材料与试剂

生物材料

1.从胎儿（胎龄 18-22 周）或成人组织中分离出已建立的 3D 肠道类器官系（参见一般说明 1 ）

试剂

1.高级 DMEM/F12（Gibco，目录号：12634-028）
2.GlutaMAX 100 × （Gibco，目录号：35050-038）
3.HEPES 1 M（Gibco，目录号：15630-056）
4.青霉素-链霉素（青霉素/链霉素）10,000 U/mL（Gibco，目录号：15140-122）
5.冰醋酸（VWR，目录号：1.00056.2500）
6.L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：C7352）
7.I 型胶原蛋白，大鼠尾，5 mg/mL（IBIDI，目录号：50201）
8.TrypLEexpress （1 × ），酚红（Gibco，目录号：12605036）
9.Y27632（ROCK抑制剂）（Sigma-Aldrich，目录号：Y0503）
10.人类IntestiCult类器官生长培养基（包括 50 mL IntestiCult TM OGM 人类基础培养基和 50 mL 类器官补充剂）（ Stemcell Technologies，目录号：06010）
11.人类IntestiCult类器官分化培养基（包括 50 mL IntestiCult TM ODM 人类基础培养基和 50 mL 类器官补充剂）（ Stemcell Technologies，目录号：100-0214）

解决方案

1.Ad-DF+++ （参见食谱）
2.Human IntestiCult TM类器官生长培养基（参见配方）
3.Human IntestiCult TM类器官分化培养基（参见配方）
4.100 mM L-半胱氨酸（参见配方）
5.0.1% 乙酸溶液（参见配方）
6.胶原蛋白/0.1% 乙酸溶液（参见配方）

食谱_

媒体准备

1.广告-DF+++
用 5 mL 的 Pen/strep、5 mL 的 HEPES 和 5 mL 的GlutaMAX补充 500 mL 的高级 DMEM/F12 。

2.Human IntestiCult TM类器官生长培养基
将 50 mL 的IntestiCult TM OGM 人类基础培养基与 50 mL 的类器官补充剂和 1 mL 的 Pen/strep 结合起来。

3.Human IntestiCult TM类器官分化培养基
将 50 mL 的IntestiCult TM ODM 人类基础培养基与 50 mL 的类器官补充剂和 1 mL 的 Pen/strep 结合起来。

涂层解决方案

1.100 mM L-半胱氨酸
将 12.12 mg L-半胱氨酸溶解在 1 mL Milli-Q 水中。将溶液通过 0.2 µm 注射器灭菌过滤器。该溶液可在冰箱中保存长达两周。实验开始前，用无菌 Milli-Q 水将储备液稀释 10倍。

2.0.1%醋酸溶液
将 25 µL 乙酸添加到 25 mL Milli-Q 水中。将溶液通过 0.2 µm 注射器灭菌过滤器。

3.胶原蛋白/0.1%醋酸溶液
孔应涂有 10 µg 胶原蛋白/cm 2 。每个孔的生长面积为0.8cm 2 。对于 17 个孔（16 个孔 + 1 个额外孔），将 27.2 µL I 型胶原蛋白添加到 5,072.8 µL 0.1% 乙酸溶液中。

实验室用品

1.Applied BioPhysics ECIS 8W1E 阵列（ Ibidi ，目录号：72001）
2.Applied BioPhysics ECIS 8W10E 阵列（ Ibidi ，目录号：72010）
3.15 mL 管（Falcon，目录号： 352096）
4.0.2 µ m 注射器除菌过滤器（Sarstedt，目录号： 83.1826.001）
5.15 mL 管（Falcon，目录号： 352096）
6.200 µL 移液器吸头（蓝宝石，目录号： 775355）
7.1,000 µL 移液器吸头（蓝宝石，目录号： 777355）

设备

1.ECIS ® Z-Theta 仪器（Applied Biophysicals，目录号：71617）
2.16 孔阵列模块位于培养箱中，包括 8W 测试阵列（Applied Biophysicals，目录号：71612）
3.细胞培养设备（离心机、培养箱、移液器、无菌罩等）

