材料与试剂

生物材料

1.4-6周龄C57BL/6J小鼠（Jackson Laboratories，品系号：000664）

试剂

1.移液器吸头：1,000 µL、20–200 µL、1–10 µL（Thermo Fisher Scientific，目录号分别：P1126、P1179 和 P1060）
2.不含酚红的基质胶（Fisher Scientific，目录号：CB-40234C）
3.Gibco DMEM/F-12（Thermo Fisher Scientific，目录号：11320033）
4.青霉素-链霉素（Thermo Fisher Scientific，目录号：15140122）
5.L-谷氨酰胺溶液（Sigma-Aldrich，目录号：G7513-100ML）
6.胎牛血清（FBS），热灭活（Corning，目录号：35-011-CV）
7.GlutaMAX 补充剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：35050079）
8.HEPES缓冲溶液（Sigma-Aldrich，目录号：83264-100ML-F）
9.N-2 补充剂（100 × ）（Thermo Fisher Scientific，目录号：17502048）
10.B27 补充剂（50 × ），无血清（Thermo Fisher Scientific，目录号：17504044）
11.表皮生长因子（EGF）（Sigma-Aldrich，目录号：E1257-0.1MG）
12.ROCK抑制剂（Sigma-Aldrich，目录号：688001-500UG）
13.1 ×磷酸盐缓冲盐水（PBS）（不含钙和镁）（Fisher Scientific，目录号：MT21040CM）
14.多聚甲醛 16%（Thermo Fisher Scientific，目录号：043368-9M）
15.FocusClear 解决方案（CelExplorer，目录号：FC-101）
16.Triton X-100 解决方案（Fisher Scientific，目录号：P185111）
17.Tween 20 溶液（Fisher Scientific，目录号：P185113）
18.叠氮化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2002-5G）
19.Vector Laboratories 山羊血清（Cole-Parmer，目录号：S-1000）
20.具有 DNA 蓝色荧光染色剂 DAPI 的 ProLong Gold 抗淬灭封固剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：P36931）
21.Ted Pella Inc 透明指甲油（Fisher Scientific，目录号：NC 1849418）

解决方案

1.Minigut 培养基（参见食谱）
2.4% 多聚甲醛溶液（参见配方）
3.免疫荧光 (IF) 缓冲液（参见配方）
4.透化溶液（参见配方）
5.封闭缓冲液（参见配方）
6.稀释缓冲液（参见配方）

食谱

1.小肠培养基
条件培养基（1 体积的 L 细胞培养基和 1 体积的 DMEM F12，含有 1:100 vol/vol青霉素-链霉素、1:100 vol/vol 谷氨酰胺和 20% vol/vol FBS）[2]
GlutaMAX 1:100 体积/体积
10 mM HEPES 缓冲液
青霉素-链霉素 1:100 vol/vol
N-2 补充剂 1:100 体积/体积
B27 补充剂 1:50 体积/体积
EGF 50 ng/mL（最终浓度）
ROCK 抑制剂 10 µM（最终浓度）

2.4%多聚甲醛溶液
1:4 体积/体积 16% 多聚甲醛和 1 × PBS

3.免疫荧光 (IF) 缓冲液
Triton X-100 0.2%（体积/体积）、Tween 20 0.05%（体积/体积）、1 × PBS 99.75%（体积/体积）

4.透化液
Triton X-100 2%（体积/体积）和 1 × PBS 98%（体积/体积）

5.封闭缓冲液
山羊血清 10% (vol/vol)、Triton X-100 2% (vol/vol)、叠氮化钠 0.02% (wt/vol)、1 × PBS 88% (vol/vol)

6.稀释缓冲液
Triton X-100 0.25% (vol/vol)、山羊血清 1% (vol/vol)、叠氮化钠 0.02% (wt/vol)、1 × PBS 98.75% (vol/vol)

