材料与试剂

生物材料
1.果蝇，维持在 23 至 25 °C 的标准培养基上

试剂
1.二氧化碳 (CO 2 )（任何供应商）
2.二水磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 · 2H 2 O）（分析纯）（例如，国药集团化学试剂有限公司，目录号：20040718）
3.十二水合磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 · 12H 2 O）（分析纯）（例如国药集团化学试剂有限公司，目录号：10020318）
4.牛血清白蛋白（ BSA）（Sigma-Aldrich ，目录号：A9647）
5.液氮（任何供应商）
6.四氧化锇（电子显微镜科学，目录号： 19110 ）
7.戊二醛（25% 水溶液）（Electron Microscopy Sciences ，目录号：1 6220）
8.乙酸铀酰（ Polysciences ，目录号： 21447或 Electron Microscopy Sciences，目录号：22400）
9.柠檬酸铅（电子显微镜科学，目录号： 17800）
10.无水丙酮（分析级）（例如，Electron Microscopy Sciences，目录号：10015）
11.氢氧化钠（NaOH ）（Sigma-Aldrich，目录号：221465）
12.Araldite/embed-812嵌入套件（Electron Microscopy Sciences，目录号：13940），包括 embed-812、araldite、DDSA 和 DMP-30
13.特氟龙（ Miller-Stephenson Chemical Co., Inc.，美国）
14.氰基丙烯酸粘合剂（任何供应商）
15.氯仿（分析级）（例如，Electron Microscopy Sciences，目录号：12540）
16.Formvar 15/95 树脂（Electron Microscopy Sciences，目录号：15800）
17.甲醇（分析级）（例如，RHAWN，目录号：R007542-4L）
18.金胶体（ BBI Solutions ，目录号： EM.GC15 ）

解决方案

1.磷酸盐缓冲液（ 0.1 mol/L， pH 7.2）（参见食谱）
2.20% BSA 溶液（参见配方）
3.10% 四氧化锇（参见配方）
4.20% 乙酸双氧铀（参见配方）
5.冷冻替代溶液（参见食谱）
6.30%、50%、70% 甲醇水溶液（参见配方）
7.2% 乙酸双氧铀（参见配方）
8.10 mol/L NaOH（参见配方）
9.0.4% 柠檬酸铅（参见配方）
10.Araldite/embed-812 嵌入介质（参见配方）
11.1% – 3% Formvar 浇注溶液（参见配方）

食谱

1.磷酸盐缓冲液（ 0.1 mol/L， pH 7.2）
试剂最终浓度数量或体积
NaH 2 PO 4 ·2H 2 O0.437%（重量/体积）0.437克
Na 2 HPO 4 ·12H 2 O2.579%（重量/体积）2.579克
超纯水不适用100.0毫升
全部的不适用100.0毫升

2.20% BSA （重量/体积）溶液
试剂最终浓度数量或体积
牛血清白蛋白20%（重量/体积）0.2克
磷酸盐缓冲液（ 0.1 mol/L， pH 7.2）不适用0.8毫升
全部的不适用1.0毫升

3.10%四氧化锇
试剂最终浓度数量或体积
四氧化锇 10%（重量/体积）1.0毫克
无水丙酮不适用10毫升
全部的不适用10毫升
注意：四氧化锇具有剧毒且致命。在通风橱中处理并穿戴个人防护装备。

4.20%醋酸双氧铀
试剂最终浓度数量或体积
乙酸双氧铀 20%（重量/体积）0.2毫克
无水甲醇不适用1.0毫升
全部的不适用1.0毫升
注意：乙酸铀酰有毒且具有轻微放射性。在通风橱中处理并穿戴个人防护装备。

5.冷冻替代溶液
试剂最终浓度数量或体积
10%四氧化锇 1%（重量/体积）1.0毫升
20%醋酸双氧铀0.1%（重量/体积）50微升
25%戊二醛水溶液0.5%（重量/体积）200微升
超纯水4%（体积/体积）250微升
无水丙酮不适用8.5毫升
全部的不适用10毫升
注意：冷冻替代溶液含有有毒和放射性化合物。将它们放在通风橱内并穿戴个人防护装备。

6.30%、50%、70% 甲醇水溶液
分别将 30、50 和 70 mL无水乙醇加入到 70、50 和 30 mL超纯水中。然后，通过涡旋彻底混合每种甲醇水溶液。将它们在室温下放置过夜或在超声波清洗器中摇动约 10 分钟，以除去甲醇水溶液中的所有气泡。

7.2%乙酸双氧铀
注：使用 0.22 μm注射器过滤器过滤溶液或以 10,625× 离心溶液 g 10 min ，收集滤液或上清液待用。-¬
试剂最终浓度数量或体积
乙酸双氧铀 2%（重量/体积）0.2克
70% 甲醇水溶液不适用10毫升
全部的不适用10毫升

8.10摩尔/升氢氧化钠
注：将超纯水煮沸15-30 分钟，然后然后在使用前将其冷却至室温。
试剂最终浓度数量或体积
氢氧化钠 10摩尔/升4.2克
冷却开水不适用10毫升
全部的不适用10毫升

