材料与试剂

1.聚碳酸酯Transwell ® （组织培养处理，直径为 1.13 cm 2或 12 mm 的渗透性支持物），12 孔板（Costar，目录号：3401）
2.离心管，15 mL（VWR，目录号：89039-670）
3.离心管，50 mL（VWR，目录号：89079-494）
4.N-（2-羟乙基）-哌嗪-N'-（2-乙磺酸）半钠盐（HEPES）溶液（ Sigma-Aldrich ，目录号：H0887）
5.Dulbecco 改良的 Eagle 培养基/营养混合物 Ham 的 F-12 培养基（DME/F-12）（ Sigma-Aldrich ，目录号：6421），包括 15 mM HEPES 和碳酸氢钠，不含 L-谷氨酰胺
6.胎牛血清（ HyClone ，目录号：SH30071.03）
7.牛血清白蛋白（杰克逊免疫研究实验室，目录号：001-000-162）
8.L-谷氨酰胺（ Sigma-Aldrich ，目录号：G7513）
9.非必需氨基酸溶液（ Sigma-Aldrich ，目录号：M7145）
10.青霉素-链霉素（ Sigma-Aldrich ，目录号：P4333）
11.Primocin （VWR，目录号：MSPP-ANTPM1）
12.二甲亚砜（DMSO）（ Sigma-Aldrich ，目录号：D8418）
13.显微镜盖玻片，22 mm × 22 mm，1 号。（Denville Scientific Inc.，目录号：M1100-01）
14.DAPRed （ Dojindo Molecular Technologies ，目录号：D677-10）
15.氯喹二磷酸盐（ Sigma-Aldrich ，目录号：C6628）
16.雷帕霉素（Selleck Chemical，目录号：s1039）
17.Dylight 488 结合的番茄凝集素（Vector Laboratories，目录号：DL-1174-1）
18.Hoechst 33342（Sigma-Aldrich，目录号：H6024）
19.人肺腺癌细胞系A549（ATCC，目录号：CCL-185）

解决方案

1.A549 细胞培养基 (MDS)（参见食谱）
2.Krebs-Ringer 溶液（参见配方）

食谱

1.A549细胞培养基（MDS）
DME/F-12 培养基补充有 10% 胎牛血清、1 mM 非必需氨基酸溶液、100 U/mL伯莫霉素、10 mM HEPES、1.25 mg/mL牛血清白蛋白、 2 mM L-谷氨酰胺和 1 U青霉素-链霉素。

2.克雷布斯-林格溶液
136 mM NaCl、4.7 mM KCl 、1 mM NaH 2 PO 4 、1 mM CaCl 2 、1 mM MgSO 4 、20 mM HEPES、1 mM D-葡萄糖。将 pH 值调整至 7.4。

设备

1.Forma TM系列 II 水套 CO 2培养箱（ Thermo Scientific，型号：3110）
2.离心机（Eppendorf，型号：5424）
3.共焦显微镜（ Leica Microsystems，型号： Leica STELLARIS 8 ）
4.温控室：Ludin 室类型 1（Life Imaging Services，瑞士）

