材料与试剂

生物材料

用于器官型组织培养
1.MRC-5（ATCC ，目录号：CCL-171）
2.N/TERT-1（James G. Rheinwald ，哈佛大学医学院）

用于蛋白质组学
1.胺（NH2）功能性微粒， MagReSyn ® Amine [ ReSyn Biosciences (Pty) Ltd., 南非]
2.羟基封端珠子， MagReSyn ® Hydroxyl [ ReSyn Biosciences (Pty) Ltd.，南非]
3.磷酸肽富集的螯合 Ti4 + 金属离子的磁性微粒， MagReSyn ® Ti-IMAC HP [ ReSyn Biosciences (Pty) Ltd.，南非]

试剂

用于器官型组织培养
1.青霉素/链霉素（ Thermo Fisher，Gibco ，目录号：151401 ）
2.DMEM （ Thermo Fisher，Gibco ，目录号：41966029）
3.角质形成细胞-SFM（ Thermo Fisher，Gibco，目录号：17005034）
4.TrypLE （ Thermo Fisher，Gibco，目录号：12605028）
5.牛垂体提取物（BPE）（ Thermo Fisher，Gibco，目录号：13028014）
6.胎牛血清（FCS）（ HyClone ，目录号：SH30071.03HI ）
7.EGF（ Thermo Fisher，Gibco，目录号： PHG0314）
8.胰岛素（Sigma- Aldrich，目录号： 11070-73-8）
9.氢化可的松（Sigma-Aldrich，目录号：H0888）
10.三碘甲状腺原氨酸（T3）（ Sigma-Aldrich，目录号： T2752）
11.L-谷氨酰胺（ Thermo Fisher，Gibco，目录号：A2916801）
12.Hams F12（ Thermo Fisher，Gibco，目录号：11765-054）
13.鼠尾胶原蛋白I（自家实验室制造[12] ）
14.腺嘌呤（Sigma-Aldrich，目录号：A8626）
15.盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：H1758）
16.杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D5652）
17.牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7979）
18.氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：655104）
19.氯化钙（CaCl 2 ·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C7902）
20.硫酸庆大霉素（Sigma-Aldrich，目录号：G1264）
21.霍乱肠毒素（ Sigma-Aldrich，目录号：C8180）
22.10×最低必需培养基（10×MEM）（ Thermo Fisher，Gibco，目录号：11430-030）
23.碳酸氢钠（ Thermo Fisher，Gibco，目录号：15750037）
24.Tissue-Tek ® （SAKURA，目录号：4583）
25.福尔马林溶液中性缓冲，10%（Sigma-Aldrich，目录号：HT501128）
26.蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）
27.异戊烷（Sigma-Aldrich，目录号：PHR1661）

用于蛋白质组学
1.裂解缓冲液，由 2% 十二烷基硫酸钠 (SDS)、5 mM 三(2-羧乙基)膦(TCEP)、5.5 mM 氯乙酰胺 (CAA) 和 100 mM Tris pH 8.5 组成；用于细胞裂解
2.乙腈 (ACN)，LC 级（ Supelco TM Analytical，目录号： 75-05-8），在整个方案中以不同浓度使用，即 70% 用于稀释裂解液，95% 用于洗涤蛋白质，以及 40% 和 60%用于SepPak上的洗脱。 ACN 也用于 TMT 标签
3.乙醇（无水）（Sigma-Aldrich，目录号：459836），以 70% 浓度用于聚集后洗涤蛋白质
4.50 mM 碳酸氢铵 (ABC)（Sigma-Aldrich，目录号：09830），用于蛋白质消化和重悬 TMT 标记的肽
5.50% 三氟乙酸 (TFA)，HPLC（ Supelco TM Analytical，目录号：TX1276），用于消化后样品的酸化
6.1 M TEAB，pH 8（热 Scientific TM ，目录号：90114），用于在 TMT 标记中实现 100 mM 的终浓度
7.50%羟胺（热 Scientific TM ，目录号：90115），用于淬灭 TMT 标记反应
8.0.1% 甲酸 (v/v) 水溶液（LC-MS 级）（热 Scientific TM ，目录号：85170），用于在合并之前重新悬浮每个 TMT 标记的样品
9.上样缓冲液，由 80% ACN、5% TFA 和 1 M 乙醇酸组成（Sigma-Aldrich，目录号：8.04104）；用于重悬肽以富集磷酸肽
10.1%氨水（氨溶液25%）（ Supelco ，目录号：105428），用于磷酸肽的洗脱
11.5 mM ABC（缓冲液 A）和 100% ACN（缓冲液 B），用于高 pH 值反相肽分级分离
12.Pierce TM BCA 蛋白检测试剂盒（ Thermo Scientific TM ，目录号：23225）
13.TMTpro TM 16plex标签试剂套装（ Thermo Scientific TM ，目录号：A44520）
14.LysC ，赖氨酰内肽酶（Fujifilm Wako，目录号：129-02541）
15.胰蛋白酶，测序级修饰胰蛋白酶（Promega，目录号：V511X）
16.Sep-Pak C18 1 cc 真空滤筒（Waters，目录号：WAT054955）
17.Acquity CSH C18 1.7 μm ，1 mm × 150 mm 色谱柱（Waters，目录号：186006935）