9.0.4%柠檬酸铅
注：将 0.2 g 柠檬酸铅加入到 50 mL 离心管中的 50 mL 冷却开水中。立即将管倒置数次，加入 500 μL 10 mol/L NaOH。使用前将管子在轨道摇床上摇动至少 30 分钟，并在通风橱中放置至少两天。
试剂最终浓度数量或体积
柠檬酸铅0.4%（重量/体积）0.2克
10摩尔/升氢氧化钠不适用500微升
冷却开水不适用50毫升
全部的不适用50毫升

10.Araldite/embed-812 包埋介质
试剂最终浓度数量或体积
嵌入-812不适用62.0克
爱牢达502不适用44.4克
DDSA不适用122.0克
DMP-30不适用5.5毫升
全部的不适用不适用
注意：未聚合的包埋介质有毒。将它们放在通风橱中并穿戴个人防护装备。

11.1%–3% Formvar 浇注液
试剂最终浓度数量或体积
Formvar 15/95 树脂1%–3%（重量/体积）1–3克
氯仿不适用100毫升
全部的不适用100毫升

实验室用品

1.微量离心管（ 0.2、0.5、1.5 和 2.0 mL）（例如， Eppendorf，目录号分别为： 0030124332、0030121023、0030120086 和 0030120094）
2.离心管（ 15 和 50 mL）（例如，康宁，目录号：分别为430052和430290 ）
3.培养皿（30 和 100 毫米）（例如，康宁，目录号：分别为 CLS430165 和 CLS430167）
4.2 mL 螺旋盖微管（Sarstedt AG & Co. KG，目录号：72.694.005）
5.0.22 μm注射器过滤器装置（Merck Millipore Ltd. 目录号：SLGPR33RS）
6.铝箔（任何供应商）
7.移液器吸头（0.1–20、2–200 和 50–1,000 μL ）（例如，Eppendorf，目录号分别为：0030000838、0030000870 和 0030000919）
8.纤维素毛细管（Leica Microsystems，目录号：16706869）
9.100 μm深膜载体（Leica Microsystems，目录号：16707898）
10.不锈钢手术刀片 #23（任何供应商）
11.手术刀片手柄#3（任何供应商）
12.塑料烧杯（任何供应商）
13.塑料滴管（任何供应商）
14.琥珀色玻璃瓶（任何供应商）
15.封口膜（Bemis，目录号：PM996）
16.细尖针（任何供应商）
17.载玻片（任何供应商）
18.幻灯片存储盒（任何供应商）
19.单刃剃须刀刀片（任何供应商）
20.双刃剃须刀刀片（任何供应商）
21.铜槽网格（Gilder Grids，目录号：GS2X1-C3）
22.滤纸（任何供应商）
23.圆柱形漏斗（任何供应商）
24.ACLAR ® 33C 胶片（电子显微镜科学，目录号：50425-10）
25.Kimwipes 纸巾（Kimberly-Clark，目录号：34155）
26.网格储物盒（任何供应商）

设备

1.苍蝇麻醉垫（例如，Genesee Scientific，目录号：59-114）
2.台式离心机（Beckman Coulter，型号： Microfuge®16 ）
3.超纯水净化系统（Merck Millipore，型号：Milli-Q TM Advantage A10 TM ）
4.超细瓦纳斯剪刀（World Precision Instruments，目录号： 501778 ）
5.锋利的镊子（Fine Science Tools，目录号：11251-30）
6.镊子（中精科艺科技有限公司，目录号： EZ3-SA ）
7.移液器（0.1–2.5、2–20、20–200 和 100–1,000 μL ）（例如，Eppendorf，目录号分别：3123000217、3123000292、3123000250 和 3123000268）
8.超声波清洗机（如深圳市斯威普科技有限公司，型号：SWP-DTP045）
9.轨道摇床（例如， Corning，目录号：6780-FP ）
10.分析天平（例如，梅特勒-托利多，目录号：ME104E）
11.立体镜（奥林巴斯公司，目录号：SZ61）
12.高压冷冻机（Leica Microsystems，目录号： EM HPM100或 EM PACT2）
13.自动冷冻替代装置（Leica Microsystems，目录号：EM AFS2）
14.Knifemaker（Leica Microsystems，目录号：EM KMR3）
15.超薄切片机（Leica Microsystems，目录号： EM UC7 ）
16.35°金刚石刀（硅藻，目录号：DU3530）
17.磁力搅拌器（例如， Heidolph ，目录号：MR3002 ）
18.涡旋混合器（例如 Scientific Industries，型号：Vortex-Genie2 ）
19.管左轮手枪（例如， Thermo Fisher Scientific，目录号：88881002）
20.烤箱（任何供应商）
21.流延膜装置（电子显微镜科学，目录号：71305-01）
22.网格染色基质系统（Electron Microscopy Sciences，目录号：71179-01），包括带手柄和盖子的基质体、红色染色容器和蓝色染色容器
23.FEI Tecnai F20 TEM配备 Gatan US4000 (895) CCD 相机，并由 FEI 自动断层扫描软件 Xplore 3D 控制

软件和数据集

1.TEM 用户界面软件与 TEM 成像和分析控制软件以及数字显微图像控制软件结合使用，通过 TEM 获取显微照片
2.Xp lore3D（TEM 断层扫描版本 3.0）用于自动倾斜系列采集
3.IMOD 软件包用于根据原始倾斜系列构建 3D 重建 [22]
4.Amira ZIB 2016.16 版用于追踪微管、缝合连续切片、表面分割和测量

