材料与试剂

下面列出的所有材料和试剂都可以从其他供应商处获得。在我们的实验室中，我们对所有试剂均使用分子和细胞培养级。细胞培养实验推荐使用高质量的产品。

生物材料

1.细胞系：人胚肾293细胞（HEK 293），获自印度浦那国家细胞科学中心（NCCS）

试剂

1.抗 GFP (D5.1) 兔mAB （单克隆抗体）（Cell Signaling Technology，目录号：2956）
2.抗Myc标签小鼠单克隆抗体（ Proteintech ，目录号：60003-2-Ig）
3.兔抗小鼠 IgG HRP 偶联抗体（GeNei，目录号：1140580011730）
4.小鼠抗兔 IgG HRP 缀合抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-2357）
5.Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）（Gibco，目录号：11995-065）
6.胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号：10270106）
7.抗生素（青霉素和链霉素）（Gibco，目录号：15240062）
8.胰蛋白酶-EDTA（1 × ）溶液（ HiMedia ，目录号：TCL007）
9.Lipofectamine 2000（Invitrogen，目录号：11668-027）
10.放射免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液（Sigma Aldrich，目录号：R0278）
11.Femto LUCENT™ PLUS-HRP （ G-Biosciences，目录号：786-003）
12.蛋白酶抑制剂混合物（Protease Arrest™）100×（G-Biosciences，目录号：786-331）
13.Bradford 试剂（Bio-Rad，目录号：5000201）
14.Immobilon ® -P PVDF 膜（Merck Millipore，目录号：IPVH00010）
15.台盼蓝（Sigma，目录号：T6146）
16.OptiMEM （Gibco，目录号：31985062）
17.丽春红 S 染色剂（Sigma，目录号：P3504）
18.Tris碱（ HiMedia ，目录号：TC072）
19.甘氨酸（Merck，目录号：1.94907.0521）
20.十二烷基硫酸钠（SDS）（SR Lifesciences，目录号：14374）
21.氯化钠（默克，目录号：1.93206.0521）
22.KCl （ HiMedia ，目录号：7447-40-7）
23.NaH 2 PO 4 （Merck，目录号：MB024）
24.KH 2 PO 4 （ HiMedia ，目录号：PCT0009）
25.BSA（ HiMedia ，目录号：GRM3151）
26.脱脂奶粉（ HiMedia ，目录号：GRM1254）
27.Tween-20（SR Life Sciences，目录号：28599）
28.无水乙醇（Analytic CS，目录号：64-17-5）
29.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Gibco，目录号：10010023）
30.GeneJet Plasmid MidiPrep试剂盒（ Thermo Scientific，目录号：K0481）

解决方案

1.10 × PBS（参见配方）
2.PBST（1 × PBS 和 Tween-20）（参见配方）
3.封闭缓冲液（参见配方）
4.70% 乙醇（参见配方）
5.10 ×传输缓冲器（参见配方）
6.剥离缓冲液（参见配方）

食谱

1.10 × PBS
试剂最终浓度数量
氯化钠1.37米80克
氯化钾27毫米2克
磷酸钠2 PO 4
KH 2 PO 4100毫米
18毫米14.4克
2.4克
水分子_-最多 1 升
注意：将 pH 调整至 7.4。库存可在 25 °C 下保存长达 1 个月。
注意：从这个 10 ×库存中，可以制备500 mL 的1 × PBS 溶液：将 50 mL 的 10 × PBS 与 450 mL H 2 O 混合（可以在 25 °C 下保存一周）。使用双蒸水 (ddH 2 O)（高压灭菌）配制 1 × PBS 溶液。

2.PBST
试剂最终浓度数量
10 × PBS
吐温-20
水分子_1 ×
0.1%
不适用50毫升
500微升
450毫升
注意：使用 ddH 2 O。

3.封闭缓冲液
试剂最终浓度数量
BSA/脱脂奶粉
PBST2% 或 7%
1 ×0.2或0.7克
10毫升
注意：需要时新鲜准备。 PVDF 膜的封闭需要 7% 的封闭缓冲液。
可选：制备抗体稀释液需要 2% 封闭缓冲液。