设备

1.Costar 24 孔透明 TC 处理的多孔板，单独包装，无菌（Corning，目录号：3524）
2.Pipetman—PK1000、PK200、PK20（Gilson，目录号分别为：F144059M、F144058M 和 F144056M）
3.Lab-Tek 室载玻片 8 孔玻璃载玻片（Nunc，目录号：154941）
4.层流罩（LabGard II 类 A2 型生物安全柜）（Nuaire，型号：NU-540）
5.3110 CO 2水套细胞培养箱（Thermo Fischer Scientific，型号：4120）
6.数字水浴锅（VWR，目录号：89501-460）
7.Sorvall ST 16R 离心机（Fisher Scientific，目录号：75-004-240）
8.一体式荧光显微镜（Keyence BZ-X 系列，型号：BZ-X810）（图 1）
9.矩形冰盘（冰盘/桶）（Fisher Scientific，目录号：07-210-107）
10.微盖玻璃（VWR，目录号：48393252）

软件和数据集

1.BZ-X 分析仪 ( https://www.keyence.com/bz-x810 )

图1。基恩斯显微镜。 A. Keyence 显微镜，配有显示结肠免疫荧光染色的软件。 B. Keyance显微镜显示用于 8 孔 Lab-Tek 室载玻片的支架。

程序

1.正如 O'Rourke 等人所描述的。 [2]，使用5-6周龄的野生型小鼠来分离类结肠。简而言之，将小鼠的结肠切成小块并拉紧以除去组织。将滤液与 1 × PBS-EDTA一起剧烈摇动，并在基础显微镜下连续检查隐窝富集情况。观察到最佳隐窝后，将上清液在 10°C 下以 112× g (rcf) 离心。将沉淀与基质胶混合。在层流罩中将分离的结肠与基质胶 (10 μM) 混合。使用 PK200 移液混合悬浮液，不要产生气泡。
2.在层流罩中预热（37°C）24孔板的每个孔中添加50μL基质胶和结肠混合物（〜10个结肠/50μL基质胶），并将其保存在设置为37°C的细胞培养箱中在5% CO 2和90%湿度下聚合5分钟。
3.聚合后，使用层流罩中的 PK100 将每口井覆盖 1 mL 预热的 Minigut 介质。沿着井壁分配介质。
4.18-24 小时后和第 3 天，使用层流罩中的 PK1000，用 1 mL 预热的 Minigut 介质更换孔的介质。使用 PK1000 沿孔壁吸出培养基，而不干扰基质胶滴。
5.第 5 天，在层流罩中使用 PK1000 吸出介质，并使用预热的 1 × PBS（不含钙和镁）作为一次性洗涤以去除介质。
6.将 24 孔板放在层流罩的冰盘上，并使用 PK1000添加 1 mL 冰冷的 1 × PBS（不含钙和镁）。使用 PK200 重复移液，轻轻打破基质胶滴，避免起泡。
7.1 × PBS 收集在 50 mL 离心管中，并在 4 °C 下以 28 × g （rcf）离心 5 分钟。
8.使用 PK1000 尽快吸出溶解有基质胶的 1 × PBS，将离心管置于冰盘中的冰中。
9.将结肠颗粒重新悬浮在 400 μL 基质胶中，并通过用 200 μL Pipetman 移液将其混合。将 50 µL 悬浮液添加到预热的 8 孔Lab-Tek 室载玻片中，并将其直接（不要倒置）放入细胞培养箱中 5 分钟。聚合后，将 500 µL 预热的 Minigut 培养基添加到 Lab-Tek 室玻片的每个孔中，并将其放入细胞培养箱中（图 2）。

图 2. 8 孔 Lab Tek 室载玻片。 A. 50 μ L基质胶滴与结肠悬浮液。 B. 在细胞培养箱中用小肠培养基覆盖聚合基质胶滴和菌落。

10.使用层流罩中的 PK1000 将第 1 天和第 3 天的孔介质更换为 1 mL 预热的 Minigut 介质。使用 1 mL Pipetman 沿孔壁吸出介质，不要干扰基质胶滴。
11.第 4 天或第 5 天，类集会出现分支（图 3），这是开始免疫荧光染色的最佳状态。从细胞培养箱中取出 Lab-Tek 室载玻片。使用 PK1000 沿孔壁吸出培养基，而不干扰基质胶滴。使用 PK1000 用500 µL 预热的 1 × PBS清洗每个孔（仅一次）。

