材料与试剂

生物材料

1.HeLa（ATCC ，目录号：覆铜板-2)
2.肠沙门氏菌鼠伤寒血清型 SL1344 [23]
注意：出于检测目的，感兴趣的病原体必须表达与红色波长（例如 GFP）无关的荧光蛋白。这可以是穿梭质粒的形式，例如 pFPV25.1（表达 GFP）或带有染色体插入的菌株。如果之前没有针对感兴趣的病原体建立这一点，则存在可能值得研究的广泛宿主谱穿梭质粒[24]。

试剂

1.Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)，4.5 g/L 葡萄糖，含 L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和酚红）（Wisent，目录号： 319-005-CL)
2.胎牛血清（FBS）（Wisent，目录号： 080-450）
3.LB Miller肉汤（BioShop，目录号： LBL407）
4.琼脂，细菌学级（BioShop，目录号： AGR001）
5.硫酸链霉素（BioShop，目录号： STP101）
6.羧苄西林钠盐（BioShop，目录号： CAR544）
7.含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水（PBS +/+ ）（Wisent，目录号： 311-011-CL）
8.硫酸庆大霉素（BioShop，目录号： GTA401）
9.DQ-Red BSA（Thermo Fisher，目录号： D12051）
10.不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水（PBS -/- ）（Wisent，目录号： 311-425-CL）
11.Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI)，L-谷氨酰胺和 HEPES，不含碳酸氢钠（Wisent，目录号： 350-025-CL）

解决方案

1.链霉素储备液（参见食谱）
2.羧苄青霉素原液（参见配方）
3.LB 琼脂溶液（用于 LB 琼脂平板）（参见配方）
4.DQ-Red BSA 溶液（参见配方）

食谱

1.链霉素储备液 (1 mL)
注意：将粉末溶解在水中并充分涡旋直至粉末溶解。在无菌区域（例如本生灯或 II 级生物安全柜）中，将库存过滤灭菌到无菌管中。
试剂最终浓度数量或体积
硫酸链霉素50毫克/毫升50毫克
双蒸水（ddH 2 O）不适用至 1 毫升

2.羧苄青霉素储备液 (1 mL)
注意：将粉末溶解在水中并充分涡旋直至粉末溶解。在无菌区域（例如本生灯或 II 级生物安全柜）中，将灭菌原料过滤到无菌管中。
试剂最终浓度数量或体积
羧苄西林钠盐100毫克/毫升100毫克
双蒸水（ddH 2 O）不适用至 1 毫升

3.LB 琼脂溶液 (500 mL)
注意：将粉末溶解在水中，并使用搅拌棒充分混合，直至粉末尽可能溶解。使用液体实验室介质标准设置的高压灭菌器。如果需要补充抗生素，当高压灭菌的培养基冷却至摸起来温暖时，在无菌区域添加适当浓度的抗生素原液。在搅拌板上搅拌后，使用无菌区域在每个培养皿中倒入一层琼脂补充培养基。允许在室温下固化并将固化板储存在 4°C 下。
试剂最终浓度数量或体积
LB 米勒肉汤（粉）25克/升12.5克
琼脂15克/升7.5克
双蒸水（ddH 2 O）不适用至 500 毫升

4.DQ-Red BSA 库存溶液 (1 mL)
注意：将粉末溶解在 PBS -/-中，并通过涡旋充分混合。如果需要，超声处理以帮助溶解试剂。一旦溶解，试剂可以在 4°C 下保存数周。请注意，DQ-Red BSA 是光敏的。储存在用箔纸覆盖或不透明的样品管中，并尽可能在黑暗中处理。
试剂最终浓度数量或体积
DQ-红BSA2毫克/毫升1毫克
美国公共广播公司-/-不适用至500 μL

实验室用品

1.玻璃底显微镜室（ibidi，目录号： 80827-90）
2.离心管，聚丙烯，无菌（Corning，目录号： C352098）
3.无菌血清移液器（Sarstedt，目录号： 86.1253.001）
4.用于细菌学的培养皿，无菌（Sarstedt，目录号： 82.1473.001）
5.圆底培养管，无菌（Corning，目录号： C352059）
6.无菌注射器（BD，目录号： B309659）
7.注射器过滤器，无菌（Millipore Sigma，目录号： SLGP033RS）
8.磁力搅拌棒（Fisherbrand，目录号： 800371113）