软件和数据集

1.Leica LAS 3D 处理和量化套件（Leica Microsystems）
2.ImageJ（美国国立卫生研究院）
3.微软Excel

程序

1.将 A549 细胞以 100,000 个细胞/1.13 cm 2接种到Transwell过滤器上并培养直至达到 80% 汇合（通常直至培养第 4 天）。
注意：细胞培养参数，包括培养基质、铺板密度、汇合水平和达到所需汇合的时间应根据不同的细胞/组织类型单独调整。
2.新鲜制备氯喹[水溶性；媒介物：培养液（MDS）（参见食谱）]，一种自噬体与溶酶体融合的抑制剂（储备液：40 mM），并添加到培养液中，在顶端和基底外侧均达到40 μM终浓度，培养 1 小时成像；对照应单独接受培养液。
注意：活细胞成像是在使用和不使用氯喹的情况下对不同组的细胞进行的。
3.添加DAPRed [0.1 μM ；脂溶性；载体：0.1% (v/v) DMSO] (1 μL )到顶端室的培养液中，在成像前 30 分钟。
4.要标记细胞质膜，请除去培养液并应用Dylight 488 缀合的番茄凝集素（5 μg /mL： 5 在成像前将1 mg/mL 库存中的µL直接涂到细胞的顶端表面。
注意：虽然Dylight 488 被证明可以抵抗我们手中的光漂白，但建议避免不必要的光照。
5.使用手术刀沿着边缘小心地切出Transwell过滤器，其上生长有感兴趣的细胞单层。将单层Transwell过滤器安装在盖玻片上，并将 Krebs-Ringer 溶液 (~1–2 mL) 作为沐浴溶液添加到盖玻片室中。
6.活细胞成像：
a.SP8 共焦显微镜系统以 63倍放大倍率、12 位和 1,024 × 1,024 分辨率执行共焦成像。
b.在xyz系列中，在单个活 A549 细胞的整个体积上逐层测量细胞内荧光强度（ DAPRed ：561/570–600 nm， Dylight 488 缀合番茄凝集素：488/490–530 nm）。
目标是充分放大以达到约 150-200 nm/像素的水平，这是当前共焦显微镜方法的分辨率极限，并包含尽可能多的细胞。
c.Dylight 488 缀合番茄凝集素的信号，设置xyz系列的上限。对于典型的 A549 电池，x、y 和 z 维度分别为 60 × 60 × 20 μm 。
d.xyz系列的下限（即荧光信号丢失的位置），并将切片间隔设置在 0.35 和 0.5 μm之间。这似乎是在活 A549 细胞中产生自噬体详细 3D 图像质量的最实用的间隔，同时避免更积极的激光扫描引起的光毒性和光漂白。

数据分析

1.以逐堆栈模式测量单个活 A549 细胞中的DAPRed荧光强度，并在细胞的整个体积上进行积分。
a.在 ImageJ 中打开图像文件。
b.独立荧光通道（ DAPRed和Dylight 488 缀合番茄凝集素）（ImageJ：图像/颜色/分割通道）。
c.使用质膜标记Dylight 488 缀合的番茄凝集素来描绘需要测量DAPRed荧光的细胞质区域。
让两个荧光通道在两个单独的窗口中彼此相邻打开（参见上面的步骤 1b）。
同步窗口（ImageJ：分析/工具/同步窗口）。
单击DAPRed通道并描绘要测量的细胞的边界 [创建 ROI（感兴趣区域）]，该边界由质膜标记的同步光标引导。
d.测量黄色突出显示区域的 ROI 中的DAPRed荧光（图 1），并将测量的DAPRed荧光强度导出到 Microsoft Excel 以进行后续计算。
e.自噬通量的计算：

(1) Ø对照= F对照（含氯喹） - F对照（不含氯喹）
(2) Ø暴露量= ( F暴露量（有氯喹） - F暴露量（无氯喹） ) - Ø对照
Ø：自噬通量
F: DAPRed荧光强度

图 1. 显示质膜引导 ROI 选择的代表性图像。质膜标记（例如， Dylight 488 缀合的番茄凝集素，左图）可以帮助精确描绘单个细胞（例如，A549 细胞）的胞质边界。绘制质膜引导的 ROI（黄色突出显示区域），并在DAPRed通道（右图）中进行测量。

代表性数据

我们最近发表了一篇文章，使用这种方法评估暴露于纳米颗粒的 A549 细胞中的自噬动力学 [17]。我们还成功地将这种方法应用于大鼠肺泡上皮细胞单层的自噬流检测。与制造商合作提供了DAPRed的深入表征，包括对其光漂白的评估[16]。此外，我们在这里提供了一个代表性数据集，其中使用自噬诱导剂雷帕霉素来刺激自噬（图 2）和显示典型DAPRed标记的视频（视频 1）。

