材料与试剂

生物材料

1.移液器吸头：1–2 µL、2–200 µL 和 100–1,000 µL（Deltalab，目录号：200070 和 301-09）
2.直径 90 毫米的培养皿（Deltalab，目录号：200209）
3.1.5 mL 微量离心管（Deltalab，目录号：200400P）
4.50 mL 锥形离心管（Deltalab，目录号：42993）
5.0.22 μm 尼龙膜过滤器（例如，GVS，目录号：FJ13BNPNY002AD01）

试剂

1.三角褐指藻液体培养物[例如，藻类培养物保藏中心，德克萨斯大学奥斯汀分校（Utex），目录号：646 ]
2.PCR试剂盒
a.dNTP（Promega，目录号：U123A）
b.Platinum Pfx（Invitrogen，目录号：11708-013）
c.10 × Pfx扩增缓冲液（Invitrogen，目录号：52806）
d.MgCl 2 25 mM（Promega，目录号：A351H）
e.Taq Pegasus（Productos Bio-Logicos，目录号：EA01M）
f.GoTaq 绿色缓冲液 5 × （Promega，目录号：M791A）
3.目标质粒pFcpB（Addgene，目录号：90098）
4.pTA-Mob（Addgene，目录号：149662）
5.大肠杆菌DH10B（Thermo Fisher，目录号：Eco 113）
6.大肠杆菌pTA-Mob 液体培养物（自制）
7.pENTR/D-TOPO载体试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：K240020SP）
8.LR Clonase 酶混合物（Thermo Fisher Scientific，目录号：11791019）
9.琼脂培养基 2%（Britannia，目录号：B0101406）
10.Luria Broth (LB) 培养基（自制）
11.庆大霉素 (Gn) 库存溶液 25 mg/mL ( 1:1,000 ) ( Merck ，目录号：G3632 )
12.卡那霉素（Kn）储备液50 mg/mL（ 1:1,000 ）（ Merck，目录号：BP861）
13.氨比西林 (Amp) 库存溶液 100 mg/mL (1:1,000)（Merck，目录号：A9518）
14.Zeocin (Zeo) 库存商业溶液（Invitrogen，目录号：R25001）；在10 mL BG11 介质中使用浓度为 7.5 µL 的商业溶液库存
15.两性霉素 (Amph) 储备液 B 2.5 mg/mL (1:1,000)（Richet SA 实验室， https://www.richet.com.ar/en/list ?t=n&i= 13）；使用浓度为 2.5 µg /mL
16.BG11中号（自制）
17.选择板（0.5×BG11、1%琼脂+抗生素（Amp+Kn+Amph+Gn+Zeo）
18.接合板（0.5× BG11 + 0.9% 琼脂 + 5% LB + 抗生素（Amp + Amph + Gn）
19.胰蛋白胨（BD，目录号：211705）
20.酵母提取物（Oxoid，目录号：LP0021）
21.氯化钠（JT Baker，目录号：3624-19）
22.Na 2 Mg EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：14402-88-1）
23.柠檬酸铁（Merck，目录号：3522-50-7）
24.CaCl 2 · 2H 2 O（Merck，目录号： 10035-04-8)
25.MgSO 4 · 7H 2 O（Cicarelli，目录号：1054214）
26.K 2 HPO 4 （Cicarelli，目录号：1015214）
27.H 3 BO 3 （Cicarelli，目录号：771214）
28.MnCl 2 · 4H 2 O（Merck，目录号：13446-34-9）
29.ZnSO 4 · 7H 2 O（Merck，目录号：7446-20-0）
30.CuSO 4 · 5H 2 O（Merck，目录号：1.02790.1000.1026）
31.CoCl 2 · 6H 2 O（Merck，目录号：7791-13-1）
32.Na 2 MoO 4 · 2H 2 O（Merck，目录号：10102-40-6）
33.NaCO 3 （Merck，目录号：497-19-8）
34.NaNO 3 （Merck，目录号：7631-99-4）

解决方案
1.LB培养基（1升）
2.BG11 培养基（1 L）：
库存 I（1 升）
库存 II (1 L)
库存 III（1 升）
库存 V - 微量元素（1 L）
碳酸盐补充剂 (50 mL)
硝酸盐补充剂 (50 mL)

食谱

1.LB培养基（1升）
10 克胰蛋白胨
5 克酵母提取物
10 克氯化钠
1 L dH 2 O

2.BG11 培养基 (1 L)
库存 I（1 升）：
0.1 克 Na 2 Mg EDTA
0.55 3克柠檬酸铁
3.6克CaCl 2 · 2H 2 O
过滤灭菌后放入无菌瓶或高压灭菌器中。