软件和数据集

1.ECIS Zθ软件（应用生物物理学）
2.（可选）Excel
3.（可选）GraphPad棱镜

程序

使用层流柜在无菌环境中进行所有细胞和阵列操作。

A.16 孔站的准备

1.至少在实验前一天将 ECIS 16 孔站放入 37°C 的培养箱中，以预热阵列支架（图 1A）。
2.向培养箱的水箱中加水，以防止孔干燥。

图 1. 电池-基底阻抗传感 (ECIS) 设置。 A. 16 孔站放置在 37 °CB 的培养箱中ECIS ® Z-Theta 仪器（包括笔记本电脑）放置在靠近装有 16 孔站的培养箱的位置。 C. 8W测试阵列用于校准ECIS。运行测试阵列应提供阵列上提到的值（特写图片）的测量结果。 D. 8W ECIS 阵列可容纳 8 个孔，其中 8W1E 每孔有一个电极，8W10E（特写图）有 10 个电极。

B.阵列的准备

阵列的选择很大程度上取决于具体的科学问题和所涉及的细胞类型。阵列选择包括用于伤口愈合研究的 8W1E 阵列，因为它对细胞运动引起的电阻波动的敏感性增强。多电极阵列（例如 8W10E）可对多个电极上的信号进行平均，更适合通过最大限度地减少不均匀细胞分布造成的偏差来研究细胞增殖和屏障形成。

1.准备 100 mM L-半胱氨酸库存溶液，并用无菌 Milli-Q 水将库存稀释 10 倍。对于两个阵列，需要 3,500 µL 10 mM L-半胱氨酸溶液。因此，将 350 µL 100 mM L-半胱氨酸溶液添加到 3,150 µL 无菌 Milli-Q 水中。参见一般注释 2。
2.将 200 µL 10 mM L-半胱氨酸溶液添加到每个孔中。
3.在室温 (RT) 下孵育阵列 30-45 分钟。
4.用 300 µL 无菌 Milli-Q 水清洗孔两次。
5.将 300 µL 胶原/0.1% 乙酸溶液添加到每个孔中。
6.在 RT 下孵育阵列 60 分钟。
7.用 300 µL 无菌 Milli-Q 水清洗孔两次。
8.向每个孔中添加 400 µL Ad-DF+++。

C.站的校准和基线测量的开始

1.打开计算机和 ECIS Zθ机（图 1B）。参见一般注释 3。
2.打开 ECIS 软件。
3.将测试阵列放入工作站中，单击“设置”，然后检查连接（图 1C 和图 2A）。如果连接良好，则孔的颜色为绿色；如果连接良好，则孔的颜色为绿色。连接不良的显示为红色。重新插入阵列并单击“设置” ，直到所有孔都实现良好连接（图 2B）。
4.阵列类型弹出屏幕中选择 RC 测试阵列。
5.运行测试阵列检查（图 2C）。
6.如果 RC 测试正常并且显示正确的值（如测试阵列上所述），您可以继续使用 ECIS 进行实验（图 1C 和 2D）。如果值不正确，请联系制造商。
7.将带有介质的阵列放入 16 孔站中并执行检查。如果电极已用 L-半胱氨酸适当稳定，则 8W1E 和 8W10E 应分别给出大约 5 nF和 50 nF的值。参见一般注释 4。
8.选择阵列类型。
9.选择多频率/时间 (MFT)或其他模式（图 2C）。参见一般注释 5。
10.单击“开始”并输入文件名以开始运行（图 2C）。
11.测量基线至少 30 分钟。在此步骤中继续收获细胞。