设备

1.CO 2培养箱（Nuaire，型号：NU-425-400）
2.细菌培养箱（新不伦瑞克省，型号：Innova 42）
3.群体旋转圆盘荧光显微镜（Leica，型号：DMIRE2，Hamamatsu，型号：CMOS FL-400）
4.本生灯（EISCO，型号：CH0095B）或 II 级生物安全柜（Nuaire，型号：NU-602-600）
5.分析天平（梅特勒-托利多，型号：ML304T）
6.搅拌板（Thermo Scientific，型号：SP131525）
7.高压灭菌器
8.涡流（VWR，型号：G-560）
9.微量离心机（Eppendorf，型号：5425）

软件和数据集

1.斐济（ImageJ，v1.54f 29，2023 年 6 月）（免费分析软件）
程序

A.细菌病原体感染

以下方法用于研究宿主上皮细胞的鼠伤寒沙门氏菌感染（图1B）。该方案适用于多种细胞内病原体和多种细胞类型的感染。协议中强调的是定制该测定法以研究不同宿主细胞类型、病原体和应用的重要考虑因素。还提供了有关常见挑战和建议的故障排除策略的信息。

1.在玻璃底显微镜室中种子宿主细胞。对于比较研究，例如识别与表型相关的毒力因子或负责功能的毒力因子内的域（表 1 中的附加信息），每个菌株需要一个孔。为了分析HeLa 细胞的鼠伤寒沙门氏菌感染，使用补充有 10% FBS 作为培养基的 DMEM，以 6 × 10 4 个细胞/孔将 HeLa 细胞接种到 μ-Slide 8 孔玻璃底室中。
注意：对于同基因敲除菌株的比较研究，需要使用互补菌株以排除极性效应的可能性。已经针对不同的细胞内病原体建立了用于这些目的的互补质粒。

表 1. DQ-Red BSA 测定在细菌发病机制研究中的应用
检测目的所需菌株其他信息和注意事项
验证抑制宿主溶酶体贩运野生型• 贩运抑制动力学可能因菌株和宿主细胞系而异；如果尚未确定感兴趣的时间点，则可能需要进行时程分析
• 播种：每个感兴趣的时间点接种一口井
毒力因子鉴定野生型、同基因敲除、互补菌株• 如果需要，可以将测定规模缩小到较小的格式，以适应更大规模的敲除筛选
• 一旦确定了候选毒力因子，就必须与互补菌株进行比较来重复实验
• 互补：所有菌株必须具有相同的互补基础质粒，无论是否带有目的毒力因子基因
毒力因子域图谱野生型、同基因敲除、含有野生型和截短突变体的互补菌株• 所有菌株必须具有相同的互补基础质粒，无论是否带有目的毒力因子基因
Phyre2 [26] 等计算机工具可以提供有价值的见解来指导假设
• 如果毒力因子已知或预测催化位点或功能残基，也可以并行评估点突变

