S3、S4、S6）

KNIME 探索性数据分析和 QC 工作流程：
•KNIME hub QC 和探索性数据分析交互式工作流程对应于[11]的图 1 ： https://hub.knime.com/-/spaces/-/~TZCrKvv3sbJwM_xP/most-recent/
•KNIME 中心探索性数据分析交互式工作流程，其中包含用于生成图2-3 和[11]的相关补充图的数据： https://hub.knime.com/-/spaces/-/~EcnvMwYtqylu2reV/current-state/

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.解剖受感染的蚊子和从唾液腺中分离子孢子的首选方法往往因实验室而异，并且其中几种方法的详细方案先前已发表。
a.蚊虫解剖：
i.[18]的详细生物方案概述了从按蚊 ADDIN EN.CITE (Anopheles dirus)中分离唾液腺 E 部分的步骤 1-8。这还包括演示视频 2 中的解剖步骤的视频。
ii.另一个生物协议[19]提供了关于从未感染的蚊子身上去除唾液腺的分步教程，并附有详细的图表。
iii.有关蚊子解剖和唾液腺切除的详细视频，请参阅《视觉实验杂志》 [20]和Wellcome Trust 电影单元[21] 。这些包含对解剖显微镜下分离的唾液腺外观的准确描述。
b.从唾液腺中分离子孢子：
i.Sinnis实验室网站[22]的子孢子分离和计数方案详细介绍了他们使用 Dounce 匀浆器破坏唾液腺并通过离心分离子孢子。
ii.另一个先前的生物协议[23]概述了他们使用聚四氟乙烯均质器和过滤步骤来分离子孢子。
iii.使用梯度离心从全蚊裂解液中独立于解剖分离子孢子的方案[24]强调了另一种方法。
iv.使用透射光显微镜观察的子孢子图像示例可参见[25]的图 5A和图 1A [26] 。
2.虽然我们在这里详细介绍了 4 小时化合物预处理格式，但 OPP 测定非常灵活。我们还在竞争 (co-OPP) 模式下广泛运行了检测，其中与 OPP 同时添加了感兴趣的化合物。已知的直接翻译抑制剂在 co-OPP 和急性预处理测定中显示出相似的效力和功效[10] ，我们建议 co-OPP 模式来测试未表征的目标化合物是否可能充当疟原虫翻译抑制剂。我们使用了 30 分钟的 OPP 标记而不进行复合处理，以可视化整个伯氏疟原虫肝脏阶段发育（从子孢子到肝裂殖子）的翻译。由于寄生虫的大小和形状在发育过程中发生巨大变化，因此需要相应地调整图像采集、分割、特征提取和质量控制的参数以进行量化。我们还证明了恶性疟原虫血液阶段寄生虫（从环状阶段到裂殖体）中的特异性 OPP-A555 标记，其他人已经使用 OPP 标记通过流式细胞术量化恶性疟原虫无性血液阶段翻译[27] 。我们仅使用 30 分钟的 OPP 标记周期来量化伯氏疟原虫翻译，但我们已经能够在 OPP 处理时间短至 5 分钟的情况下可视化伯氏疟原虫新生蛋白质组。
3.除了主协议中描述的 96 孔板格式之外，我们还量化间接感染在 24 孔板的玻璃盖玻片上培养的 HepG2 单层的翻译。该协议与以下内容相同：
a.B 部分，步骤 1：将 75,000 个 HepG2 细胞以每孔 500 µL 的量接种到玻璃盖玻片上。将细胞接种悬浮液分配到每个孔后，使用移液器尖端轻轻地将盖玻片压到培养皿底部，以避免细胞附着在盖玻片底部。
b.C 部分，步骤 10：盖玻片每孔最多感染 50,000 个子孢子，但最小数量可以根据成像方式和子孢子可用性进行调整。
c.C 部分，步骤 14：不要分离并重新接种受感染的细胞，而是从培养箱中取出培养板，吸出子孢子悬浮介质，然后更换为 1 mL 的新鲜iDMEM 。然后，返回培养箱并继续步骤 D。
d.D 部分，几个步骤：处理和 OPP 标记过程中的体积增加，以适应更大的孔体积。每孔使用 500 µL 进行化合物预处理，并使用 300 µL 进行 OPP 标记。
e.E 部分，几个步骤：使用 500 µL 进行透化和清洗步骤。要在盖玻片 (CS) 上进行点击反应，请使用盖玻片钳从 2% BBS 中取出 CS，轻轻吸干纸巾上的边缘以吸走 BBS 溶液，将倒置的 CS 放在一块封口膜上（细胞朝上），并分配 30 µL 点击反应 MM。我们发现，使用锡纸覆盖的载玻片盒，其中含有水饱和的 Kimwipe，可以很好地防止点击反应期间 MM 的蒸发。将 CS 返回到 24 孔板进行 PBS 清洗。抗体标记步骤以相同的方式进行。标记完成后，将盖玻片安装到玻璃载玻片上，细胞面朝下，放入一滴Fluoromount -G 中，并让它们在成像前固化过夜。
4.HepG2 细胞可从 ATCC（货号 HB-8065）和其他国家细胞库获得。如果您从 ATCC 获取 HepG2 细胞，或者从任何细胞大量生长成团的 HepG2 细胞库存开始，您可能需要在 12.5 cm 2培养皿/烧瓶（或更小，如有必要）中进行多次细胞传代，除去如程序 A 部分所述聚集细胞，直到回收足够的细胞以扩大培养规模。

故障排除

问题 1：胰蛋白酶消化期间iHepG恢复率低。
可能的原因：未能从塑料上去除所有细胞。
解决方案：如 C 部分步骤 17-18 中所述，收集细胞悬液后立即向每个孔中添加 200 µL iDMEM ，并在相差显微镜上仔细检查每个孔，以确保没有细胞附着在基质上。如有必要，可以多次执行此操作。 iHepG2（暴露于子孢子溶液中）明显比未感染的 HepG2 更难从塑料基材上分离。

致谢

iHepG2 恢复和重新播种协议最初是为比尔和梅琳达盖茨基金会（OPP1141284 至 KKH）支持的工作而开发的。伯氏疟原虫肝脏阶段蛋白质合成定量测定的开发得到了美国国立卫生研究院的支持（R21AI149275 至 KKH）。 JLM 得到了南德克萨斯新发传染病中心奖学金的支持。该协议改编自 McLellan 等人的出版物。 [10]以及预印本 McLellan 和 Hanson [11] 。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

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