图 2. 使用DAPRed在单个活 A549 细胞中测量自噬通量。 A.代表性图像显示，暴露于 50 nM雷帕霉素后，A549 细胞中自噬标记DAPRed （红色）的时间依赖性激活。雷帕霉素通过抑制哺乳动物靶标雷帕霉素复合物 1 (mTORC1)的活性来激活自噬。曝光时间如上图所示。在仅代表细胞的一个横截面的单个焦平面处捕获图像。为了进行定量（参见图B ）， DAPRed荧光由覆盖单个细胞整个体积的多个焦平面组合而成。质膜用Dylight 405 结合的番茄凝集素标记，以区分细胞外空间和细胞内空间以及相邻细胞产生的荧光信号（见图 1）。比例尺，25 µm。 B.雷帕霉素诱导 (50 nM ) 自噬通量。使用数据分析中描述的公式对通过DAPRed方法测量的自噬通量进行量化。每个时间点代表一组不同的 A549 细胞。每种条件下的细胞均进行短时间（< 30 分钟）成像。 n = 7–8。

视频 1。代表性视频显示单个活 A549 细胞中自噬体的 3D 渲染（参见视频 1）。 A549 细胞在顶端培养基中暴露于 50 nM雷帕霉素 24 小时。在成像前，用顶端培养液中的40 μM氯喹处理细胞1 小时。自噬体用DAPRed标记（0.1 μM ，37 °C ，5% CO 2 30 分钟），而细胞核用Hoechst 33342 标记（50 μg /mL，37 °C ，5% CO 2 30 分钟）。质膜用Dylight 488 结合的番茄凝集素标记（5 μg /mL，标记是瞬时的，无需孵育）。自噬体分布在整个细胞质中，在核周胞质区域周围明显富集。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：
Sipos, A.、Kim, KJ、 Sioutas , C. 和 Crandall, ED (2023)。纳米颗粒暴露的肺腺癌细胞 (A549) 细胞自噬活性的动力学。自噬代表2(1)：e2186568。
本研究文章中的数据（图 1 - 6）是使用当前生物协议论文中描述的方法生成的。

一般注意事项和故障排除

1.DAPRed信号过饱和的方式调整检测器灵敏度。为此，在最大自噬活动下（例如，在我们的例子中，雷帕霉素刺激 3-4 小时），将检测器增益设置为不存在过饱和像素的水平。如果需要，将信号检测从 8 位增加到 12 位。
2.1,024 × 1,024 分辨率最适合单细胞分析。较低的分辨率虽然可以实现更快的扫描且光毒性较小，但无法提供所需的空间分辨率。通过选择高于 1,024 × 1,024 的分辨率，可以获得更详细的空间信息。然而，在我们的实验中，将分辨率提高到超过1,024 × 1,024 是不切实际的，因为它还会增加像素停留时间，使细胞和细胞内细胞器容易产生光毒性。
3.DAPRed在优化的中等（激光强度 < 10% 功率）成像条件下显示出极小的光漂白甚至没有光漂白 [16] 。
4.当使用（通常较旧的）共焦和荧光显微镜时，光漂白可能是伪影的潜在来源。然而，探测器系统的最新发展，尤其是我们在这项工作中使用的徕卡混合探测器，由于其灵敏度的提高和扫描速度的提高，光漂白大大减少。在我们的设置中，使用 561 nm 激光器，全功率为 2.5%。此外，像素停留时间为 0.6 µs，而特定区域的成像时间 < 5-8 分钟。最后，以连续方式进行成像，这意味着首先收集DAPRed信号的定量成像，然后收集质膜标记Dylight 488 结合的番茄凝集素的定性成像。
5.在整个实验过程中，激光功率保持恒定（488 nm：2%，561 nm：2.5% 全功率），以便能够比较不同的数据集。

致谢

这项工作得到了威尔·罗杰斯电影先锋基金会、惠蒂尔基金会和黑斯廷斯基金会的部分支持。 EDC 是凯克医学院的黑斯廷斯教授。该协议基于 Sipos 等人。 [17]。