程序

A.使用高压和冷冻置换进行样品制备

1.样本解剖
a.将所有苍蝇维持在 23–25°C 标准培养基上。
b.在苍蝇麻醉垫上用 CO 2麻醉苍蝇，并在立体镜下用超细瓦纳斯剪刀剪掉苍蝇的头部、翅膀和腿。
c.立即将剩余的苍蝇尸体浸入玻璃载玻片上的一大滴磷酸盐缓冲液中，并用锋利的镊子尖端除去鹿周围的气泡。
d.解剖磷酸盐缓冲液中的 hatere，并立即将 hatere 转移到另一张幻灯片上的新一滴磷酸盐缓冲液中。
2.高压和冷冻替代
a.将样品吸入纤维素毛细管中，用不锈钢手术刀片的背面（使用时安装在手术刀手柄上）将纤维素毛细管压在样品两侧，不损伤样品。通过这样做，会创建一个小隔间来捕获样品（图 1A）。
关键：具有疏水表面的组织与 BSA 水溶液没有很强的亲和力。因此，内径200μm的透明多孔纤维素毛细管可以作为特殊容器，帮助样品（直径小于200μm ）浸入冷冻保护剂中。

图 1. 使用高压和冷冻置换进行样品制备。 A. 将悬垂物吸入纤维素毛细管中。 B. 将样品胶囊转移到充满冷冻保护剂的膜载体的空腔中。 C. 载体组件由两个膜载体组成，样品位于其间。 D. Leica EM HPM100 高压冷冻机的侧视图。 E. 将载体组件放置在高压冷冻机中进行冷冻固定。 F. Leica EM AFS2 冷冻替代装置的侧视图。 G、将装有冷冻置换液和样品的微管放入自动冷冻置换装置中进行置换。 H. 涂有聚四氟乙烯的载玻片两侧均用封口膜条包裹。 I. 使用镊子和细尖针将样品与膜载体分离。 J. 聚合后，将样品平嵌在树脂层中。

b.沿切割线切割以产生小样品胶囊（<1.4 mm 长）以适合膜载体。
c.将 100 μm深的膜载体平坦面朝下放在滤纸上，并在载体腔中添加 20% BSA 作为冷冻保护剂。立即将样品胶囊转移到腔中并将其浸入冷冻保护剂中（图1B）。
d.将另一个载体的平坦面朝下放在第一个载体上，然后小心地向下按顶部载体以关闭载体组件（图 1C）。使用一块吸水纸小心地吸走溢出的冷冻保护剂。
关键：气泡会影响压力传输并影响冷冻质量。确保膜载体略微超载冷冻保护剂，以防止载体内出现任何空气夹杂物。
e.顶部载体就位后，立即将载体组件转移到 Leica EM HPM100 等高压冷冻机中以冷冻样品（图 1D 和 E）。
笔记：该机的操作手册提供了完整、详细的冷冻过程，这里不再赘述。使用前请务必仔细阅读操作手册并经过培训。
暂停点：冷冻样品可以在液氮中保存几个月。
f.在液氮下，将载体转移到含有 1 mL 液氮预冷冷冻替代溶液的 2 mL 螺旋盖微管（每个微管<10 个载体）中，并将微管浸入液氮中。
g.将这些微管转移到预冷（-90°C）自动冷冻替代装置（图1F和G）。
批判的：在冷冻置换过程中，冷冻置换液会随着温度的升高而膨胀。为了释放压力，请务必松开微管帽或在帽上戳一个孔。
h.每小时5 °C的速率逐渐从-90°C升温至-30°C ，在-30 °C孵育8小时，以每小时 5°C 的速率升温至 0 °C ，并在 0°C 下保持 1-6 小时。
3.渗透和平埋
a.在室温下以 1:3、1:1 和 3:1（体积/体积）的比例新鲜制备包埋介质和无水丙酮的混合物，并混合直至均匀。
b.当替换程序达到 0 °C，将微管转移到冰上。
c.样品在冰冷的无水丙酮中洗涤3 次，每次 3 分钟，并在室温下用无水丙酮洗涤3 次，每次 3 分钟。
d.洗涤后，用 1:3、1:1 和 3:1 包埋介质/丙酮混合物渗透样品，并在室温下每个步骤渗透 1 小时。
e.用纯包埋介质替换混合物并渗透过夜。
f.更换纯嵌入介质，并在室温下在管左轮手枪上再渗透 5-8 小时。
g.渗透时，准备特氟龙涂层载玻片，将载玻片浸入特氟龙溶液中几秒钟，让其在空气中干燥，并用 Kimwipe 纸巾清洁备用。
关键：一定要使用特氟隆涂层的载玻片，因为它们更容易从聚合包埋介质上断裂。
h.用一叠两条细的封口膜条包裹特氟龙涂层幻灯片的两侧，并用手指压平封口膜条（图1H）。
i.将一大滴纯包埋介质添加到特氟隆涂层载玻片的中心，并将所有载体和样品转移到立体镜下的树脂滴中。
j.用镊子牢牢夹住载体，慢慢刮擦载体腔的边缘，并使用细尖针将样品从腔中分离（图1I）。
k.取出所有空载体，并将另一张特氟龙涂层载玻片放在第一张载玻片上，并用封口膜条作为垫片。
关键：特氟隆涂层载玻片可以用 ACLAR ® 33C 薄膜代替。请注意， aclar薄膜容易弯曲并导致不均匀嵌入介质层的厚度。因此，请务必将aclar薄膜放在载玻片上以避免弯曲。
l.将夹层幻灯片转移到烤箱中，在 60°C 下聚合嵌入介质至少 48 小时。
m.聚合后，使用单刃刀片分离夹层幻灯片，并将幻灯片存放在幻灯片存储盒中（图 1J）。
暂停点：聚合后，样品在室温、无湿条件下无限期稳定。