解决方案

1.腺嘌呤（参见食谱）
2.霍乱肠毒素 (CT)（参见食谱）
3.氢化可的松 (HC)（参见食谱）
4.表皮生长因子 (EGF)（参见食谱）
5.三碘甲状腺原氨酸 (T3)（参见食谱）
6.氯化钙 (CaCl 2 )（参见食谱）
7.胰岛素（1,000 × 5 µg/mL）（参见食谱）
8.碳酸氢钠（71.2 mg/mL 毫q水）（参见食谱）
9.角质形成细胞无血清培养基 (K-SFM) 完整（参见食谱）
10.器官型培养基（参见食谱）
11.DMEM 10% FBS (DMEM-10)（参见配方）

食谱

用于器官型组织培养
1.腺嘌呤
在 HCl 中制备 2.4 mg/mL 腺嘌呤（这是 100 ×库存）：
a.将 243 mg 腺嘌呤溶解在 100 mL 0.05 M HCl 中。
b.在室温 (RT) 下搅拌约 1 小时。
c.用0.2μm过滤器过滤除菌。
d.分成 5 mL 等份。
e.储存于-20°C。

2.霍乱肠毒素（CT）
制备 10 µM 霍乱肠毒素溶液（这是 1,000 × 100 pM的储备溶液）：
a.将 1.18 mL Milli-Q 水添加到 1 mg 霍乱肠毒素小瓶中，制备 10 -5 M 溶液。
b.将其稀释在 110 mL 的 PBS 中。
c.使用 0.2 µm 过滤器过滤灭菌。
d.每个冷冻管等分 2 mL。
e.储存于-20°C。
注： MW CT = 84.000 Da

3.氢化可的松 (HC)
制备 0.2 mg/mL 氢化可的松（这是 0.4 µg/mL 的 500 ×库存）：
a.将 25 mg 小瓶溶解在 5 mL 100% 乙醇中。该溶液的浓度为 5 mg/mL，相当于0.4 µg/ mL 的 12.5 × 。这可以无限期地保存在-20°C。
b.将 2 mL 的浓缩库存添加到 48 mL 的无菌 PBS + 0.1% BSA 中。
c.使用 0.2 µm 过滤器过滤灭菌。
d.将 2 mL 等分到冷冻管中。
e.储存于-20°C。

4.表皮生长因子（EGF）
准备 10 µg/mL 的 EGF（这是0.2 ng/mL 的50,000 ×库存）：
a.将 100 µg EGF 溶解在 10 mL PBS + 0.1% BSA 中。
b.使用 0.2 µm 过滤器过滤灭菌。
c.将 1 mL 等分到冷冻管中。
d.储存于 - 20 °C。