D.细胞的制备

1.从类器官中取出培养基，并用 24 孔板中每个孔的 0.5 mL 冷 Ad-DF+++ 或 12 孔板中每个孔 1 mL 替换。
2.用 p1000 移液器上下移液几次以破坏基质胶，并将 Ad-DF+++ 与类器官收集在 15 mL 管中。
3.×离心 g 4°C 5 分钟以除去基质胶。
4.取出上清液，根据颗粒大小，将 1–3 mL 的TrypLE添加到 15 mL 管中。将细胞重悬于TrypLE中，并将 15 mL 管在 37 °C 水浴中孵育 5-7 分钟。参见一般注释 6。

图 2. 电池-基底阻抗传感 (ECIS) 软件。 A. 打开 ECIS 软件后，单击右侧窗口中的“设置” （黑色箭头）以测量设备的阻抗并检测开路。 B. 已正确连接的阵列/孔在屏幕左下窗口中显示为绿色，而开路的阵列或孔显示为红色。 C. 重新调整阵列的位置并再次选择“设置”（黑色箭头）以确认阵列的正确放置。通过选择检查（设置下方的按钮），将使用默认频率 4,000 Hz 进行测试阵列的测量。如果 L-半胱氨酸处理后电极未正确稳定，则可以通过选择稳定（绿色箭头）使用 ECIS 执行额外的稳定步骤。同一右侧窗格包含采集模式（用黑色方块轮廓）、伤口/电穿孔设置功能（用红色方块轮廓）和“开始”（红色箭头）按钮的选项。 D. 通过选择“检查”执行的测量（例如测试阵列的结果）显示在弹出屏幕上。 E.通过选择“暂停” （黑色箭头）可以停止数据采集，并且可以通过单击“恢复” （红色箭头）来恢复数据采集。 F. 选择“伤口/电孔设置”后，右下窗格中会出现其他设置。选择伤口（黑色箭头），调整伤口设置，然后单击激活（红色箭头）以执行伤口。通过选择“延迟至一小时” （用黑色方块标出），可以将受伤推迟到稍后的时间点。

5.剧烈重悬细胞 15–20 × ，以生成单细胞悬液。在 1,000 µL 吸头顶部添加 200 µL 吸头可大大改善类器官的机械破坏。肉眼不应看到任何细胞团或类器官结构。参见一般注释 7。
6.用 10 mL 的 Ad-DF+++灭活TrypLE 。
7.×旋转细胞 g在 4°C 下保持 5 分钟。除去上清液。
8.将细胞重悬于补充有 ROCK 抑制剂 (1:1,000) 的类器官生长培养基 (OGM) 中，并进行细胞计数。
9.每孔制备 150,000–300,000 个细胞的单细胞悬液。用补充有 ROCK 抑制剂的 OGM 调节音量。
10.暂停基线测量并将阵列从培养箱中取出（图 2E）。
11.移除阵列中的介质。
12.将 400 μL 均质细胞悬浮液添加到每个孔中。不要忘记包含一个空控件。
13.将阵列放回 16 孔站并恢复测量（图 2E）。参见一般注释 8。

E.实验运行和测量

频率选择 ECIS 实验依赖于研究目标和所研究细胞的特征。在电阻分析中，4,000 Hz 频率用作默认设置，因为该频率经常使用，因为它与捕获与细胞行为和屏障功能相关的细微变化相关，特别是在紧密连接形成和完整性的背景下。然而，最佳频率可能会有所不同，具体取决于细胞类型和具体实验条件。使用 ECIS 软件对胎儿和成人肠道类器官进行的频率扫描表明，电容测量应在 64 kHz 下分析，而电阻应在 500 Hz 下分析（图 3A、3B）。因此，本协议文件中显示的电容和电阻数据分别是在 64 kHz 和 500 Hz 频率下进行的测量。

图 3. 用于分析肠道类器官单层的最佳交流电 (AC) 频率。显示无细胞（空）和细胞覆盖条件之间最大差异的频率被认为是后续分析的理想选择。 A. 在类器官生长培养基(OGM)上生长的胎儿类器官的电容数据（以细胞与无细胞比率显示）在 64 kHz（虚线）处表现出最大响应。 B. 然而，500 Hz（虚线）或 1 kHz 似乎是分析电阻数据的最佳频率。