4.70%乙醇
试剂最终浓度数量
乙醇
水分子_70%
不适用350毫升
50毫升
注意：需要时新鲜准备。

5.10 ×传输缓冲器
试剂最终浓度数量
特里斯25毫米30.2克
甘氨酸192毫米144克
水分子_-最多 1 升
注意：从该 10 ×库存中，可以制备1 ×转移缓冲液：将 100 mL 10 ×转移缓冲液溶解在 200 mL 甲醇中，并用水补足体积至 1 L。储存于 4 °C；这个可以重复使用两周。

6.剥离缓冲液
试剂最终浓度数量
甘氨酸199毫米1.5克
安全数据表0.1%0.1克
吐温-201%1毫升
水分子_高达 100 毫升
注意：调整 pH 至 2.2。

实验室用品
1.聚丙烯锥底离心管， 15 和 50 mL Falcon （ Tarsons ，目录号：546021 和 546041）（无菌）
2.T-25细胞培养瓶（ Tarsons ，目录号： 950040）
3.60 mm 细胞培养皿（ Tarsons ，目录号： 960020）
4.移液器（1000、200 和 20 μL ）（Eppendorf，目录号： 3123000063、3123000055、3123000098 ）和吸头（ Tarsons ，目录号： 523104、523101、523109 ）
5.手套（ Kimberlay Gloves ，目录号： KC500-S）
6.1.5 mL Eppendorf 管（ Tarsons ，目录号： 500010）和CRYOCHILL™ 二维编码瓶（ Tarsons ，目录号：883192）
7.封口膜 4" × 125'（SR Lifesciences，目录号：000814）
8.铝箔
9.丢弃盒（任何供应商）
10.喷雾瓶（任何供应商）
11.细胞刮刀（ Tarsons ，目录号：960051）

设备

1.-80 °C 深度冷冻柜（Eppendorf，目录号：F570）
2.微量离心机（Eppendorf，目录号：5424R）
3.CO 2培养箱（Eppendorf，目录号：Galaxy 48R）
4.倒置明场显微镜（Lawrence and Mayo，目录号：TC5400）
5.Chemidoc图像分析仪（Bio-Rad，目录号：12003028）
6.电印迹转移装置 ( BioNova )
7.SDS-PAGE装置（Bio-Rad，型号：Mini-PROTEAN Tetra Cell，目录号：1658038）
8.血细胞计数器（ Neubeur血细胞计数室）
9.层流罩（层流系统）
10.动物细胞培养设施
11.高压灭菌器（KETAN，目录号： PA21）
12.水浴（GeNei，目录号：107931GB）
13.涡旋混合器（ Tarsons ，目录号：3002）

软件和数据集

1.图像实验室软件 (Bio-Rad) （v6.1.0，2020）
2.适用于 Carl Zeiss 荧光显微镜的 Zen 软件（Zen 2.3，蓝色版，v2.3.69.1000）

程序

A.细胞的培养和维护

1.从 -80°C 或液氮中取出 2.0 mL 的 HEK 293 细胞冷冻管。
注意：使用低温手套从液氮或 -80 °C 中取出小瓶。
在 37°C 水浴中解冻冷冻管 2-3 分钟。
2.将 1 mL 无血清 DMEM 添加到解冻的小瓶中。
a.收集细胞并转移至 15 mL Eppendorf 管中。
b.将细胞以 800 × g离心3 分钟。
c.用 1 mL 新鲜的完整 DMEM [含有热灭活的 10% FBS 和 1% 抗生素 (v/v)（青霉素和链霉素）] 替换介质。
3.使用血细胞计数器计数约 8 × 10 5 个细胞，并将其接种到 T-25 烧瓶中。
4.将细胞在 37°C、5% CO 2的加湿培养箱中孵育 12-16 小时。
a.第二天，在倒置明场显微镜下观察细胞是否正确粘附（图1）。