B.串行切片

1.铸造 Formvar 涂层网格
a.配制1%–3% Formvar 浇注液。
b.用无水丙酮清洗铜槽栅并转移将这些网格转移到衬有滤纸的新 100 毫米培养皿中。让这些网格风干然后盖上盖子。
c.使用带有速度控制器的圆柱形漏斗或流延薄膜装置来流延 formvar。
d.关闭速度控制器并将铸造溶液填充到接近顶部的位置（图 2A）。

图 2. 铸造聚甲醛涂层网格。 A. 将载玻片放入几乎充满福尔玛橡胶浇铸溶液的圆柱形漏斗中。 B. 使用单刃刀片在聚甲醛薄膜涂层上形成四条切割线。 C.载玻片上的聚甲醛薄膜涂层从载玻片上脱离，然后浮到水面上。 D. 将网格放置在聚甲醛薄膜上，浅色面朝上。 E.当盖玻片浸入水中时，Formvar 薄膜连同网格粘附到盖玻片上。

e.用 Kimwipe 纸巾清洁载玻片并将其放入圆柱形漏斗内。
f.打开速度控制器，让 Formvar 浇注溶液以稳定的流量排出。
g.将载玻片留在圆柱形漏斗中几秒钟，然后风干。最后，在载玻片表面涂上一层薄薄的聚甲醛薄膜（图2B）。
关键：对于选定的圆柱形漏斗和制备的Formvar浇注溶液，排水速度越快，Formvar薄膜越厚，反之亦然。因此，我们建议调整排水速率来控制Formvar薄膜的厚度。
h.将超纯水装满一个大容器，然后将 Kimwipe 纸巾铺在水面上，然后将其拖过水面来清洁水面。
i.使用单刃刀片在 Formvar 薄膜涂层上切割平行于幻灯片四个边缘的四条线（图 2B）。
j.对着矩形吹一口气，然后将载玻片慢慢浸入超纯水中。矩形上的 Formvar 薄膜涂层从载玻片上脱落并漂浮在水面上（图 2C）。
关键：当漂浮在水面上时， Formvar 薄膜在白炽灯下显示出颜色差异。紫色、蓝色或绿色表示 Formvar 胶片太厚，会影响倾斜系列图像的对比度。银色或灰色表明聚甲醛薄膜太薄，在 TEM 下获取倾斜系列时容易破裂。为了满足成像要求，我们建议使用浅金色或深金色的Formvar薄膜涂层。
k.使用镊子将清洗后的网格放置在 Formvar 薄膜上，浅色面（粗糙面）朝上（图 2D）。
l.将干净的玻璃盖玻片或封口膜放在 Formvar 薄膜的边缘，然后将盖玻片或封口膜垂直插入水中（图 2E）。将聚甲醛薄膜连同网格粘在盖玻片或石蜡膜的表面。
m.慢慢地将盖玻片或封口膜从水中提起，并将其转移到 100 mm 培养皿中，网格覆盖的一面朝上。用盖子盖住盘子，让网格在使用前干燥。
n.在网格的外缘周围戳几个孔，然后用镊子的尖端沿着外缘小心地刮擦。最后，用镊子拿起Formvar涂层网格并将网格转移到网格存储盒中。
2.连续切片
a.从聚合嵌入介质中切下样品，并使用氰基丙烯酸粘合剂将样品块安装到空白树脂块上。
注意：连续切片技术涉及大量技巧。建议不熟悉该技术的用户与熟练的操作员合作。
b.在超薄切片机下（图 3A 和 B），使用双刃刀片将样品块粗略修剪为截头锥体（图 3C ）。

图 3. 修剪示例。 A 和 B. 超薄切片机的侧视图 (A)； (A)中的白框表示(B)中所示的放大区域。 C. 将样品块粗略地修剪成截头棱锥体。 D. 将平截头锥体精修成较小的平截头体，使其在块面表面上具有平行的顶边和底边。

c.设置段圆弧角度为0 ° ，后角为6 ° ，刀座为0 ° 。
d.使用玻璃刀从表面重复去除 200 nm 部分，使块面表面光滑。
e.使用双刃刀片将金字塔截头体精细修剪为较小的金字塔截头体（图 3D）。
关键：直截面色带非常适合拾取。因此，要确保正面的顶部和底部边缘尽可能平行，因为这是生产直截面带材的必要条件。
f.在刀座上安装35°金刚石刀，手动将刀座向北移动，直至刀刃非常接近刀座工作面。
g.仅打开超薄切片机的背光灯。
h.小心地沿东西和南北方向移动金刚石刀，并上下移动样品块，直到块表面出现反射光带（图 4A）。
i.调整刀块的角度，直到反射光带的顶部和底部边缘平行（图 4A）。