5.三碘甲状腺原氨酸 (T3)
准备 20 nM (2 × 10 -8 M) 的 T3 [这是20 pM (2 × 10 -11 M) 的 1,000 ×库存]：
a.量取 6.8 mg T3 并溶解在 7.5 mL 0.02N NaOH 中。
b.添加 42.5 mL PBS（对于 20 pM T3，这是 100,000 × ）。
c.以 10 mL 等份储存于 -20 °C。
d.要制作 1000 ×库存，请将 100,000 × 1:100 的 0.4 mL 稀释到 39.6 mL 的 PBS 中。
e.使用 0.2 µm 过滤器过滤灭菌。
f.分成 2 mL 等份。
g.储存于-20°C。

6.氯化钙 (CaCl 2 )
使用二水钙 CaCl 2 · 2H 2 O 进行制备（这是 1,000 × 0.3 mM 的储备液）：
a.将 4.4 g CaCl 2 ·2H 2 O 溶解在 100 mL Milli Q 水中。
b.用磁力棒搅拌至完全溶解。
c.使用 0.2 µm 过滤器过滤灭菌。
d.每个冷冻管等分 2 mL。
e.储存于-20°C。

7.胰岛素（1,000 × 5 µg/mL）
使用来自牛胰腺的胰岛素。
a.将 100 mg 胰岛素溶解在 50 mL 蓝盖管中的 20 mL 0.005 M HCl 中。
b.通过醋酸纤维素、低蛋白结合 0.2 µM 过滤器过滤灭菌。
c.每管等分 500 µL。
d.储存于-20°C。

8.碳酸氢钠（71.2 mg/mL milliQ水）

对于器官型培养

1.角质形成细胞无血清培养基 (K-SFM) 完整
试剂最终浓度数量
角质形成细胞-SFM不适用500毫升
CaCl 2 (1 , 000 × )0.3毫米500微升
BPE（16.8 毫克/毫升）25微克/毫升750 µL
EGF（ 10微克/毫升）0.2纳克/毫升10微升
全部的不适用501.26 毫升
可选：青霉素/链霉素也可以添加到 K-SFM 中 (100 U/mL)。

2.器官型培养基
试剂最终浓度数量
DMEM不适用375毫升
F12不适用125毫升
笔/链球菌100单位/毫升5.14毫升
腺嘌呤（2.4 mg/mL 库存）24微克/毫升5.14毫升
HC （0.2 毫克/毫升库存）0.4微克/毫升1毫升
CT（ 10 µM库存）下午100点0.514毫升
T3（1,000 × ）20点0.514毫升
胰岛素 (1,000 × )5微克/毫升500微升
燃料电池系统0.3%1.54毫升
全部的514.3 毫升

3.DMEM 10% 胎牛血清 (DMEM-10)
试剂最终浓度数量
DMEM不适用445毫升
胎牛血清10%50毫升
笔/链球菌100单位/毫升5毫升
全部的500毫升

实验室用品

用于器官型组织培养
1.深孔板（Corning，目录号：355467）
2.细胞培养插管，PET 膜，孔径 3.0 µm（Corning，目录号：353092）
3.气升垫（切成圆圈并高压灭菌）（Whatman，GE Healthcare，目录号：10382461）
4.任何品牌的细胞培养培养皿或烧瓶（我们使用 NUNC、Falcon 和 Corning）

设备

用于器官型组织培养
1.CO 2培养箱（任何品牌均可）
2.离心机（任何品牌，适用于 15 mL 管且至少 100 g）
3.冷冻柜（-20 °C 和 -80 °C）

蛋白质组学设备和软件
1.KingFisher TM Flex 纯化系统（ Thermo Scientific，目录号：5400610）
2.SpeedVac （ Eppendor ，型号： Vacufuge TM浓缩器）
3.超声波发生器（ Fisherbrand ，型号：120 Sonic Dismembrator ）
4.分光光度计（ Thermo Scientific，型号： NanoDrop TM 2000 C）
5.HPLC系统[ Thermo Scientific，型号： UltiMate TM 3000 Standard (SD)]
6.Evosep 1 ( Evosep )
7.质谱仪（ Thermo Scientific，型号：Orbitrap Exploris TM 480）
8.Proteome Discoverer 软件 v2.4 ( Thermo Scientific)
9.Chromeleon软件 v7.2（赛默飞世尔科技）