图 1. 代表性图像显示 HEK 细胞汇合度 (70%–80%) 和在明场倒置显微镜下分析的粘附情况

b.用 3 mL 新鲜的完整 DMEM（含有 10% FBS 和 1% 抗生素）替换介质。

B.细胞分裂、计数和接种

1.从上述培养的 T-25 烧瓶中弃去培养基。
a.添加1 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液 (1 × ) ，并在 CO 2培养箱中于 37 °C孵育 3 分钟。
b.在明场倒置显微镜下观察脱离的细胞。
c.细胞分离后，添加 1 mL 完整 DMEM 以灭活胰蛋白酶，并将细胞收集到新鲜的 15 mL Falcon 管中。
可选：添加 1 mL 无血清 DMEM 以收集 T-25 烧瓶中剩余的细胞。
d.× g离心3 分钟收获细胞。
e.用 1 mL 无血清 DMEM 培养基清洗细胞沉淀（或以 1:1 比例混合 500 μL DMEM 和 500 μL 1× PBS）。通过上下移液轻轻重悬细胞。
f.再次以 500 × g离心3 分钟。
g.弃去培养基，加入 1 mL 新鲜的完全 DMEM 培养基，轻轻悬浮。
h.准备2个或3个T-25烧瓶，加入3 mL完全DMEM培养基，并向烧瓶中加入200 μL上述重悬细胞悬液（比例1:10或1:15）。
i.轻轻摇动烧瓶（来回），让细胞在 37 °C 的湿润 CO 2培养箱中生长。
2.要进行细胞计数，请遵循上述步骤 B1a–g。
3.取 1 mL 细胞悬液，使用台盼蓝血细胞计数器进行计数。
a.在新鲜的 1.5 mL Eppendorf 管中，添加 100 μL台盼蓝染料和 100 μL细胞悬浮液。用移液器轻轻混合。
b.将盖玻片放在血细胞计数器上，并使用移液器在盖玻片下添加 10 μL台盼蓝细胞悬液。让细胞均匀地分布在计数室上。
c.使用以下公式计算血细胞计数器的四个大方块中活细胞的数量：
细胞数/mL = (4个大方格内的细胞数/4) × 10 4 × 稀释倍数*
*稀释因子 = 2（100 μL台盼蓝染料：100 μL细胞悬浮液）
10 4 = 1 mL 的转换系数
例如：
4个大方格的单元格数量：1000
细胞数/mL = (1000/4) x 10 4 × 2 即5 × 10 6细胞/mL
要播种 1 × 10 6 个细胞/mL，请在 800 μL完整 DMEM中添加 200 μL细胞悬浮液。
4.接种 1 × 10 6 个细胞，并在 CO 2培养箱中37 °C下生长12 – 14小时，达到约 80% 汇合度（参见故障排除 4）。

C.共转染
1.观察上述步骤中接种在 60 mm 培养皿中的细胞，以确认汇合度 (70%–80%)。
2.使用新鲜质粒（pcDNA3.1 c- myc 、pEGFP-N1 载体和重组载体，即 pcDNA3.1 c- myc EDRF1 和 pEGFP-N1 NS2BNS3pro）进行转染（重组载体请参见补充图 S1A 和 B）建设发展）。
在转染实验前两天使用MidiPrep分离质粒。在 0.5 mL 管中制备 20–30 μL等分试样，并储存在 -20 °C 下。
3.取 1.5 mL Eppendorf 管，加入 1 μg pcDNA3.1 c- myc载体+ 1 μg pEGFP-N1 载体（管 1）、1 μg pcDNA3.1 c - myc EDRF1（管 2）、1 μg g pcDNA3.1 c- myc载体（管 3）、1 μg pcDNA3.1 c - myc EDRF1 + 1 μg pEGFP-N1 NS2BNS3pro（管 4）、1 μg pEGFP -N1 载体（管 5） ) 和OptiMEM (Mix-1) 中的1 μg pEGFP-N1-NS2BNS3pro（管 6）（参见故障排除 5）。
可选：包含两个不同标签的任何其他载体也可用于转染（FLAG 或 HA 标签载体）。
a.OptiMEM稀释的质粒在室温下孵育2-3 分钟。
4.取单独的 1.5 mL 管，并在OptiMEM (Mix- 2 )中添加 2 μL和 4 μL Lipofectamine 2000 。
a.OptiMEM稀释的 Lipofectamine 在室温下孵育2-3 分钟。
示例请参见表 1。

表1. 使用 Lipofectamine 2000 制备转染和共转染反应混合物
混合1混合2
S. 否转染/共转染质粒数量OptiMEM体积( μL ) _Lipofectamine体积 ( μL )OptiMEM体积( μL ) _
1.pcDNA3.1 c- myc载体+ pEGFP-N1载体2μL （ 1μg ） + 2μL （ 1μg ） _ _ _ _ _ _46446
2.pcDNA3.1 c- myc EDRF12μL （ 1μg ） _ _ _ _48248
3.pcDNA3.1 c- myc载体2μL （ 1μg ） _ _ _ _48248
4.pcDNA3.1 c- myc EDRF1 + pEGFP-N1 NS2BNS3pro2μL （ 1μg ） _ _ _ _ + 2μL （ 1μg ） _ _ _ _46446
5.pEGFP-N1载体2μL （ 1μg ） _ _ _ _48248
6.pEGFP-N1-NS2BNS3pro2μL （ 1μg ） _ _ _ _48248