图 4. 样品块与金刚石刀对中过程示意图。 A、当样品块非常接近刀口时，在背光的照射下，样品块端面出现一条反射光带。调整刀架方向（刀相应地沿弯曲箭头指示的方向旋转），直到反射光带的顶部和底部边缘彼此完全平行。 B、当样块略高于刀口时，样块面底边与刀口之间有间隙。调整样品架的方向（样品块相应地按弯曲箭头所示的方向旋转），直到样品块表面的底边与刀刃完全平行。 C、D.将样品块移动到再次出现反射光带的位置，并调整段弧的方向（样品块相应地按曲线箭头所示方向旋转），直到反射光带保持在原位置。与样品上下移动的宽度相同。

j.将样品移至金刚石刀上方，并调整样品架的方向，直到块表面的底边与刀刃平行（图 4B）。
k.向下移动样品，直到块表面再次出现反射光带，并定位段弧，直到上下移动样品时反射光带的宽度不发生变化（图 4C 和 D）。
l.重复对齐步骤，直到块体表面及其顶部和底部边缘与金刚石刀的边缘完全平行。
m.设置切割开始和切割结束位置并打开顶灯。
n.将超纯水注入刀水箱并调节水位直至变成银色。
o.将进给设置为 300 nm，并以高切削速度（例如 20 mm/s）开始切削。
p.切割第一部分后，立即将速度降低至约 1 毫米/秒，并在整个切割过程中保持该速度。当截面带的长度适合网格槽时，停止切割并使用睫毛工具轻轻接触刀口，使截面带与刀口分离（图5A）。
关键：一旦部分丝带分离，立即开始切割下一条丝带。否则，下一条丝带的前一段或前两段将太薄或太厚。

图 5. 截面带的拾取。 A 。截面带与刀刃分离。 B.切片带浮在刀库的水面上。 C.在睫毛工具的帮助下，将一段丝带拾取到涂有聚甲醛的网格上。 D.截面带平放在涂有聚甲醛的网格上。

q.使用睫毛工具将所有丝带排列在刀库中（图 5B）。
r.将截面丝带拾取到Formvar 涂层网格上（图 5C 和 D），并将网格存放在网格存储盒中。拾取时，用镊子夹住网格条，将网格垂直浸入水中，深色面（光滑面）朝向截面色带，然后将网格移向色带或借助帮助将色带移向网格。睫毛工具的一部分。一旦截面丝带接触到网格槽中心的聚甲醛薄膜，慢慢提起网格，让截面丝带平放在网格上。
暂停点：切片在室温干燥条件下可以在网格存储盒中保存几个月。

C.重金属后染色

1.制备 30%、50% 和 70% 的甲醇水溶液，使用前加入 2% 乙酸双氧铀和 0.4% 柠檬酸铅。
2.网格加载到网格染色基质系统的基质体的孔中（每孔一个网格，最多 25 个网格）。
3.将基质体放入一个染色容器中，添加 70% 甲醇水溶液以完全覆盖所有网格几秒钟，然后用 2% 醋酸双氧铀代替，染色约 10 分钟（图 6A）。
关键：每次染色开始时，请务必在染色容器内来回移动基质体数次，以除去孔内包裹的气泡。否则会造成切片污染。

图 6. 后染色。 A 和 B. 使用网格染色基质系统进行后染色。红色和蓝色染色容器分别用于乙酸双氧铀或柠檬酸铅染色。 C. 通过将网格浸入金纳米颗粒胶体滴中，将金纳米颗粒添加到切片的两侧。

4.70%、50%、30%甲醇水溶液替换染色液进行洗涤。每个步骤洗涤3次，然后在染色容器中用超纯水洗涤3次，在塑料烧杯中再用超纯水洗涤3次。
5.将基质体转移到另一个染色容器中，并立即添加 0.4% 柠檬酸铅染色约 5 分钟（图 6B）。然后，在染色容器中用超纯水洗涤 3 次，在塑料烧杯中再用超纯水洗涤 3 次。
6.将矩阵体取出，用Kimwipe纸巾擦干，然后小心地将网格转移回网格存储盒中。
批判的：在成像前使用含可溶性重金属的负染色盐进行后染色对于显着提高图像对比度是必不可少的。
7.将 100 μL金胶体移入 0.2 mL 管中，涡旋几秒钟，在室温下以 ~295× g离心30 秒，并将上清液移入新的 30 mm 培养皿中。
8.用镊子夹住网格条，将网格浸入上清液中10-30 s（图6C），缓慢提起网格，用楔形吸水纸小心吸收残留溶液，然后将网格放回网格中储物盒。
关键：金纳米颗粒充当后续图像对齐的基准标记。在投入时间进行电子断层扫描之前，请务必在 TEM 下检查感兴趣区域中金纳米颗粒的密度和分布。我们建议染色多次，每次 10 秒，直到 40-100 个金颗粒分布在感兴趣区域的表面上。
暂停点：切片可在室温干燥条件下在网格储存盒中储存数月。