2.2培养箱中培养宿主细胞，直至达到感染目标病原体的最佳汇合度。对于上皮细胞的鼠伤寒沙门氏菌感染，孵育过夜直至宿主细胞达到 70%–80% 的汇合度。
3.同时，准备病原体接种物，以便当宿主细胞处于感染的最佳汇合水平时，准备好感染。对于携带 pFPV25.1 的鼠伤寒沙门氏菌 SL1344，这需要在接种宿主细胞当天建立过夜培养物。用 2 mL LB 接种无菌细菌培养管，补充有 50 μg/mL 链霉素（用于选择菌株）和 100 μg/mL 羧苄青霉素（用于选择 pFPV25.1），并在补充有 LB 琼脂上生长多个单菌落50 μg/mL 链霉素和 100 μg/mL 羧苄青霉素。在 37°C 和 250 rpm 下孵育 16 小时。
4.感染当天，按照感染前的要求准备病原体接种物。对于上皮细胞的鼠伤寒沙门氏菌 SL1344 感染，在含有 10 mL LB 的无菌 125 mL 烧瓶中，从过夜培养物 (1:33) [25] 进行传代培养，并在 37 °C 和 250 rpm 下孵育 3 小时。通过在 10,000 ×下沉淀 1 mL 培养物来制备接种物 g 2 分钟，将沉淀重悬于 PBS +/+中至 1 mL，并在 PBS +/+中稀释至适当的感染复数。对于鼠伤寒沙门氏菌 SL1344，建议使用 1:100。
注意：此实验设置的目标应该是让宿主细胞感染细胞内病原体，以便在显微镜分析时，初级感染细胞与邻近的未感染宿主细胞处于同一视野中。可以在优化过程中调整感染的复数和宿主细胞的汇合度来实现这一点。
5.从宿主细胞中吸出培养基并用 200 μL PBS +/+洗涤。按照先前为感兴趣的病原体建立的方法应用细菌接种物。建议体积为 200 μL。对于上皮细胞的鼠伤寒沙门氏菌感染，将受感染的宿主细胞在 CO 2培养箱中于 37°C 孵育 10 分钟。
6.在预先为病原体建立的适当时间后，从宿主细胞中吸出细菌接种物并用 PBS +/+洗涤 3 次。应用适合感兴趣的宿主细胞类型的生长培养基并在CO 2培养箱中培养。
注意：将本实验中使用的所有培养基预热至 37°C。此步骤对于完成细菌摄取非常重要，从而使含有病原体的液泡完成从宿主质膜的裂变。过早进行步骤 A7 可能会导致细菌被杀死，从而导致很少或没有受感染的宿主细胞。
7.在病原体的适当时间点，将培养基更换为补充有抗生素的生长培养基，以选择细胞内细菌。对于上皮细胞的鼠伤寒沙门氏菌 SL1344 感染，在感染后 30 分钟 (pi) 将培养基更换为补充有 10% FBS 和 100 μg/mL 庆大霉素的 DMEM [19]。在 2 小时 pi 时，将介质更改为补充有 10% FBS 和 10 μg/mL 庆大霉素的 DMEM，以进行维护。
注意：选择细胞内细菌对于确保感兴趣的表型不是由细胞外细菌产生的因素引起的至关重要。根据先前关于抗生素内化到宿主细胞中的知识来选择感兴趣的抗生素。例如，庆大霉素之所以常用，是因为它对多种宿主细胞的渗透有限，可以选择细胞内细菌[27]。感兴趣的病原体菌株的敏感性特征，以及先前建立的宿主细胞处理可接受的抗生素浓度范围，将影响浓度的选择。关于病原体敏感性，该信息先前已在许多细胞内病原体的文献中建立。如果目标病原体未知，则可以进行最低抑制浓度测定。
8.在发生抑制宿主向溶酶体运输的感染时间点，将培养基更改为步骤 A7 结束时使用的培养基，并补充有 DQ-Red BSA。对于HeLa 细胞的鼠伤寒沙门氏菌感染，使用补充有 10% FBS、10 μg/mL 庆大霉素和 0.25 mg/mL DQ-Red BSA 的 DMEM 在感染后 8 小时执行此步骤 [19]。
注意：与表型相关的感染时间点通常根据病原体的先前文献来确定。如果在这种情况下对病原体了解甚少，可以研究一系列时间点来确定这一点。用于处理的 DQ-Red BSA 浓度将根据所使用的细胞系及其吸收染料的能力而变化。例如，对于吞噬性 RAW 264.7 细胞，可以使用 10 μg/mL 的浓度 [19]。这通常是先前在文献中建立的，但如果需要，可以通过实验进行优化。
9.2培养箱中孵育1小时。这种使用添加染料的培养基的处理称为脉冲步骤。
注意：如果 1 小时被证明对感兴趣的细胞类型无效，则可以调整脉冲周期。
10.+/+清洗受感染的宿主细胞，并将培养基更换为步骤 A7 结束时使用的培养基。在CO 2培养箱中孵育4小时。这种在没有染料的情况下孵育以允许运输到溶酶体的过程称为追逐步骤。
注意：此追踪期将允许 DQ-Red BSA 运输至溶酶体进行检测。与此步骤相关的时间段可能因细胞系而异。如果目标病原体能够阻止向溶酶体的运输，则 DQ-Red BSA 的运输水平应降低。
11.+/+清洗受感染的宿主细胞，并将培养基更换为 HEPES 缓冲的 RPMI 1640 或具有 HEPES 缓冲液的等效培养基，辅以 10% FBS 和用于细胞内选择的抗生素（针对鼠伤寒沙门氏菌为 10 μg/mL庆大霉素）。受感染的样本已准备好通过荧光显微镜进行实时成像。
注意：HEPES 缓冲介质用于在常规显微镜上进行活细胞成像。如果感兴趣的显微镜配备有CO 2注入系统，则可以使用含有碳酸氢钠的培养基。