与细胞系相比，接种后不久需要更多的类器官细胞数量才能达到汇合。例如，大约需要 50,000 个 CaCo2 细胞才能在 24 小时内获得单层。 ECIS电容测量表明s 电极覆盖范围，表明如果每孔接种两种不同的类器官细胞数量（150,000 或 300,000），则在接种后的前 30 小时内不会形成单层（图 4A-4C）。大约 60 小时后，在每孔 300,000 个细胞的孔中形成单层，并且在每孔 150,000 个细胞的孔中形成单层之前还需要 30 小时（图 4D-4E）。 ECIS 电阻测量（500 Hz）与电容测量成反比，表明跨上皮电阻在单层形成时不断增加（图 4F-4J）。人类肠道类器官在三天内达到汇合每孔大约需要 300,000 个细胞，但这可能因供体的生长速度而略有不同。进行试点实验以确定适合您的研究问题的最佳细胞数量。

图 4. 二维肠道类器官衍生单层中的屏障形成。将来自同一胎儿组织培养物的肠类器官细胞接种到两个不同的 ECIS 8W10E 阵列中（图中显示为圆形或三角形）。 A. 随着细胞增殖并覆盖电极表面，电流受到阻碍。细胞增殖期间测量的电容与表面覆盖度成反比，直到形成完整的单层。是。在 64 kHz 下测量的电容（表示电极覆盖范围）表明，当分别接种 150,000 个（n = 12）或 300,000 个（n = 3）细胞时，60 小时和 90 小时后实现了完整的单层。 F. 随着单分子层的形成，观察到电阻显着增加。 G-I。在 500 Hz 下测量时，电阻持续增加并达到4,000 Ω 的稳定水平（表明细胞屏障完整）。条形代表平均值 ± 标准差。磷 < 0.05（*）， < 0.01（**）， < 0.001 (***)，和 < 0.0001 (****) 通过未配对t检验确定。

F.实验过程中更换介质

1.单击“暂停”以停止数据采集。实验时钟将继续运行。
2.将阵列从支架中取出，并在层流工作台下更换介质。播种后 2-3 天将培养基更换为不含 ROCK 抑制剂的培养基，并继续每 2-4 天更新一次培养基。参见一般注释 9。
3.将阵列放回支架并单击“检查”以检查阵列是否已正确放回。
4.等待 5-10 分钟后再恢复测量，因为温度变化会影响测量。
5.单击“恢复”重新开始数据采集。测量软件将在数据集中包含时间标记。参见一般注释 10。

G.细胞分化

如果研究问题需要细胞反映成熟的肠道，并且单层细胞包含组织内存在的所有主要细胞类型，则可能需要执行额外的分化步骤 [8]。在肠道单层形成后，通过将培养基从 OGM 切换为类器官分化培养基 (ODM)，观察到跨上皮阻力的额外增加（图 5）。在 ODM 中培养的肠道细胞含有分化细胞的生理相关特性，例如营养吸收以及消化酶和紧密连接蛋白的表达。

图 5. 类器官细胞分化导致电阻值增加。将来自成体组织的肠类器官细胞接种到 8W10E ECIS 阵列中并在IntestiCult中培养类器官生长培养基（ OGM）。 118小时后，当达到电容平台期但电阻值仍在增加（由虚线表示）时，细胞在OGM（n = 5）或类器官分化培养基（ ODM）（n = 3）中进一步培养。 A. 电容测量显示 OGM 或 ODM 中培养的细胞之间存在显着变化。 B) 另一方面，电阻测量表明，在 ODM 中培养的细胞中，电阻持续增加。 C-F。 118小时和200小时的电容数据表明，细胞覆盖电极的方式发生了轻微但显着的变化，这表明电阻的增加可归因于分化细胞形成更紧密的屏障。条形代表平均值±SD。 P < 0.01 (**)通过未配对t检验确定。