程序

第一部分：器官型组织培养

A.为器官型培养准备细胞（第 1-5 天）

1.成纤维细胞培养
a.培养成纤维细胞（我们使用 MRC-5 细胞），直到 T75 烧瓶达到 80%–90% 汇合度。一盘器官型培养物需要 180 万个成纤维细胞。对于大多数成纤维细胞，您需要提前三天接种 80 万个成纤维细胞（见图 1）。

图 1. 适合器官型胶原凝胶的成纤维细胞

b.胰蛋白酶消化5 分钟，并用等体积的含 10% FCS 的 DMEM 中和。计数细胞（仅活细胞）并离心。
c.每毫升 DMEM-10 8×10 5重悬成纤维细胞。
d.将细胞置于冰上，同时混合胶原凝胶。

B.铸造器官型培养物
注意：确保此时准备好足够的成纤维细胞。您将需要 180 万个细胞。

无细胞胶原蛋白凝胶
注意：所有溶液必须冰冷或置于冰上。
如需更多指导，请观看视频 1。

视频 1. 如何制作器官型培养物

1.通过在每个孔中添加一个细胞培养插入物来准备深孔板（6 孔大小）。使用无菌镊子。
2.在冰上的 50 mL 管中，混合以下组分，不要产生气泡：
a.650微升 10× MEM
b.70微升_ L-谷氨酰胺（100 × 200 mM 库存）
c.10 µ L硫酸庆大霉素 (40 mg/mL)
d.725 µ L胎牛血清 (FCS)
e.725微升_ 碳酸氢钠(71.2 mg/mL)
f.5.5 mL鼠尾胶原蛋白（4 mg/mL，0.05% 乙酸）（自制，参见[12] ）
g.850 µ L DMEM ，含 10% FCS
h.添加几滴 1 M NaOH 进行中和。
3.小心地将上一步中的 1 mL 无细胞凝胶混合物移入培养插管中，并确保其覆盖插管的整个底部。准备成纤维细胞和细胞凝胶时，在培养箱中聚合。 10-15 分钟后凝胶将聚合。

C.细胞凝胶的制作

1.在冰上的 50 mL 管中，混合以下成分（避免产生气泡）：
a.1.7 mL 10 × MEM
b.170微升_ L-谷氨酰胺（100 × 200 mM 库存）
c.25微升硫酸庆大霉素 (40 mg/mL)
d.1.9 mL 的FCS
e.525微升_ 碳酸氢钠(71.2 mg/mL)
f.14.4 mL鼠尾胶原蛋白（1 mg/ml，溶于 0.05% 乙酸）（自制）
g.2.1 mL 人成纤维细胞（180 万个细胞）悬浮于 10% 小牛血清 DMEM 中
2.轻轻混合并添加几滴 1 M NaOH 以中和溶液（颜色应变为橙色/浅粉色）。
3.快速将 3 mL 添加到无细胞凝胶顶部的培养插入物中。避免气泡。
4.将托盘放入培养箱中约30分钟；凝胶将完全聚合。
5.在孔 (18 mL) 中填充 DMEM 10% FCS，并在凝胶顶部填充 2 mL。请勿喷涂。请参见图 2 和视频 2。

图 2. 浇铸的器官型胶原凝胶，准备添加培养基

视频 2. 如何在器官型培养物上填充培养基

D.成熟的胶原蛋白凝胶
四到六天后，凝胶收缩并在宏观上呈现为稍微收缩的白色圆盘，它们就可以为角质形成细胞做好准备。
注意：在我们手中，这会产生良好的器官型培养物，可能是由于成纤维细胞对 ECM 的活跃沉积和重组。