B.荧光显微镜成像和图像量化

1.×或 63 ×物镜的荧光显微镜上，检查每个室中与表达的荧光蛋白相关的通道中是否有原代感染细胞。对于表达 pFPV25.1 的鼠伤寒沙门氏菌 SL1344，请使用绿色通道。对于每个识别出的感染宿主细胞，检查相邻未感染细胞的视野。对每个视野进行成像，捕获通道以对细菌表达的荧光蛋白和 DQ-Red BSA 进行成像（图 3）。还可以在差分干扰对比 (DIC) 通道中捕获宿主细胞，以帮助识别细胞边界。

图 3. DQ-Red BSA 测定：沙门氏菌感染的上皮细胞。 HeLa 细胞用携带 GFP 表达质粒pFPV25.1 （绿色）的野生型肠沙门氏菌血清型鼠伤寒 SL1344 感染8 小时。使用 DQ-Red BSA（红色）对细胞进行脉冲追踪，然后进行实时成像。比例尺代表 10 μm。

2.按照步骤 B1 中的描述继续成像。对于每种感兴趣的菌株，理想情况是捕获至少 100 个受感染细胞以及相邻的未受感染细胞的图像。
注意：如果显微镜配备了能够自动成像的平台，请捕获满足上述标准所需的尽可能多的视野。
3.可以使用常用软件 Fiji (ImageJ) 进行分析。在软件中打开感兴趣的成像文件（图4A）。
注意：可以使用其他显微镜分析软件（例如 Volocity）进行等效分析。
4.对于每个原代感染细胞，评估 DQ-Red BSA 通道中每个区域的荧光强度：
a.打开感兴趣的图像。为了协助评估，请使用“复合”设置以允许所有通道可视化为叠加。
b.打开通道工具（图像  颜色  通道工具）以允许打开和关闭各个通道。
c.要选择要执行的测量，请转至分析  设置测量值。选择面积和平均值。
d.选择“分析”打开ROI Manager  工具  投资回报率经理。
e.由于将测量 DQ-Red BSA 通道，因此使用图像底部的滑块选择相应的通道。
f.选择徒手工具（图 4B）。

图 4. DQ-Red BSA 测定的斐济分析：沙门氏菌感染的上皮细胞。 (A) 细胞成像应使每个视野包含感兴趣的受感染细胞和邻近的未感染细胞。复合模式下的可视化允许同时查看细菌（绿色）和 DQ-Red BSA（红色）通道。 (B) DQ-Red BSA 定量在斐济进行。在使用 ROI Manager 进行测量之前，徒手工具用于将感染和未感染的细胞勾画为感兴趣区域 (ROI) 。

g.绘制与受感染宿主细胞的细胞边界相对应的感兴趣区域。
h.添加来添加新选择的 ROI 。
i.绘制与相邻未感染宿主细胞的细胞边界相对应的感兴趣区域。
j.添加来添加新选择的 ROI 。
k.要进行测量，请在 ROI Manager 中选择“测量” 。将出现一个结果窗口，其中包含两个 ROI 的相应测量值。可以将这些值复制并粘贴到 Excel 中以供后续分析。
l.对所有感兴趣的图像重复步骤 B4g–k。
注意：如果宿主细胞类型表现出特征上小于和/或大于正常细胞的异常细胞，则可以预先确定大小阈值范围，以便从分析中排除异常细胞。另外，如果需要，可以进行背景校正。