图 3. 野生型小鼠培养物的第 2 天（无分支）、第 4 天（开始出现分支）、第 6 天（在多层结肠中分支不是很清楚）和第 8 天（在非常致密的结肠中不可见分支）在 8 孔 Lab-Tek 室板的基质胶上。放大倍数为20倍。

12.吸出 1 × PBS 后，使用 4% 多聚甲醛溶液在室温下固定结肠 2 小时。
13.使用 PK1000用 500 µL（每孔）预热的 1 × PBS清洗两次（每次清洗 5 分钟，不摇动）。
14.使用 PK1000 将 200 µL FocusClear 溶液添加到每个孔中，并在工作实验室工作台上在室温下孵育两晚。
15.使用 PK200 用 200 µL（每孔）的 IF 缓冲液清洗两次（每次清洗 5 分钟，不摇动）。
16.在每孔中加入 200 µL 透化溶液，在室温下孵育三个晚上。
17.使用 P200 吸出透化溶液，并在室温下用 IF 缓冲液（每孔 200 µL）洗涤 3 次，每次 5 分钟（每次洗涤），无需摇动。
18.加入 200 μL封闭缓冲液，室温孵育 4 小时。
19.使用 P200 吸出封闭缓冲液。
20.使用 P200 添加 150 µL（每孔）在稀释缓冲液中稀释的一抗，并在室温下孵育过夜。
21.使用 P200 吸出一抗，并在室温下用 IF 缓冲液（每孔 200 µL）洗涤 3 次，每次 5 分钟（每次洗涤），无需摇动。
22.添加 150 µL（每孔）与绿色荧光 (GFP) 等缀合的二抗（针对一抗，按照制造商的说明）。在稀释缓冲液中稀释二抗（按照制造商的说明），并在室温下黑暗中孵育两晚。
23.使用 P200 吸出二抗，并在室温下用 IF 缓冲液（每孔 200 µL）洗涤 3 次，每次 5 分钟（每次洗涤），无需摇动。
24.添加 150 µL（每孔）荧光复染抗体（例如，如果二抗与绿色荧光偶联，则应使用红色荧光偶联的鬼笔环肽，对肌动蛋白丝进行染色），在稀释缓冲液中稀释，室温放置一晚。
25.使用 P200 吸出复染抗体，并在室温下用 IF 缓冲液（每孔 200 µL）洗涤 3 次，每次 5 分钟（每次洗涤），无需摇动。
26.将 100 µL 含有 DNA 蓝色荧光染色剂 DAPI 的即用型 ProLong Gold Antifade Mountant 添加到每个孔中，在室温下放置一晚。
27.根据制造商的说明，提供了一种工具，可将上室与 Lab-Tek 载玻片的硅胶垫圈分离并拆除。
28.用微型盖玻片盖住不带上室的 Lab-Tek 载玻片，并用白色指甲油密封。
29.室温避光保存。
30.封片并盖上盖玻片的载玻片应尽早用于拍摄图像（染色后 2-3 天内），并且只能在黑暗条件下在室温下保存 4-5 天。
31.从野生型小鼠中分离出的4 天大的类集被与绿色荧光缀合的抗 PCNA（增殖细胞核抗原，一种增殖标记物）染色。使用 TRITC 结合的鬼笔环肽和 DAPI（蓝色荧光）分别使用 40倍放大倍数对肌动蛋白丝进行红色荧光复染，对细胞核进行蓝色荧光复染。我们还使用 40倍放大倍数在明场中拍摄了图像。

图 4. 4 天龄野生型小鼠类器官的免疫荧光染色代表性结果，在 8 孔 Lab-Tek 室板中培养并固定在基质胶上，并用抗 PCNA（增殖标记物）进行探测。使用呈绿色荧光的 FITC 作为二抗。图像是放大 40 倍的 Z 截面。 DAPI 用于对细胞核进行蓝色荧光复染，红色荧光用于肌动蛋白-鬼笔环肽。类集的分支显示增殖细胞，如白色箭头所示。