E.用成纤维细胞在铸造的胶原凝胶上接种角质形成细胞（计时 2 小时）
1.胰蛋白酶消化要播种的 N/TERT-1 细胞（WT 和经过验证的敲除）并将浓度调整至 1 × 10 7 个细胞/mL（图 3）。
注意：每个凝胶需要铺板3 × 10 5 个细胞。
2.从深孔板中每个孔的底部吸出介质。
3.用 p1000 移液器从培养插管中取出培养基。
重要：避免移液器距离插入件内的凝胶太近，因为您可能会吸入凝胶。
4.在凝胶中心添加 30 µ L细胞悬浮液（来自步骤 E1）（视频 3）。

视频 3. 将角质形成细胞添加到器官型培养物中

5.在深孔板的孔底部添加器官型培养基（参见配方），直至其到达培养插管的底部（ ∼ 9 mL）。
6.°C孵育20 分钟，让细胞贴壁。
7.在贴壁细胞顶部添加 2 mL 器官型培养基，并在插入物外部添加∼ 16 mL 器官型培养基，并小心放入培养箱中。不要喷洒，因为角质形成细胞会脱落。
8.孵育四天，然后取出凝胶。

图 3. 角质形成细胞集落。 A. 非常适合器官型胶原蛋白凝胶的集落。 B. 不适合器官型培养的集落。

F.气液界面提升角质形成细胞。时间：30 分钟（视频 4）。

视频 4. 放置气升垫

a.接种角质形成细胞后第 4 天，小心地从培养插入物和板孔中吸出培养基。
b.使用无菌镊子将插入物放入无菌 100 mm 培养皿中。
c.将两个无菌气升垫添加到深孔板中每个孔的底部，然后将插入物放回到垫上的孔中。
d.在深井中添加约 9 mL 的器官型培养基，直到垫完全湿润。
关键：介质的液位应覆盖焊盘且不能高于焊盘。

G.向器官型培养物中添加抑制剂（第 4-14 天）

对于使用不同抑制剂的实验，当插入物上升到气液界面时，培养基中会补充所需浓度的抑制剂。抑制剂的浓度通过随后的培养基更换来补充。请注意，对于某些抑制剂，与在 2D 培养细胞上使用相比，需要提高浓度。将所需的抑制剂直接添加到孔中的介质中。每次更换介质时都要补充。

H.器官型培养物的成熟
将板在加湿培养箱中于 37°C 下孵育，并每隔一天更换深孔中的介质。 10 天后即可收获凝胶（图 4）。

图 4. 准备固定的器官型培养物。箭头指向收缩的胶原蛋白凝胶中角质形成细胞生长的凹面。

注意：现在可以固定器官型培养物以进行组织学分析或进行蛋白质印迹、 RNAseq或蛋白质组学处理。

I.福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 切片处理

从插入物上切下膜，并将 3D 培养物放入组织学盒中，在 10% 福尔马林中放置 >24 小时，然后石蜡包埋。

J.冰冻切片
注意：当 3D 培养物在 2 M 蔗糖（在 dH 2 O 中）中孵育 > 48 小时，然后包埋在 Tissue-Tek 中并在干冰上的异戊烷中冷冻时，可以获得最佳形态。

1.从插入物上切下膜，并将 3D 培养物放入 2 M 蔗糖溶液中 >48 小时。
2.在干冰上冷冻在异戊烷中，并保持在-80°C直至切片。
注意：切成 4-6 μm的切片可获得更好的染色结果。

第二部分：二维细胞培养中的蛋白质组分析
注意：步骤 K–P，为蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学和质谱分析做好充分准备（2–3 天）

K.细胞裂解

1.在 2D 中培养 N/TERT-1 细胞，直至其达到 80% 汇合。大约需要100万个细胞。
2.μ L )裂解细胞，并将裂解物在 95 °C 下煮沸 10 分钟。
3.通过微尖探针超声处理 2 分钟，以 60% 振幅脉冲打开 1 秒，关闭 1 秒，进一步裂解。
4.使用 BCA 蛋白质测定试剂盒测量蛋白质浓度。

L.蛋白质消化
按照蛋白质聚集捕获 (PAC) 方法[13] ，使用KingFisher Flex 机器人过夜消化蛋白质提取物，适用于 96 孔板格式（图 5）。