利益争夺

作者声明不存在利益冲突。

参考

1.小林，S.（2015）。精心选择并充分重用：新揭示的自噬过程。生物制药公报38(8)：1098–1103。
2.Parzych, KR 和Klionsky , DJ (2014)。自噬概述：形态学、机制和调控。抗氧化剂氧化还原信号20(3)：460–473。
3.阿什福德，TP 和波特，KR (1962)。肝细胞溶酶体中的细胞质成分。 J 细胞生物学。 12（1）：198-202。
4.水岛，N. 和小松，M. (2011)。自噬：细胞和组织的更新。单元格147(4)：728–741。
5.Ryter, SW、Cloonan, SM 和 Choi, AM (2013)。自噬：细胞代谢和稳态的关键调节剂。分子和细胞36(1)：7-16。
6.Cecconi, F. 和 Levine, B. (2008)。自噬在哺乳动物发育中的作用：细胞改造而不是细胞死亡。开发。单元格15(3)：344–357。
7.Yeganeh, B.、Lee, J.、 Ermini , L.、Lok, I.、Ackerley, C. 和 Post, M. (2019)。自噬是肺发育和形态发生所必需的。 J.克林。投资。 129（7）：2904-2919。
8.Deretic , V.、 Saitoh , T. 和 Akira, S. (2013)。感染、炎症和免疫中的自噬。纳特。免疫学牧师。 13（10）：722-737。
9.Martínez-García, GG 和 Mariño, G. (2020)。自噬在环境污染物暴露中的作用。程序。摩尔。生物。译。科学。 172：257-291。
10.Aman, Y.、 Schmauck -Medina, T.、Hansen, M.、Morimoto, RI、Simon, AK、 Bjedov , I.、 Palikaras , K.、Simonsen, A.、Johansen, T.、 Tavernarakis , N.,等人。（2021）。健康衰老和疾病中的自噬。纳特。老化1(8)：634–650。
11.Codogno, P. 和 Meijer, AJ (2005)。自噬和信号传导：它们在细胞存活和细胞死亡中的作用。细胞死亡差异12：1509–1518。
12.丹顿，D. 和库马尔，S. (2018)。自噬依赖性细胞死亡。细胞死亡差异26(4)：605–616。
13.Doherty, J. 和Baehreke , EH (2018)。生、死和自噬。纳特。细胞生物学。 20（10）：1110-1117。
14.Green, DR 和 Levine, B. (2014)。生存还是毁灭？选择性自噬和细胞死亡如何控制细胞命运。单元157(1)：65–75。
15.Klionsky DJ、阿卜杜勒-阿齐兹 AK、阿卜杜勒法塔赫 S.、阿卜杜勒拉提夫 M.、阿卜杜利 A.、阿贝尔 S.、阿贝洛维奇H.、阿比尔加德 MH、阿布杜 YP、阿塞韦多-阿罗泽纳 A.、等人。（2021）。自噬监测检测方法的使用和解释指南（第四版）。自噬17(1)：1-382。
16.樱井HT、岩下H.、荒川S.、伊克拉姆A.、草场M.、小藤S.、仁科H.、石山M.、上野Y.、清水S.等等人。（2023）。开发用于分析自噬动力学的小荧光探针。 i科学26(7): 107218。
17.Sipos, A.、Kim, KJ、 Sioutas , C. 和 Crandall, ED (2023)。纳米颗粒暴露的肺腺癌细胞 (A549) 细胞自噬活性的动力学。自噬代表2(1)：e2186568。
18.方华、耿胜、郝明、陈强、刘明、刘成、田志、王成、武部泰、关建林等等人。（2021）。使用活细胞中超分辨率形态相关细胞器识别同时跟踪多个细胞器。纳特。交流。 12(1)， doi ：10.1038/S41467-020-20309-7 。
19.孙红、王瑞、刘Y.、梅红、刘X.和彭Z. (2021)。 USP11 通过稳定 VCP 激活自噬，诱导结直肠癌对 5-氟尿嘧啶的耐药性。 J.癌症12（8）：2317-2325。
20.王B.、张J.、卢Y.、彭L.、袁W.、赵Y.和张L. (2021)。柴芪汤通过下调 ApoE 模型小鼠的炎症反应减轻血管内皮损伤。证据确凿。基础补语。替代。医学。 2021 年：1-10。
21. Oh, C. k.、 Dolatabadi , N.、 Cieplak , P.、Diaz-Meco, MT、Moscat, J.、Nolan, JP、Nakamura, T. 和 Lipton, SA (2022)。 p62 的 S-亚硝基化抑制自噬流，促进帕金森病和路易体痴呆中 α-突触核蛋白的分泌和传播。 J.神经科学。 42（14）：3011-3024。