库存 II（1 升）：
7.5 克 MgSO 4 · 7H 2 O
过滤灭菌后放入无菌瓶或高压灭菌器中。

库存 III（1 L）：
3.05克K 2 HPO 4
过滤灭菌后放入无菌瓶或高压灭菌器中。

库存 V - 微量元素（1 L）：
2.86克H 3 BO 3
1.81克MnCl 2 · 4H 2 O
0.222 克 ZnSO 4 · 7H 2 O
0.074 克 CuSO 4 · 5H 2 O
0.05克CoCl 2 · 6H 2 O
0.4451克Na 2 MoO 4 · 2H 2 O
过滤灭菌后放入无菌瓶或高压灭菌器中。

碳酸盐补充剂 (50 mL)
1克NaCO 3
过滤灭菌后装入无菌瓶中。

硝酸盐补充剂 (50 mL)
15克NaNO 3
过滤灭菌后装入无菌瓶中。

对于基本 BG11 (1 L)，请结合以下储备溶液：
添加 10 mL 的库存 I、II 和 III。
添加 1 mL 库存 V 和碳酸盐补充剂。
添加 5 mL 硝酸盐补充剂。
添加灭菌的 dH 2 O 至 1 L。

设备

1.移液器
2.纽鲍尔计数室
3.层流气流设备
4.50 mL 管容量的离心机
5.埃伦迈耶
6.37 ℃ 的房间或腔室
7.房间或房间，温度 18 ℃，光照 100-200 PAR
8.摇床（Vicking，型号：Shaker Pro）
9.分光光度计（Gene Quant，型号：1300）
10.双目光学显微镜
11.Applied Biosystems Veriti 热循环仪

程序

A.供体菌株（大肠杆菌pTA-Mob）的制备

细菌和硅藻之间形成接合菌毛的质粒。该质粒称为pTA -Mob (Gn r ) [12]，是一个 52.7 kb 的大质粒。使用适当的形式（化学/电感受态）用 pTA-Mob 质粒转化感受态大肠杆菌细胞（例如 DH10B）。将 DH10B 感受态细胞与约 50 ng pTA-Mob 质粒混合，并轻轻轻弹试管数次。将细胞在冰上孵育 2 分钟。将管从冰转移到 42°C 水浴中并热冲击恰好 45 秒。处理后，添加 700 μL LB 培养基，并在 37°C 孵育 1 小时。将平板置于含有庆大霉素的 LB 固体培养基（LB 培养基 + 10 g/L 琼脂）上，并在 37 ℃ 下孵育过夜。挑取抗性菌落，并使用特定引物（例如 Gentamycin_fw：TTAGGTGGCGGTACTTGGGT 和Promoter_Rv：GTTGACATAAGCCTGTTCGGT（预期 PCR 产物为 752 bp））通过菌落 PCR 检查质粒的存在，和/或通过限制性酶（例如 EcoRI（预期 PCR 产物）消化）检查质粒的存在消化片段： 29 kb、11,7 kb、8,8 kb、6,84 kb）。一旦得到证实，按照 Inoue 方法制备感受态细胞（图 1A ） [13]，从 DH 10B pTA-Mob 菌株（Gn r）中制备超感受态细胞。

B.制备从细菌转移到硅藻中的构建体

通过 PCR 使用5 '端含有 CACC 序列的正向引物，用高保真聚合酶 (Pfx)扩增感兴趣的序列，并将其克隆到 pENTR™ TOPO ®入门载体中。获得构建体后，使用您感兴趣的基因的引物和通用 M13 引物（M13_fw：GTAAAACGACGGCCAG，M13_rv：CAGGAAACAGCTATGAC）通过 PCR 对其进行检查，并通过限制性酶进行消化。最后，通过测序证实构建体。
pENTR载体具有重组位点 (attL1/attL2)，允许与包含 attR1/attR2 序列的其他质粒（目标质粒）重组。使用 Gateway LR Clonase 酶混合物促进重组反应。 pFcpB载体用作在硅藻中表达蛋白质的目的质粒。请注意，该载体包含光诱导启动子。通过 PCR（使用 Taq 聚合酶）检查目标质粒构建体，使用感兴趣基因的引物和 PfcpB 引物（pFcpB_fw：TTCACGGTTGCCAGAAGTCAAGTCG，pFcpB_rv：TCGAGGTAGCTCAGAATTCACCAC），并通过限制性内切酶消化（图 1B ）。