图 5.用于蛋白质消化的KingFisher板的布局

1.将裂解物稀释至终浓度 70% ACN。
2.使用 1:2 的蛋白质/珠子比例添加磁性羟基封端珠子以进行蛋白质聚集。胺珠可以用羟基封端的珠代替。
3.用 95% ACN 洗涤蛋白质 3 次，用 70% 乙醇洗涤两次。
4.在 300 μL 50 mM ABC 中，用LysC和胰蛋白酶分别以酶/蛋白质比例 1:500 和 1:250 消化，在 37°C 下消化 12 小时。
5.用 50% TFA 将样品酸化至终浓度 1% TFA 。
6.SepPak C18 1 cc Vac 柱上的肽混合物，并用 300 μL 40% ACN洗脱，然后用 300 μL 60% ACN 洗脱。
7.SpeedVac中蒸发乙腈。
8.NanoDrop 2000 C 分光光度计上测量 280 nm 处的吸光度来估计最终肽浓度。
M.TMT标签
注意：使用TMTpro 16-plex 标记试剂标记每个样品中的肽。标记后，保留 10 µg 混合肽用于蛋白质组样品，其余用于磷酸肽富集。

1.向每个样品中添加 1 M TEAB，以达到 100 mM 的终浓度，然后添加 ACN 至 50% 的终浓度。
2.将标记的肽与 TMT 试剂在 RT 下孵育 1 小时。
3.通过添加 1% 羟胺（1:1 羟胺/TMT）在 RT 下淬灭反应 15 分钟。
4.SpeedVac蒸发乙腈。

N.磷酸肽富集

1.将 TMT 标记的肽重悬于 200 μL上样缓冲液中（图 6）。

图 6.用于磷酸肽富集的KingFisher板的布局

2.以 1:2 肽/珠子比例使用 Ti-IMAC 珠子，并在 500 μL上样缓冲液中清洗它们 5 分钟。
3.将珠子与肽一起孵育 20 分钟。
4.依次用上样缓冲液、80% ACN、1% TFA，最后用 10% ACN 和 0.2% TFA 各 2 分钟洗涤珠子。
5.在 200 μL 1% 氨水中洗脱磷酸肽10 分钟。
6.使用新的洗脱缓冲液和珠子对初始富集步骤中未结合的残留物重复富集过程。

O.微流高 pH 反相肽分级分离

1.将 TMT 标记的肽重悬于 50 mM ABC 中。
2.Chromeleon软件的UltiMate 3000 HPLC 系统上的反相Acquity CSH C18 柱对肽进行分级。
3.遵循提供的多步梯度。
4.收集并连接 12 个磷酸蛋白质组级分和 46 个蛋白质组级分，用 10% 甲酸酸化，并用SpeedVac干燥。

P.液质联用/质谱

1.具有预编程梯度的Evosep One 系统通过 LC-MS/MS 分析所有样品。
2.多发性硬化症设置：
a.喷涂电压高达 1.8 kV
b.加热毛细管温度为 275 °C
c.漏斗射频电平为 40
d.在配置文件模式下采集数据，完整 MS 质量范围设置为 350–1,400，AGC 目标为 300%
e.将 m/z 200 处的完整 MS 分辨率设置为 60,000，最大进样时间为 25 ms
f.将 HCD 碎片光谱分辨率设置为 45,000，注射时间为 86 ms ，采用 Top10 方法
g.将 AGC 目标值设置为 200%，将强度阈值设置为 2E5
h.隔离窗口设置为 0.8 m/z
i.归一化碰撞能量为 32%

数据分析

数据分析（蛋白质组学）

所有原始数据文件均使用 Proteome Discoverer 2.4 软件（由Thermo Fisher Scientific 开发）进行分析。截至 2019 年 3 月，人类SwissProt FASTA 数据库有 20,355 个条目，被用作参考蛋白质数据库。
选择胰蛋白酶作为消化酶。最多允许两次遗漏切割。 TMTpro被指定为赖氨酸和肽 N 末端的固定修饰，甲硫氨酸氧化被指定为可变修饰。此外，磷酸化被设置为磷酸蛋白质组样品中丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的可变修饰。