数据分析

1.对于每个原代感染细胞及其邻近的未感染宿主细胞对应物，通过将 ROI 测量的总强度（平均值）除以 ROI 面积，单独计算 DQ-Red BSA 通道的相关强度/μm 2 (区域）。
2.对于每个原代感染细胞及其邻近的未感染宿主细胞对应物，计算感染细胞的强度/μm 2作为未感染比较的百分比。这可以通过将受感染细胞的强度/μm 2除以未受感染细胞的强度/μm 2并乘以系数 100 来实现。
3.对每个主要感染细胞和邻近的未感染细胞组重复步骤1 和 2。总共 100 个数据点是理想的。
4.对于每个感兴趣的应变或条件，计算 100 个数据点的平均值。对于野生型与同基因敲除菌株和互补菌株的比较研究，可以通过条形图比较平均 DQ-Red BSA 信号强度/μm 2 ，以对照（未感染细胞）的百分比表示。

注意：如果数据表明与新病原体存在统计显着差异，或者涉及毒力因子，则需要进行补充分析以排除染料内化缺陷的可能性。这可以作为单独的独立测定进行，也可以使用辅助染料（例如，葡聚糖 Alexa Fluor 647）与 DQ-Red BSA 结合进行[19]。此外，考虑验证未感染细胞中 DQ-Red BSA 染料的摄取与未感染细胞中的 DQ-Red BSA 染料摄取相同也很有价值。为了评估这一点，可以对未感染条件进行比较以进行后续分析。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：
•德科斯塔等人。 [19]。沙门氏菌通过 SopD2 介导的 Rab7 抑制扰乱宿主内吞运输。细胞报告（图 1，A-D 组；图 3，C-D 组；图 5，B 组；补充图 1，A-C 组；补充图 2）。

一般注意事项和故障排除

故障排除

问题一：感染效率差。
可能的原因：宿主细胞条件欠佳。
解决方案：宿主细胞汇合会影响细菌的摄取。如果怀疑这一点，可以通过以多种宿主细胞密度接种来进行汇合评估。

问题二：感染效率差。
可能的原因：细菌接种量不理想。
解决方案：可以对接种物进行菌落形成单位分析，以确认细菌生长条件产生了活细菌。如果适用，也可能是诱导摄取的毒力因子产生不理想。由于沙门氏菌等病原体的毒力因子产生可能依赖于生长阶段，因此可以进行生长曲线分析来评估这一点。

问题3：没有细胞内细菌。
可能原因：细胞内保护条件无效。
解决方案：如果在病原体完全吸收到含有病原体的完整液泡中之前进行细胞内保护，那么细菌就可以接触到抗生素，从而导致细菌死亡。如果需要，可以延长抗生素治疗前的时间。

问题4：观察到细胞外细菌。
可能原因：细胞内保护条件无效。
解决方案：对目标菌株进行最低抑菌浓度测定，以确认其对目标抗生素的敏感性。这可能表明可能需要稍微调整测定中使用的药物浓度。如果菌株对首选抗生素（例如庆大霉素）具有耐药性，则可以考虑使用替代药物（例如多粘菌素）。

问题5：DQ-Red BSA 信号太低。
可能的原因：显微镜系统灵敏度低。
解决办法：增加光源强度或曝光时间。

问题6：DQ-Red BSA 信号太低。
可能的原因：上染率不理想。
解决方案：脉冲处理条件可能需要优化，具体取决于宿主细胞系的内在吸收特性。如果需要，请考虑增加染料浓度或吸收时间。

致谢

该协议改编自之前发表的一项研究[19]。我们感谢 D'Costa 实验室成员的有益讨论。这项工作由加拿大自然科学和工程研究委员会 (NSERC) (PJ4-175369 和 PJT-178191) 向 VMD 提供的运营拨款资助

利益争夺

作者没有需要声明的利益冲突或竞争利益。

道德考虑

不存在与本文相关的伦理考虑。

参考

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