H.伤口愈合测定

在许多肠道疾病中都观察到肠上皮屏障的损伤。一旦形成稳定的单层，ECIS 就可以通过使细胞受到致命的电流来造成细胞损伤。电流专门杀死小金电极顶部的细胞，这些细胞随后死亡并与电极分离，形成伤口，而未受电流影响的相邻细胞会愈合伤口 [7]。该功能可以筛选可能通过改善或加快伤口愈合来提供显着临床益处的药物。
确定特定细胞类型的适当设置对于电击伤至关重要。如果损伤持续时间太短，可能会导致细胞去除不充分，而过长或严重的损伤可能会损坏电极。对于伤口愈合测定，来自类器官的 8W10E 汇合肠上皮单层受到不同电流的作用。虽然施加 4,000 μA的电流和 50,000 Hz 的频率持续 30 秒能够引起足够的细胞损伤，使细胞破坏其紧密连接，但电容数据显示电流不足以杀死存在于其上的所有细胞。电极。然而，在施加 5,000 μA的电流和 50,000 Hz 的频率 60 秒后，可以成功地对类器官衍生的单层造成伤害（图 6）。

图 6. 2D 类器官单层的损伤。单层细胞由成体类器官形成的细胞在类器官生长培养基（ OGM）中生长。 A.施加 4,000 μA的电流和 50,000 Hz 的频率 30 秒不足以消除n 8W10E 阵列电极上存在的所有细胞，而当电流 5,000 μA和频率50,000 Hz 时几乎不存在细胞。使用 50,000 Hz 持续 60 秒。图像是条件的代表性图片。公元前。电容和电阻测量还表明，只有在施加 5,000 μA和 50,000 Hz 的电流 60 秒时才能成功击伤，因为当施加 4,000 μA和 50,000 Hz的电流时，电容值不会下降到空对照中观察到的水平。使用 30 秒的 Hz。虚线表示受伤时间。条形代表两次重复的平均值±SD。

1.选择您想要进行伤害的井。
2.单击伤口/电孔设置框（图 2C）。
3.选择伤口（图 2F）。
4.调整缠绕时间 (s)、缠绕电流 ( μ A ) 和频率 (Hz) 的基线设置（图 2F）。参见一般注释 11。
5.您可以通过选择“延迟到小时”将受伤延迟到另一个时间（图 2F）。
6.单击“激活”以执行伤害。

数据分析

1.导航到文件。
2.单击导出数据。
3.选择所有数据或选定的孔/时间。
4.选择转为Excel或图表数据。使用 Excel 中导出的数据进行统计分析并生成图表。

协议验证

本文描述的协议经过一系列实验进行了细致的优化过程，以确保其有效性。对于这份协议文件，进行了几个较小的实验来说明保证实验成功的关键发现。这些较小的实验旨在突出关键见解并完善程序细节。对每个实验条件进行多次重复，并仔细考虑重复在两个阵列上的分布。这种方法不仅验证了协议的稳健性，而且确保了其在各种条件下的适应性和可靠性。
该协议已在以下研究文章中得到验证和使用：十 Hove 等人。 [9] .