注：每个质粒（1 μg ）与lipofectamine （ 2 μL ）的比例为 1:2。质粒与 Lipofectamine 也可以按 1:3、1:4 和 1:5 的比例使用。在共转染条件下，总质粒浓度为2μg （每个质粒1μg ），因此使用4μL Lipofectamine 。

5.将 Mix-1 添加到 Mix-2 中并孵育 20 分钟以形成质粒-Lipofectamine 复合物。
6.通过轻轻移液将复合物一滴一滴地添加到细胞上，并进一步将细胞在 37 °C 的 CO 2培养箱中孵育 5-6 小时。
7.用新鲜的完整 DMEM 替换介质，让细胞生长 48 小时。
8.转染 48 小时后，从板中取出介质并添加 1 mL 的 1 × PBS。
a.用细胞刮刀刮除细胞，并通过移液至新鲜的 1.5 mL Eppendorf 管中收集细胞。
b.×离心 g 5 分钟。
c.× PBS清洗细胞，并在 800 × g下离心5 分钟。
d.如果沉淀的细胞仍含有微量 DMEM 培养基，请重复洗涤步骤两次。
9.将 200 μL RIPA 缓冲液和 20 μL 1 ×蛋白酶抑制剂混合物添加到细胞沉淀中，轻轻重悬。
a.以 5 分钟的间隔涡旋悬浮液三次，并在冰上放置 30 分钟。
b.将细胞悬液以 20,000 ×离心 g 15 分钟。
c.将上清液收集到新鲜的 Eppendorf 管中作为全细胞裂解液。
10.用 Bradford 试剂定量裂解物的总蛋白。
a.分离 60 μg定量蛋白质。

可选：在进行细胞收获步骤 C8 之前，可以使用荧光显微镜分析 GFP 表达。
注意：分析 GFP 表达以确认转染。

D.蛋白质印迹法

1.使用蛋白质印迹转移单元在 1× 转移缓冲液中，在 80 V 电流下将上述解析的蛋白质转移到 PVDF 膜上 3 小时（或 50 V 过夜）。
2.用丽春红 S 染色剂对 PVDF 膜进行染色。
a.准备 50 mL 新鲜的丽春红 S 染色溶液。
b.将 4–5 mL 丽春红 S 染色剂添加到 PVDF 膜上，并将膜完全浸没。
c.将膜孵育 5 分钟，并在摇杆上缓慢搅拌。
d.去除丽春红 S 染色剂并将其收集在 Eppendorf 管中以供重复使用（至少两次）。
e.添加 ddH 2 O 水洗掉多余的污渍，当条带立即开始出现时，记录图像。
3.用 1× PBST 清洗膜，直至丽春红完全去除。
注意：丽春红污渍必须去除，因为它可能会妨碍封闭步骤。
4.配制 7% 封闭液，室温轻轻摇动封闭膜 2 h。
注意：需要针对每种抗体优化封闭步骤。使用 7% 封闭缓冲液以避免非特异性。
5.用1×PBST冲洗膜一次，加入一抗溶液[抗Myc标签（1.4μg / mL ，1:1000 ）在1×PBST或2%封闭缓冲液中]。
注：2%封闭缓冲液用于稀释一抗。
a.将膜在室温下孵育 2 小时或在 4°C 下孵育过夜，并轻轻摇动。
注：抗体的孵育时间和稀释度需要根据非特异性条带进行优化。
6.用 1× PBST 在摇床上轻轻摇动洗膜 3 次，每次 10 分钟。
7.添加用 1× PBST 稀释的二抗（抗小鼠 IgG HRP 结合；1:10,000）。
8.将膜在室温下孵育 2 小时。
9.用 1× PBST 剧烈搅拌洗膜 3 次，每次 15 分钟。
10.使用蛋白质印迹Femto LUCENT™ PLUS-HRP底物溶液对清洗后的膜进行显像，并使用Chemidoc图像系统 (Bio-Rad)捕获图像（参见故障排除 6）。