C.使用目的质粒转化 DH10B pTA-Mob (Gnr) 菌株

1.转化大肠杆菌pTA-Mob 菌株，并在含有两种抗生素（pTA-Mob 质粒为 Gn，pFcpB 为 Amp）的 LB 固体培养基上平板，以选择两种质粒（缀合步骤前三天）。
2.°C孵育过夜。
3.挑取一个菌落，用抗生素（Gn + Amp）接种 5 mL 新鲜 LB 培养基。
4.°C下摇动培养过夜。
5.在接合前一天下午，使用过夜培养物的 1/100 稀释液接种 50 mL 新鲜 LB 培养基（含有抗生素 Amp + Gn）。
6.让培养物在 20 °C和 190 rpm 下生长过夜，而不是如Karas 等人所述在 37 °C下生长 3 小时。 [9]。这种修饰导致显着更高的缀合效率，可能是因为较低的温度有利于重组蛋白的表达。在这两种情况下，收获时带有目的质粒的大肠杆菌pTA-Mob 菌株的 OD 必须在 0.8 至 1.2 之间。

图 1. 缀合方案的简化图。 A. 用约 50 ng 的pTA -Mob 质粒转化 DH10B 感受态细胞，铺在含有庆大霉素的 LB 固体培养基上，并在 37 ℃ 下孵育过夜。挑选一个抗性菌落，并通过菌落 PCR 或/和限制性酶消化检查质粒的存在。 B. 使用包含 CACC 的正向引物扩增感兴趣的序列 (SOI)，将其克隆到pENTR ™ TOPO® 入门载体中。转化感受态细胞并通过 PCR 和限制性酶消化检查入门克隆。确认入门克隆后，进行 Gateway LR Clonase酶混合反应以获得目标质粒。一旦通过测序证实了目标质粒，就转化pTA -Mob 感受态细胞。 C. 离心新鲜硅藻（1 × 10 8 个细胞）和大肠杆菌（OD = 0.8–1.2）培养物，并重悬于 500 µL 相应培养基中。然后，合并并铺在接合板中。 20天后，应该出现接合后的硅藻菌落。

D.硅藻（三角褐指藻）细胞的生长

本协议中使用的硅藻的一般生长条件包括长日光周期（16:8 h 光/暗）、100 μmol 光子 m -2 ·s -1 (100 μE m -2 ·s -1 ) 光强度、18 °C恒温，120 rpm 恒定搅拌。

1.挑选在固体 BG11 上生长的硅藻菌落并接种 50 mL 含有氨苄青霉素和两性霉素的液体 BG11。
2.大约 7 天后，该培养物将处于指数状态（1 × 10 6 个细胞/mL)。使用双目光学显微镜通过 Neubauer 计数室确定准确的细胞数，并取一定体积的培养物以获得 1 ×的终浓度锥形瓶中 50 mL 液体 BG11 中的浓度为10 4 个细胞/mL。然后，跟随培养物直至其达到生长曲线的稳定期（大约 1 × 10 6 个细胞/mL)。每种培养物中的最终细胞产量可能因培养基和生长条件而异。在我们的情况下，需要一到两周的时间。细胞数量越高，接合后集落的数量也越高。

E.细胞收获和对照板

1.取锥形瓶的全部体积用于细菌和硅藻，并在室温下离心（始终在层流下工作）。低速 (2,000 × g ) 离心 5 分钟。请勿使用制动器以确保细胞活力。
2.将颗粒重新悬浮在 500 μL 相应的培养基中：BG11 用于硅藻，LB 用于大肠杆菌。
3.取 50 µL 硅藻和平板：
a.不含 Zeo 的板用于检查生长情况（阳性对照）。
b.用 Zeo 平板证实野生型硅藻抗生素敏感性（阴性对照）。
4.将这些板在 18 °C 、100 μmol光子 m -2 · s -1光强度下孵育。