D.收购双轴倾斜系列

1.检查TEM的一般条件（图 7A）。在这里，我们仅描述使用配备 Xplore3D 的FEI Tecnai F20 TEM的采集过程。
注：协议中的倾斜系列是使用 FEI Tecnai F20 或 FEI Tecnai F30 TEM 获取的。没有此设备的实验室可以使用配备自动采集软件的现有 TEM 来实现此目的。
关键：在允许用户执行 TEM之前，需要进行显微镜培训。请联系显微镜专家进行培训或协助使用。
2.确保喷枪、色谱柱和相机的真空度合理，并且色谱柱阀门已关闭（黄色为关闭，灰色为打开）。
3.用液氮填充杜瓦瓶以冷却冷阱。
4.启动 TEM 用户界面、数字显微图像和 TEM 成像和分析软件（如果它们已关闭）。
5.确保高压已打开且高压值为 200 kV。
6.确保FEG 控制参数设置正确（例如，提取电压为 3950 V，枪透镜为 3）。
7.将网格加载到断层扫描单倾斜支架上，并将支架插入显微镜中。
关键：双轴倾斜系列是通过围绕两个近似正交的倾斜轴（分别为x 轴和ya轴）倾斜物体来收集的[22,23]。确保以恒定方向将网格加载到支架上（图 7B、C 和 D）。否则，有关拼接连续部分的数据处理将是一个问题。

图 7. 网格以恒定的方向加载在断层扫描支架上。 A. 透射电子显微镜 (TEM) 的侧视图。 B. 断层扫描支架的尖端。 C 和 D. 网格以恒定方向加载在支架上。有网格边、网格条和部分可以用作方向指示器。例如，为了获取第一个倾斜系列，将网格加载到支架上，深色面（光滑面）朝上，直杆垂直于支架的长轴（支架倾斜轴），顶部边缘面向前方的部分 (C)。顺时针旋转网格 90 °以获取第二个倾斜系列 (D)。

8.选择较低的放大倍数（例如，~2,000 × ）并设置光斑尺寸 1。
9.单击色谱柱阀门关闭按钮以打开色谱柱。光束现在应该在主屏幕上可见。调整强度以使光束散布在屏幕上。
10.扫描网格以找到感兴趣的区域，然后将光束居中。
11.转到更高的放大倍数（例如，100,000 × ）并将感兴趣的区域提高到中心高度。
12.插入选定的聚光器孔径并将其居中。
13.校正聚光镜像散，确保光束呈圆形并同心扩展。
14.对准喷枪倾斜（可选）、喷枪移位、光束倾斜 pp X/Y、光束移位和旋转中心。
15.插入选定的物镜孔径并将其居中。
16.矫正客观散光并聚焦图像。
17.返回到较低的放大倍率（例如，~2,000 × ）并将光束展开以填充屏幕。
18.将感兴趣区域居中并将样品暴露在光束中 2 分钟。
关键：在电子显微镜下观察时，塑料部分在各个维度上都会收缩。在数据采集之前，请务必使用电子束烘烤感兴趣的区域，以诱导收缩的快速阶段，以便在慢速阶段记录倾斜系列，这是 SS-ET 可以容忍的。
19.选择工作放大倍数（例如，SA 29,000 ×导致像素大小约为 1 nm）。
20.倾斜至高角度，检查在不屏蔽感兴趣区域的情况下可以使用什么倾斜范围。为了获得良好的断层扫描结果，需要±60 °的倾斜范围。
21.返回到零倾斜度并使用数码显微照片记录曝光时间为 1 秒、合并 2（图像具有 2048 × 2048 像素）和全图像帧的图像。
22.调整光束强度和散焦，直到图像具有良好的对比度和外观。最佳光束强度和散焦值将用于获取倾斜序列。
23.启动Xplore 3D软件；断层扫描任务面板出现。
批判的： Xplore 3D的应用说明为显微镜用户提供了分步指南，帮助文件提供了所有参数设置的详细说明。在这里，我们仅描述在中高放大倍率下获得良好的 TEM 倾斜系列所需的典型程序和参数。
24.在“断层扫描任务”面板中，单击“支架校准” ， “选择视图”面板将转到“支架校准数据” 。
25.“加载”按钮，将专门为塑料样品创建的选定保持校准文件从保存目录加载到系统中。
26.返回“断层扫描任务”面板，单击“采集倾斜系列”， “选择视图”面板将变为“相机采集参数” 。
27.如有必要，调整“搜索” 、 “聚焦”、 “曝光”和“跟踪”的设置。对于曝光模式，我们建议使用全图像尺寸、合并 2 和 1 秒的曝光时间。
28.按应用以激活更改并按继续按钮继续。
29.“选择视图”面板变为“倾斜系列参数” 。设置参数。一般来说，最大。负角和最大角度正角度为 -60° 和 + 60°，起始角度为 -60°。检查塑料部分的连续，它允许物体从 -60° 倾斜到 +60°。载物台松弛时间为 4-6 秒，需要在执行聚焦和曝光之前稳定样品载物台。为倾斜系列数据集选择MRC系列格式并输入系列名称；注意，第一和第二倾斜系列的名称通过将字母a或b添加到相同的通用名称来区分（例如，“*a”用于第一倾斜系列，“*b”用于第二倾斜系列）。取消选中“从Eucentric Height 开始”和“Start with AutoFocus” ，因为之前已经完成了eucentric height 和 focus。 1°倾斜步长可以获取更多图像信息以进行断层扫描重建。让软件在低倾斜角度每 4-6° 进行一次自动对焦，在高倾斜角度（50-55° 以上）每 1 度进行一次自动对焦，以拍摄聚焦良好的图像。设置Applied defocus值（例如-1 μ m ）以增强图像的对比度。检查“采集前跟踪” ，以手动将感兴趣的特征保持在整个倾斜系列的中心位置。
30.按应用激活更改，然后按继续自动获取倾斜系列。
严重：前几张高倾斜图像的质量通常很差；如有必要，请务必手动居中或聚焦感兴趣的区域。
31.等到第一个倾斜系列的获取完成。
32.进入保存目录，查看保存在后缀名为的文件中的倾斜系列。先生。另外，请保留日志文件（大小仅为几 kB），因为如果数据采集不令人满意，它们可能会在将来为您提供帮助。
33.以相同的工作放大倍率收集其他部分的第一个倾斜系列。
34.数据采集后，将放大倍数设置为最低“M”设置，将光束展开以覆盖屏幕，关闭柱阀，并将支架从显微镜中拉出。
35.将网格顺时针旋转 90°，并以相同的工作放大倍数收集每个部分的第二个倾斜系列。
36.IMOD中的Etomo程序构建双轴断层扫描重建软件包[22]。 IMOD软件包和详细的Etomo教程可以在IMOD主页下载。因此，我们不提供全面的重建教程。