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.该协议可能适用于源自各种组织类型的人类类器官，无论有或没有细微调整。
2.使用 L-半胱氨酸稳定 ECIS 阵列对于提高电极性能、促进增强的细胞附着和维持生物相容性环境至关重要。这种方法可保证从 ECIS 阵列导出的阻抗测量产生可靠的数据。
3.Szulcek发布了有关如何使用 ECIS 的详细协议等人。 [10] 和安维尔等人。 [11] .
4.如果某些孔尚未达到可接受的稳定性，则可以使用 ECIS 电稳定方法来执行清洁电极的替代方法。如果使用 ECIS 电稳定方法，则必须等待 30 分钟才能运行基线测量。有关此功能的更多信息可以在制造商的在线手册中找到。
5.多频时间 (MFT) 程序可自动测量各种交流频率下的选定孔，建议用于各种细胞相关测定，在超过 15 分钟的时间内观察到复合效应。单频时间（SFT）模式适用于单一频率下的快速数据采集。
6.如果 7 分钟的孵育步骤和随后的机械破坏证明不足以获得单细胞悬浮液，则可以将孵育步骤再延长 1-3 分钟。然而，类器官在TrypLE中的停留时间不要超过 10 分钟，因为这会影响细胞的活力。第二次孵育步骤后再次重悬。
7.获得均质的单细胞悬浮液至关重要，因为细胞团块在接种后往往会生长为类器官。这可能会影响电阻和电容测量。
8.如果您对增殖和屏障形成感兴趣，您可以在接种细胞后直接开始测量。然而，如果您对 ECIS 的损伤功能感兴趣，您可以将阵列放入培养箱中，然后将其转移到 16 孔站，当通过显微镜评估确定形成稳定的单层时进行损伤。
9.去除和添加培养基时小心不要损坏单层。将板的上侧稍微向上并向左（或向右）倾斜，以便培养基聚集到孔的一角。将尖端放在培养基聚集的角落，取出培养基。通过将介质轻轻移至井壁上，每口井添加 400 µL 介质。
10.暂停（绿色）和伤害（红色）动作的标记在执行这些动作的时间点显示为垂直虚线。
11.不同阵列类型之间的伤害设置可能有所不同。因此，如果使用另一种阵列类型，则需要进行试点实验来确定最佳受伤条件。
12.实验条件可能会影响类器官对伤害环境的敏感性。因此，如果细胞在 ODM 上生长或暴露于影响细胞活力的化合物，则可能需要进行初步实验来确定最佳损伤条件。

故障排除

问题 1：各孔之间的测量值差异较大和/或基线测量期间背景信号异常高。
可能的原因：电极没有得到适当的稳定。
解决方案：在开始基线测量之前，始终确保电极已经充分稳定。可以使用 ECIS 电稳定方法进行额外的稳定步骤。或者，您可以继续进行细胞接种，因为细胞也具有清洁电极的能力。然而，这个过程需要几个小时，并且在此期间进行的测量可能会表现出不寻常的模式。

问题 2：各井之间的测量结果差异较大。
可能的原因：类器官没有正确转化为单细胞悬浮液，并在电极上生长成团块。
解决方案：仔细检查单细胞悬浮液中是否存在类器官结构。如果仍然可以用肉眼观察到类器官结构，则继续破坏细胞。或者，每个条件包括更多重复，以解释孔的变异性。

问题 3：细胞随着阵列上细胞团块的生长而生长。
可能的原因：类器官未正确转化为单细胞悬浮液。
解决方案：仔细检查单细胞悬浮液中是否存在类器官结构。如果仍然可以用肉眼观察到类器官结构，则继续破坏细胞。

问题 4：细胞接种后无法存活。
TrypLE中保存时间过长或在不含 ROCK 抑制剂的培养基中培养。
TrypLE中的停留时间不要超过10 分钟，并且不要忘记在培养基中添加 ROCK 抑制剂。

利益争夺

作者声明不存在利益冲突。

参考

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2.医学博士哈尔彭 (Halpern) 和 PW 丹宁 (Denning) (2015)。肠上皮屏障功能在 NEC 发生中的作用。组织屏障 3(1–2) ：e1000707。
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4.Rossi, G.、Manfrin, A. 和 Lutolf, MP (2018)。类器官研究的进展和潜力。纳特。吉内特牧师。 19（11）：671-687。
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9.十 Hove, AS、Mallesh, S.、Zafeiropoulou, K.、de Kleer, JWM、van Hamersveld, PHP、Welting, O.、Hakvoort, TBM、Wehner, S.、Seppen, J.、de Jonge, WJ 等等人。（2023）。交感神经活性通过肾上腺素能受体 α2A 调节上皮增殖和伤口愈合。科学。报告13(1)：17990。
10.Szulcek, R.、Bogaard, HJ 和 van Nieuw Amerongen, GP (2014)。用于量化内皮增殖、屏障功能和运动性的细胞-基质阻抗传感。 J. 维斯。过期。 (85)：e51300。
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