F.混合硅藻和 DH10BpTA-Mob 细菌（接合）

1.在 1.5 mL Eppendorf 中管中，将 200 µL 硅藻与 200 µL含有感兴趣结构的大肠杆菌DH10B pTA-Mob 细菌菌株混合。将混合物铺在结合板上（图 1C）。
2.30°C 黑暗中孵育 90 分钟。
3.18℃、100 μmol光子 m -2 · s -1光强度下孵育 48 小时。在此期间，进行接合。
4.通过添加 200 μL BG11 培养基来收集在板上生长的所有细胞，然后取出整个体积并将其铺在含有 Zeo 的选择板上。
5.μmol光子 m -2 · s -1光强度下孵育。 20 天后，应出现对 Zeo 具有抗性的接合后菌落。
6.通过菌落 PCR 检查外接合硅藻细胞中是否存在质粒。
7.要进行菌落 PCR，请按照标准菌落 PCR 进行。用牙签取出一个菌落，将其引入装有 20 μL 含有引物的 PCR 溶液混合物的 PCR 管中（最佳组合是特定对比引物之一和第二个 PfcpB 引物，如 B 部分中所建议）。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：
•Cainzos, M.、Marchetti, F.、Popovich, D.、Leonardi, P、Pagnussat, G 和 Zabaleta E. (2021) γ 碳酸酐酶是硅藻线粒体复合物 I 的亚基。摩尔。微生物学 116(1)，第 109–125 页

一般注意事项和故障排除

缀合效率很大程度上取决于构建体的长度，而构建体的长度又取决于克隆到目标载体中的感兴趣序列的长度。使用小质粒可获得最高数量的接合子。

致谢

这项工作得到了 ANPCyT 赠款 PICT 18 0652 的资助。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

1.Sommer, U.、Stibor, H.、Katechakis, A.、Sommer, F. 和 Hansen, T. (2002)。不同营养丰富度水平的中上层食物网配置及其对鱼类产量与初级生产比率的影响。海洋捕捞的可持续增长：基本机制和新概念：11-20。
2.Falciatore, A. 和 Mock, T.（编）。（2022）。硅藻的分子生命。施普林格国际出版社。
3.Wilhelm, C.、Büchel, C.、Fisahn, J.、Goss, R.、Jakob, T.、LaRoche, J.、Lavaud, J.、Lohr, M.、Riebesell, U.、Stehfest, K.,等人。（2006）。硅藻中碳和养分同化的调节与绿藻显着不同。原生生物157(2)：91-124。
4.Allen, AE、LaRoche, J.、Maheswari, U.、Lommer, M.、Schauer, N.、Lopez, PJ、Finazzi, G.、Fernie, AR 和 Bowler, C. (2008)。羽状硅藻三角褐指藻对铁饥饿的全细胞反应。过程。国家。阿卡德。科学。美国105(30)：10438–10443。
5.Murik, O.、Tirichine, L.、Prihoda, J.、Thomas, Y.、Araújo, WL、Allen, AE、Fernie, AR 和 Bowler, C. (2018)。线粒体替代氧化酶的下调影响海洋硅藻的叶绿体功能、氧化还原状态和应激反应。新植醇。 221（3）：1303-1316。
6.Butler, T.、Kapoore, RV 和 Vaidyanathan, S. (2020)。三角褐指藻：硅藻细胞工厂。趋势生物技术。 38（6）：606-622。
7.Zulu, NN、Zienkiewicz, K.、Vollheyde, K. 和 Feussner, I. (2018)。了解硅藻脂质代谢的当前趋势。程序。脂质研究。 70：1-16。
8.Rodolfi, L.、Chini Zittelli, G.、Bassi, N.、Padovani, G.、Biondi, N.、Bonini, G. 和 Tredici, MR (2008)。石油微藻：菌株选择、脂质合成诱导和低成本光生物反应器中的户外大规模培养。生物技术。生物工程。 102（1）：100-112。
9.Karas, BJ、Diner, RE、Lefebvre, SC、McQuaid, J.、Phillips, AP、Noddings, CM、Brunson, JK、Valas, RE、Deerinck, TJ、Jablanovic, J. 等。（2015）。通过细菌接合传递设计的硅藻附加体。纳特。交流。 6(1)：e1038/ncomms7925。
10.Diner, RE、Bielinski, VA、Dupont, CL、Allen, AE 和 Weyman, PD (2016)。硅藻游离体维持序列的细化和基于接合的 DNA 递送方法的改进。正面。生物工程。生物技术。 4：e00065。
11.Cainzos, M.、Marchetti, F.、Popovich, C.、Leonardi, P.、Pagnussat, G. 和 Zabaleta, E. (2021)。 γ 碳酸酐酶是硅藻线粒体复合物 I 的亚基。摩尔。微生物。 116（1）：109-125。
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13. Sambrook, J. 和 Russell, DW (2006)。感受态大肠杆菌的制备和转化的 Inoue 方法：“超感受态”细胞。冷泉港。协议。 2006（1）：10-1101。