E.从断层扫描重建中追踪微管

1.启动Amira ZIB 版本 2016.16 。
2.单击工作室工具栏中的“项目”按钮即可进入“项目”工作室。
3.将后缀为.rec的重建结果加载到系统中。加载数据对象后，它会在项目视图中以绿色图标表示。
4.用鼠标右键单击绿色数据图标，会出现一个弹出菜单，其中包含可用于处理此类数据的所有模块。选择切片模块以在3D 视图窗口中显示数据对象。
5.使用平滑模块软化图像对象或/并使用裁剪编辑器模块（如果需要）对其进行裁剪。
6.计算图像数据的归一化互相关。为了进行计算，将圆柱相关模块附加到图像数据，通过在属性区域中设置参数来定义微管，最后按“应用”按钮。
7.经过几个小时的计算，产生了两个对象，即“*CorrelationField.am”和“*OrientationField.am”。
8.追踪微管的中心线。要进行跟踪，请将跟踪相关线模块附加到“*CorrelationField.am”对象，然后在跟踪相关线模块的属性区域中，选择数据端口处的“*CorrelationField.am”对象和“*OrientationField.am”对象在Orientation Field端口中将两个对象连接到Trace Correlation Lines模块。
9.迹线相关线模块的属性区域中设置所有其他参数，最后按“应用”按钮继续。
10.几分钟后，生成了一个新对象“*CorrelationLines.am”，用于表示微管的中心线，并且可以使用LineRaycast显示模块。
11.切换到灯丝工作室并编辑追踪的中心线，直到它们与真实的微管完全匹配。
12.跟踪微管用于其他断层扫描重建。

F.缝合连续的断层扫描重建以形成单个更大的体积

1.在Amira ZIB 版本 2016.16中，切换到项目工作室。
2.“项目视图”区域的空白处，然后选择“创建对象” 。然后出现一个对话框；输入并在下拉菜单中选择SerialSectionStack模块。 SerialSectionStack的绿色图标出现在项目视图区域中。
3.单击SerialSectionStack模块属性区域中的添加文件，选择名为“*.rec”的断层重建及其相应的名为“*CorrelationLines.am”的微管对象，然后按“打开”按钮加载这些文件。
关键：加载后，确保断层重建与其切片顺序相同，并且这些重建结果及其相应的微管对象不发生任何变化。否则，无法执行拼接相邻断层重建的过程。
4.SerialSectionAligner模块添加到SerialSectionStack中， 3D 视图窗口分为四个面板。在右下图中，每个条代表一个断层扫描重建，蓝色和黄色条代表两个工作重建，其微管在左上和下图中显示为蓝色或黄色点，其切片与这些点一起显示，显示在右上方面板中。
5.单击右下面板中的滑动条以选择两个工作重建。
6.在左上面板中左键单击两次，左上和左下面板上会出现红色实心圆圈。
7.拖动这些红色实心圆圈，直到蓝点与黄点完美匹配。
8.在SerialSectionAligner的属性区域中检查匹配模块。
9.按住键盘上的Ctrl键，然后左键单击右上方面板中匹配的蓝色和黄色点，以连接两个微管段。
10.连接完成后，检查SerialSectionAligner模块的Properties区域中的Alignment ，并选择另外两个工作重建，按照上述相同的方式完成微管段的连接多于。
11.连接所有微管段后，按“创建”按钮。几分钟后，生成了两个对象，它们的图标出现在项目视图区域中：一个是缝合的连续重建的图像对象，另一个是连接的微管段的线对象。

G.表面分割

1.将图像对象从目录加载到Amira ZIB 版本 2016.16中。
2.转到分段工作室，项目视图区域中会创建一个名为“*labels.am”的新绿色图标。
3.缩放和数据窗口区域中的放大和缩小按钮设置适当的放大倍数。
4.使用画笔在所有切片上绘制相同结构的轮廓。如果切片之间的结构变化不大，则每隔几个切片绘制一次结构，然后单击“选择”菜单栏中的“插值”以选择标记切片之间的结构。
注：画笔是基本分割工具之一。其他分割工具也可以用于此工作。
5.选择一种材料，然后单击选择区域中的加号。现在，所有切片中选定的像素都分配给选定的Material 。当然，材料可以使用更有意义的名称或颜色。可以通过按“新建”按钮或从右键菜单添加新材质。
6.转到切片并将其他结构分配到不同的Materials中。
7.绘制完成后，将Generate Surface模块添加到Projec t工作室中的“*labal.am”对象中，然后按应用按钮。出现一个对话框；按继续。
8.几分钟后，会创建一个名为“*surf.am”的新图标，并且可以使用Surface View模块显示分割结果。
9.将Animate Ports添加到Slice或其他显示模块，并进一步将Movie Maker模块粘附到Animate Ports 。
10.项目视图区域的空白以创建相机轨道。
11.Animate Ports 、 Movie Maker和Camera-Orbit的设置以生成分割结果的影片。