数据分析

我们使用 Keyence 显微镜（BZ-X810 型号）和 BZ-X 系列软件在明场和绿色、红色和蓝色通道下捕获免疫荧光染色的结肠样图像。在软件的帮助下，可以创建所有三个通道的叠加图像，该图像将描述感兴趣的蛋白质的表达及其由于肌动蛋白和核复染而产生的位置。

协议验证

我们已经在 Walter 等人中证明了这一点。 [3] 4 天大的类集落被缀合有绿色荧光的抗 SEPP1 染色（图 5C-ii）。使用 TRITC 结合的鬼笔环肽和 DAPI，分别使用 40倍放大倍数对肌动蛋白丝进行红色荧光复染，对细胞核进行蓝色荧光复染。

一般注意事项和故障排除

1.该方案用于从小鼠结肠中新鲜分离的结肠样。然而，它应该适用于任何类集落培养物，只要它们在基质胶上生长并且健康且分支较少。请参见图 4，第 4 天和第 6 天克隆体分支的差异。
2.预热的 8 孔 Lab-Tek 室载玻片中的50 µL 类结肠和基质胶悬浮液不应在细胞中孵育超过 5 分钟。这是基质胶聚合以及避免类集落营养匮乏的最佳持续时间。
3.在破坏含有基质胶的克隆体时，温度应保持冰冷。此外，应尽可能避免因重复移液而产生泡沫和鼓泡。
4.整个过程大约需要八天才能完成。因此，在手术过程中丢失含有聚合基质胶的克隆体的可能性较高。因此，一张载玻片（即所有 8 个孔）应用于一种条件。这意味着，如果我们将野生型小鼠与转基因小鼠进行比较，则一张载玻片应接种野生型小鼠类结肠，另一张载玻片应接种转基因小鼠类结肠。这将为数据分析提供足够数量的“ns”。
5.应尽快处理封片和盖玻片以进行数据分析。由于基质胶的原因，载玻片无法在 4°C 下保存，并且荧光强度在室温下缓慢消失。
6.多聚甲醛的处理应在通风橱中进行，同时佩戴个人防护装备和护目镜。

故障排除

1.基质胶在 37 °C 时聚合，在 4 °C 时变成液体。因此，在传代集落时，维持冰冷条件很重要；在染色过程中，应在室温下使用预热的溶液。
2.将菌落接种到8 孔Lab-Tek 室载玻片上后，应每天观察。类集的分支最早可以在第 3 天开始，最晚可以在第 5 天或第 6 天开始，具体取决于小鼠品系或是否是转基因小鼠。出于数据分析目的，应避免使用具有多个分支的多层菌落，因为它不会产生清晰的图片。
3.如果一抗染色不可见，则考虑减少其稀释度。

致谢

该协议改编自 Walter 等人。 [3]。

利益争夺

作者声明本作品不存在利益冲突。

道德考虑

佐治亚州立大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 和机构生物安全委员会 (IBC) 已批准协议中描述的实验。

参考

1.Wilson, SS、Mayo, M.、Melim, T.、Knight, H.、Patnaude, L.、Wu, X.、Phillips, L.、Westmoreland, S.、Dunstan, R.、Fiebiger, E. 等等人。（2021）。优化培养条件以改善小鼠和人类结肠类器官的生长和功能分化。正面。免疫学。 11：e547102。 https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.547102
2.O'Rourke, K.、Ackerman, S.、Dow, L. 和 Lowe, S. (2016)。小鼠肠干细胞的分离、培养和维持。生物协议6(4)：e1733。 https://doi.org/10.21769/bioprotoc.1733
3. Walter, L.、Canup, B.、Pujada, A.、Bui, TA、Arbasi, B.、Laroui, H.、Merlin, D. 和 Garg, P. (2020)。基质金属蛋白酶 9 (MMP9) 限制结肠炎相关癌症中活性氧 (ROS) 的积累和 DNA 损伤。细胞死亡疾病。 11（9）：767。 https://doi.org/10.1038/s41419-020-02959-z