E.剥离并重新探测 PVDF 膜

进行剥离以用不同的抗体重新探测膜。所有剥离步骤均可在室温下进行。
1.从上述步骤D9开始，使用膜进行剥离。
a.2 O清洗膜两次，每次 5 分钟，并中等程度搅拌。
b.用 1× PBST 重复洗涤步骤两次，每次在摇床上中等搅拌 5 分钟。
c.添加约 10 mL 的剥离缓冲液，并在室温下中等搅拌下将膜在摇床上孵育 30 分钟。
d.2 O 在摇床上清洗膜5 分钟。
e.用 1× PBS 在摇床上清洗膜两次，每次 5 分钟。
f.用 1× PBST 在摇床上重复洗涤步骤两次，每次 10 分钟。
g.膜已准备好用不同的抗体重新探测。
2.要使用不同的抗体重新探测，请从上述蛋白质印迹步骤 (D4 –D 9) 中提到的封闭步骤开始。
注意：为了重新探测，在我们的实验中，我们使用了抗 GFP 抗体 (1:1,000)（一抗）和抗兔 HRP 偶联抗体（0.04 μg /mL，1:10,000）（二抗）。

数据分析

在此协议中，我们通过共转染和蛋白质印迹分析了 EDRF1 裂解。使用针对pCDNA 3.1 c- myc EDRF1 的抗Myc标签抗体和针对 pEGFPN1 NS2BNS3pro 表达的 GFP 标签抗体获得蛋白质印迹数据。在含有 EDRF1 作为插入片段的 pcDNA3.1 c- myc载体中，检测到 EDRF1 带完好无损，表明仅存在表达的 EDRF1（图 2，泳道 2）。正如预期的那样，单独的 pcDNA3.1 c- myc载体中没有观察到表达。重要的是，在共转染 pCDNA3.1 c- myc EDRF1 和 pEGFP-N1 NS2BNS3pro 条件下，在蛋白酶存在下，表达的 EDRF1 完全消失，表明 EDRF1 作为蛋白酶的底物（图 2，泳道 4）。单独的 pEGFP-N1 载体和 pEGFP-N1 NS2BNS3pro 裂解物作为对照上样（图 2，泳道 11 和 12）。为了确认上述实验中NS2BNS3pro的表达，我们在剥离同一膜后使用抗GFP抗体(pEGFPN1-NS2BNS3pro)检查了蛋白酶的表达。观察到，在共转染载体和单独的pEGFP-N1载体中，GFP被表达。在 pcDNA3.1 c- myc EDRF1 和 pEGFP-N1 NS2BNS3pro 共转染细胞裂解物中，检测到蛋白酶，从而证实了 NS2BNS3pro 在共转染条件下的表达（图 2，泳道 10）。还发现pEGFP-N1 NS2BNS3pro单独表达，这是对照（表2）。我们预计该分析将有助于识别病毒编码蛋白酶的新型底物，因为该协议简单、容易且快速执行。此外，该方案可用于评估抗蛋白酶分子。

表2.数据汇总表
Myc标签抗体GFP 标签抗体
S. 否质粒转染Myc标签融合蛋白GFP标签融合蛋白
1.pcDNA 3.1 c- myc载体 + pEGFP-N1 载体Myc标签为 1.2 kDa ，因此不会检测到任何条带
（共转染空载体）kDa的存在，将检测到 GFP 蛋白
（共转染空载体）
2.pCDNA 3.1 c- myc EDRF1~ 50 kDa pcDNA3.1c-myc EDRF1未检测到条带
3.pcDNA 3.1 c- myc载体未检测到条带未检测到条带
4.pcDNA 3.1 c- myc EDRF1 + pEGFP-N1 NS2BNS3pro由于蛋白酶存在下 EDRF1 的切割，未检测到条带
（共转染）~56 kDa pEGFP-N1 NS2BNS3pro 带，显示 GFP 标签蛋白酶的存在（共转染）
5.pEGFP-N1载体未检测到条带约 27 kDa GFP 条带
6.pEGFP-N1 NS2BNS3pro未检测到条带~56 kDa pEGFP-N1 NS2BNS3pro 带

