材料与试剂

生物材料

1.以前通过 iDISCO 和可能的其他疏水性清除方法清除的浑浊组织

试剂

1.甲醇（ Sigma-Aldrich，目录号：179 337 ）
2.二氯甲烷（ Sigma-Aldrich，目录号： 270997 ）
3.二苄醚（Sigma-Aldrich，目录号： 33630）

解决方案

1.二氯甲烷和甲醇混合物（参见配方）

食谱

1.二氯甲烷和甲醇混合物（每个样品）
试剂最终浓度（vol%）体积
二氯甲烷66%3.3毫升
甲醇34%1.7毫升
全部的不适用5.0毫升
该混合物应新鲜配制，并在使用前保存在室温下。

实验室用品

1.器官夹持钳（例如，Fine Science Tools，目录号：11031-15）
2.螺旋盖玻璃瓶（例如，Millipore Sigma，目录号：27151）
3.丁腈手套（任何品牌）
4.Kimwipes 和纸巾（任何品牌）

设备

1.通风柜（例如 Hamilton Lab，型号：SafeAire II）
2.轨道摇床（例如，Stovall Life Science，Belly Dancer，型号：BDRAA115S）
3.光片显微镜（例如，Miltenyi Biotec，型号：UltraMicroscope II Blaze）
4.计算机工作站至少配备 Intel Xeon CPU、128 G RAM、具有 16 GB 内存的 GPU、2 TB存储和 USB3.0 端口。

软件和数据集

1.建议使用基于云的实验室管理软件（例如Labguru.com）来跟踪和记录救援过程
2.显微镜系统控制和图像采集软件（例如 ImSpector 7.5.3，免费）
3.图像处理软件（例如ImageJ1.53，免费）
4.图谱匹配和免疫荧光定量软件（例如 NeuroInfo，由 MBF Bioscience 许可）

程序

A.脱水

注：关于废物处理和避光，请参见注2和注3。
1.将浑浊的组织样本（图 1）转移至装有 100% 甲醇的 5 mL 螺旋盖玻璃瓶中并密封。

图1 。在救援过程中，有两个先前已清除但模糊的大脑样本。大脑半球 (IDT3WT) 和全脑 (S3) 先前已被 iDISCO 清除，但在数月的存储过程中变得模糊。 A)和B)中的样品脱水后变得完全不透明； C) 它们在脱脂后保持完全不透明，透明度恢复为浅黄色色调，D) 在折射率 (RI) 匹配后。

2.将小瓶放在轨道摇床（例如 Belly Dancer）上，并在室温下以 70 rpm 摇晃 1 小时。
3.丢弃甲醇并重复步骤 A1 和 A2 三次以上。

B.脱脂

1.将组织样本（图 1B）转移到装有 66% 二氯甲烷 + 34% 甲醇的 5 mL 螺口玻璃瓶中，并紧紧密封。
注意：处理二氯甲烷时，请戴双层丁腈手套并在通风罩中工作。用纸巾擦拭小瓶的外部。
2.将小瓶放在轨道摇床上，在室温下以 70 rpm 的速度摇动 48 小时。
3.将组织样本转移至装有 100% 二氯甲烷的 5 mL 螺口玻璃瓶中并密封。注意：人们可以始终将样品保留在同一个小瓶中并更换溶液（参见注释 4）。
4.将小瓶放在轨道摇床上，在室温下以 70 rpm 的速度摇动 1 小时。

C.RI 重配

1.将组织样本（图 1C）转移到装有 100% 二苄醚的 5 mL 螺口玻璃瓶中，并紧密密封。
注意：处理二苄醚时，请戴双层丁腈手套并在通风罩中工作。用纸巾擦拭小瓶的外部。
2.将小瓶放在轨道摇床上，在室温下以 70 rpm 的速度摇动 48 小时。