协议验证

器官型组织培养

使用 N/TERT-1 细胞（WT 细胞和基因工程细胞）或我们使用的任何其他角质形成细胞类型或癌细胞类型的人类皮肤器官模型非常稳健。在我们的实验室中，我们在过去的几十年里用 WT 细胞进行了 400 多个器官型培养物和 4,000 多个器官型培养物。结果随 >100 个器官型野生型细胞培养物计数的 +/- 1 个细胞层而变化。此外，3D器官模型的表型与正常人类皮肤高度相似（参见Ye等人[11] ，下图7 ）。

图 7. 正常人体皮肤与 3D 器官型皮肤培养物的比较。顶行：用分化标记物 [外皮蛋白(INV)、聚丝蛋白 ( Flg )、兜甲蛋白 (Lor)、角蛋白 10 (K10) 和角蛋白 1 (K1)] 和增殖标记物 Ki67 对人皮肤进行染色。下排：N/TERT-1 WT 器官型培养物中的相同染色。统计分析，右侧的列，使用单向方差分析，然后进行 Dunnett 多重比较检验。器官型培养物显示这些标记物的分布与正常皮肤相同，但与正常人类皮肤的波状性质相比，基底层将是直的。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.角质形成细胞和成纤维细胞的 3D 器官型培养物非常稳定且可重复。
2.该介质比从不同公司购买的预制介质便宜，尽管第一次制作所有库存解决方案有点耗时。
3.事实上，我们使用 6 孔板，可以轻松获得足够的材料用于许多不同的测定，并且也有足够的良好组织用于免疫组织化学。

故障排除

问题潜在的解决方案1潜在的解决方案2
D 点后胶原蛋白凝胶不再收缩
优质胶原蛋白和新鲜生长的成纤维细胞对于建立优质器官型培养物至关重要。在接种角质形成细胞之前，胶原凝胶可在培养箱中放置长达 7 天，从而使成纤维细胞有更多时间重组 ECM。
成纤维细胞培养时间不应超过两周，并且应处于活跃分裂状态。成纤维细胞系之间的传代次数有所不同。
角质形成细胞不形成分层
角质形成细胞培养时间不应超过三周，并且应处于活跃分裂状态。孵育期间不要摇动培养皿，尤其是在接种细胞后的前 4 小时内。当 N/TERT-1 细胞永生化时，可以使用任何传代数。提升到气液界面时不要使凝胶变干。在此步骤中也不要添加太多介质（9 mL 通常就足够了；介质不得溢出到插入物中）。
避免过于频繁地打开培养箱。根据我们的经验，在非常繁忙的培养箱（白天打开多次）中，器官型培养往往更容易失败。器官型培养物在提升后可稳定长达三周。

致谢

这项工作得到了欧盟委员会 ( GlycoSkin H2020-ERC)、欧盟委员会 ( Imgene H2O20)、Lundbeck 基金会、丹麦研究委员会（Sapere Aude 研究领导者授予 HHW）、丹麦国家研究基金会 (DNRF107)、Friis 基金会的支持(HHW AND SD)、丹麦战略研究委员会和哥本哈根大学卓越计划 (CDO2016)。我们感谢 Karin Uch Hansen、Birgit Poulsen、Karen Biré和 Louise Rosgaard Duus 提供的出色技术援助。我们承认哥本哈根大学健康与医学学院的集成显微镜核心设施。我们要感谢哈佛大学医学院的James G. Rheinwald提供 N/TERT-1 细胞。
Ye 等人描述了这项工作。 [11] 和 Dabelsteen 等人。 [2]。

利益争夺
作者与本手稿没有任何财务或非财务竞争利益。

道德考虑

本研究中使用的两种人类细胞系要么是从 ATCC 购买的，要么是由哈佛医学院James G. Rheinwald提供的，该研究所批准将其用于学术目的。

参考

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