H.测量

1.在Amira ZIB 版本 2016.16中，左键单击3D 视图窗口顶部的测量工具按钮，然后从下拉菜单中选择3D 长度。
注意：有多种测量工具，包括 2D 长度、2D 角度、3D 角度、3D 盒子和 3D 圆。选择哪一种取决于用户想要测量的结构。
2.左键单击对象上的一个点，然后将鼠标拖动到 3D 空间中的另一点。线的长度显示在3D 视图窗口中，并且在项目视图区域中创建一个名为“测量”的新图标。
3.测量飞行MO 的所有几何参数。这些参数可用于进一步分析。

数据分析

在该协议中，SS-ET 用于解析飞行MO 的 3D 结构。捕获双轴倾斜系列以重建断层图像（图 8A 和 B）。然后，追踪微管并将其用作基准标记以缝合 z 轴上的切片（图 8C 和 D）。最后，十个连续部分的断层图像被组合成一个更大的体积（图8E）。从侧面看，可以识别修饰后的纤毛的形态（图8F）。在改良的纤毛中，基体位于基部，纤毛从基体延伸至管状体，管状体接近球形。管状体远端上方是 MO。值得注意的是，刀切片引起的材料损失和电子辐射引起的变形虽然可以忍受，但在切片之间的连接处是可见的。从MO的横截面图中可以看出，光滑的膜、排列成两行且其间有电子致密材料的微管以及规则间隔的膜-微管连接器的高密度（图8G）。
3D 重建中的所有结构测量均在 Amira 中进行，如上所述。

协议验证

该协议已在以下已发表的文章中使用和验证：
1.宋X.等人。（2023）。 DCX-EMAP 是果蝇机械感觉细胞器超微结构的核心组织者。 J Cell Biol 222(10)：e202209116， DOI：10.1083/jcb.202209116 。
2.孙，LD等人。（2021）。 Katanin p60-like 1 塑造机械感觉纤毛的细胞骨架。 J 细胞生物学 220(1): e202004184, DOI：10.1083/jcb.202004184 。
3.孙，LD等人。（2019）。果蝇钟形机械感受器机械感受细胞器中 NompC 的超微结构组织。美国国家科学院院刊116(15)：7343–7352， DOI：10.1073/pnas.1819371116。

图 8. 使用该协议的代表性数据。 A. 不同倾斜角度的多个单独图像来自第一倾斜系列（上）和第二平铺系列（下）。比例尺：0.5 μm 。 B. 从双轴倾斜系列重建断层图。比例尺：0.5 μm 。 C. 从断层扫描重建中追踪微管。比例尺：100 nm。每个微管显示为黄色棒。 D. 使用微管作为基准标记（上）来缝合z轴上的切片（下）。比例尺：100 nm。 E. 十个连续的部分合并成一个更大的卷。比例尺：0.5 μm 。 F.从单个较大体积生成的修饰纤毛的代表性侧视图。比例尺：0.5 μm 。 G.机械感觉细胞器 ( MO) 及其内部结构的代表性横截面视图。 EDM，电子致密材料。 MMC，膜微管连接器。比例尺：100 nm。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.我们建议实施此处描述的协议的科学家应该具有 TEM 技术的广泛知识。此外，科学家应该已经熟悉准备和处理标本的操作以及 3D 断层扫描图像处理软件。
2.该协议具有最小的适应性修改，也可以应用于其他感觉过程的研究，如嗅觉、味觉、视觉等。此外，3D 结构分析有助于理解非感觉过程，如神经元细胞骨架调节、突触重塑、膜结合囊泡动力学、细胞内运输等。
3.该协议仍然是一种耗时的方法；因此，必须根据具体的生物学问题来选择技术。
故障排除（表 1）

表 1. 故障排除
问题可能的原因解决方案
无法将样品吸入纤维素毛细管具有疏水角质层的样品很容易漂浮在水溶液表面，从而导致失败。用镊子将样品压到液滴底部，并确保样品周围没有气泡。
样品变黑锇四氧化二钠在冷冻置换溶液中在室温下形成锇黑。用冰冷的无水丙酮清洗样品数次，以彻底去除固定剂。
断面带未成型，或断面带容易断成短带修剪后的样品块不满足连续切片的要求。重新修剪样品块，直到块表面的顶部和底部边缘平行。
块体表面和金刚石刀之间的对准不正确。重复对齐过程，使对齐完美。
金刚石刀被疏水性物质污染，例如手上的油。用 70% 酒精彻底清洁刀。
后染色后对比度差重金属的不同来源。选择2% 乙酸双氧铀和 0.4% 柠檬酸铅的最佳染色时间。
切片污染重金属溶液中出现沉淀。将溶液过滤或离心，收集滤液或上清液待用。

致谢

作者感谢清华大学细胞生物学实验室和电子显微镜实验室成员的技术支持。这项工作得到了国家自然科学基金（32370730、32070704和32350029）的支持。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突。

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