D.贮存

1.将组织样本（图 1D ）转移到装有新鲜 100% 二苄醚的 5 mL 螺旋盖玻璃瓶中，并紧密密封。
注意：确保存储瓶中没有可见气泡，这可以通过将玻璃瓶稍微溢出并非常缓慢地关闭盖子来完成。
2.将样品储存在室温下，每月更换一次二苄醚。

数据分析

通过光片显微镜（例如 Blaze）对组织样本进行成像以定位免疫荧光。使用图像处理软件（例如，Imaris）进行Z 堆栈的编译和图块的拼接。图谱匹配和免疫荧光测量通过图像分析程序（例如NeuroInfo）实现。图 2A 显示了救援前后小鼠大脑的荧光片图像。图2B总结了救援前后不同脑区的荧光变化。

图2 .拯救了老鼠的大脑。 A. 救援前后的样本图像。叠加图像由 CF568、640 和 770 信号合成。 CF568图像显示中脑和丘脑有明显的混浊（之前），经抢救后已清除。比例尺，2 毫米。 B. 所有三种免疫荧光标记的平均荧光（任意单位，au；根据这些大脑区域内的 15-30 个随机选择的感兴趣区域计算）。这种增加可能是由于救援后背景显着降低（即衍射少得多）。

协议验证

我们已将此救援方案应用于先前由 iDISCO 清除的三批不同批次的昏暗脑组织以及由另一个实验室的不同研究人员类似地清除的另外两批昏暗脑组织。总的来说，我们使用八个模糊的大脑样本测试了该协议，并成功地重新清除了所有样本，同时保留了免疫荧光信号。

一般注意事项和故障排除

1.除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。
2.废物处理。与最初的 iDISCO 清理一样，用户应遵循当地环境健康和安全官员制定的废物处理机构要求。本方案中使用的所有试剂均应丢弃在适当的液体化学废物容器中。
3.避光。如果要挽救的组织样本具有免疫荧光标记，则需要小心减少荧光损失。选择包括始终使用铝箔覆盖含有组织样本的玻璃瓶并在弱光下操作。
4.解决方案改变。尽管上述方案将溶液更换描述为涉及将样品转移到含有所需溶液的新小瓶中，但也可以丢弃溶液并将组织保留在原始小瓶中，然后将新溶液添加到原始小瓶中。重要的是，装有样品的容器（即玻璃瓶）完全充满溶液。
5.该救援协议针对 iDISCO 清除的样本的救援进行了测试。在获救的小鼠大脑中，我们使用了以下一抗：一种是豚鼠抗 GFAP 抗体、鸡抗 Tuj-1抗体和兔抗 SREBP2 抗体的组合；另一种是单独的兔抗cFos。因此，二抗是高度交叉吸收的 CF770 缀合的山羊抗豚鼠 IgG、CF640 缀合的山羊抗鸡 IgG 和 CF-568 缀合的山羊抗兔 IgG（均来自 Biotium）。
6.该协议的时间线可根据样本的大小进行调整。
7.与 iDISCO 一样，救援过程中不同表位以及相应抗体的存活情况需要根据具体情况进行评估。由于所使用的救援程序和溶液与 iDISCO 基本相同，因此适合 iDISCO 的抗体很可能应该与该救援程序兼容。
8.由于该方案基于疏水性 iDISCO 方法，因此它也可能适用于通过其他疏水性清除方法制备的样品，但不适用于通过亲水性方法清除的样品。

致谢

HM、JM 和 QZ 得到了 NIH GM147912 奖、佛罗里达州卫生部 21A04 奖以及 Stiles-Nicholson 脑研究所飞行员奖的支持。 PG-K。和 RB 得到了 NIH 奖 MH094527 的支持。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

道德考虑

动物使用和相关程序得到了佛罗里达大西洋大学机构动物护理和使用委员会的批准（IACUC 协议#A21-06）。小鼠成对饲养。本研究使用总共 8 只年龄在 6 至 30 个月之间的雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠（杰克逊实验室，巴港，缅因州）收集脑组织。

参考

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