图 2. 共转染裂解物的蛋白质印迹分析。 A.电印迹转移后的丽春红图像。每个泳道上都标明了加载的裂解液。 B. 和 C. 用抗Myc和抗 GFP 抗体探测的蛋白质印迹模拟图像。
协议验证

iScience (2023)上发表的文章中描述了该协议， https://doi.org/10.1016/j.isci.2023.107024 。我们重复了该协议，发现它很容易执行，并且结果一致。体外Pulldown 测定随后进行质谱鉴定/蛋白质印迹证实了 EDRF1 和蛋白酶之间的相互作用。体外序列分析表明 EDRF1 中总共存在 5 个蛋白酶切割位点。此外，EDRF1 和蛋白酶的叠加模型表明了蛋白酶催化三联体中切割位点的位置。上述观察结果支持所描述的协议的结果。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

如果共转染质粒使用相同的标签，则该方案需要具有不同标签的两种不同表达载体或特定于分析表达的蛋白质。该协议更方便使用两个不同的标记向量来执行。

故障排除
潜在问题可能的原因纠正措施
1. 细胞系污染和交叉污染
存在细菌/真菌/支原体。
从其他实验室获得的细胞系。
将两种细胞系一起培养维持期间处理不当。
用受污染的低温培养基制备冷冻管。在细胞培养中正确使用无菌设备和试剂将有助于维持无菌环境并最大限度地减少污染。
从经过认证的细胞存储库（NCCS、印度浦那或 ATTC）收集细胞。
一次培养并分裂一个细胞，或隔天进行细胞分裂。
如果可能的话，准备新鲜的低温培养基。使用细胞培养级 DMSO 或甘油或市售低温培养基。检查用于培养细胞的胎牛血清、培养基和抗生素的有效期。
2. 细胞培养基颜色变化
高度融合的菜肴。
CO 2水平较低。
细菌污染。根据需要解冻新的冷冻管或分裂细胞。
将 CO 2水平设置为 5% 并保持湿度。
× PBS（细胞培养级）清洗细胞。
丢弃介质并对层流罩柜和 CO 2培养箱进行消毒。
3. 细胞从低温阶段获得后没有贴壁低温培养基显示出毒性。
凋亡细胞过多。
冷冻过程中细胞数量较少。
连续通道的数量较多。使用 5% – 7% DMSO。
冷冻过程中使用 90% FBS。
准备装有 80% 汇合的新鲜分裂细胞的冷冻管。
4.细胞生长减慢补充细胞培养成分较少或不准确。
细胞培养条件（温度、湿度和CO 2水平）。
感兴趣的蛋白质不表达。从新鲜的冷冻管开始。
含有 10% – 12% FBS 的生长培养基有利于获得良好的融合。
将培养箱保持在 37°C、5% CO 2和水盘。
无需抗生素即可培养细胞。
5. 共转染不起作用转染试剂可能不合适。
细胞系可能无法有效地进行共转染。
共转染质粒不一起表达。检查质粒的数量和质量。使用高质量的质粒分离试剂盒（ Thermo MidiPrep或 High Pure Links 套件）
Lipofectamine 2000 对于大多数细胞系效果最佳。也可以使用 Lipofectamine 3000。
在进行共转染实验之前检查转染效率。
执行并分析需要共转染的各个质粒的转染。
6. 共转染质粒的蛋白质印迹
抗体未检测到共转染质粒中的蛋白质。
印迹中没有信号。
高背景。优化共转染质粒的转染时机。四十八小时的共转染给出了结论性的结果。
使用单个质粒作为对照来确认转染。
优化抗体稀释度（1:500 至 1:3 , 000）。
使用特定标记的抗体或蛋白质特异性抗体。
使用物种特异性二抗（抗小鼠或抗兔 HRP 偶联）。
优化一抗和二抗孵育时间和洗涤步骤。
优化封闭缓冲液（5% – 7% BSA 或脱脂牛奶）。
使用 1 × PBST 和最多 0.3% Tween-20。

致谢

STARS- MoE -IISc (STARS/APR2019/BS/584/FS) 为 LG 提供财务支持，印度医学研究委员会 (ICMR) 为 LG 提供奖学金

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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2.Li, XD, Sun, L., Seth, RB, Pineda, G. 和 Chen, ZJ (2005)。丙型肝炎病毒蛋白酶 NS3/4A 将线粒体抗病毒信号蛋白从线粒体上裂解下来，以逃避先天免疫。过程。国家。阿卡德。科学。美国102(49)：17717–17722。
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补充资料

以下支持信息可以在这里下载
1.图 S1A：DENV 蛋白酶的离体克隆和表达。
2. 图 S1B：EDRF1 离体克隆和表达。