材料与试剂
试剂
1.氧气 (O 2 ) 气体（任何供应商）
2.分子筛（4 Å）（VWR International，目录号：215-283-8）
3.甲苯（Fisher Scientific，目录号：T290-4）
4.3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）（Sigma-Aldrich，目录号： 440167-500mL)
5.氩气（任何供应商）
6.丙酮（Fisher Scientific，目录号：A949SK-4）
7.聚（甲基丙烯酸2-羟乙酯）（ pHEMA ）（Sigma-Aldrich，目录号： P3932-25克）
8.去离子蒸馏水（Milli-Q® ）（Millipore，Sigma-Aldrich，美国）
9.乙醇（Sigma-Aldrich，目录号： 1009862500）
10.丙烯酸乙氧基乙酯（EOEA）（Sigma-Aldrich，美国，目录号：106-74-1）
11.二甲基甲酰胺（DMF）（Fisher Scientific，目录号：AA22915K7）
12.光引发剂（2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮）（DMPA）（Sigma-Aldrich，目录号： 19611-8)
13.异丙醇（Sigma-Aldrich，目录号：563935）
14.Tween ® 20（Sigma-Aldrich，目录号：9005-64-5）
15.磷酸盐缓冲溶液（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
16.台盼蓝染料（任何供应商）
17.ToxiLight TM检测（Lonza，美国，目录号：LT17-217)
18.ELISA DuoSet® （R&D Systems，美国）（ TNF-α，目录号：DY210；IL-10，目录号：DY217；TGF-β1，目录号：DY240 ； CCL-18，目录号：DY394；IL-6，目录号：DY206；IL-12，目录号：DY1270）

实验室用品
1.玻璃载玻片（25 mm × 75 mm）（VWR，目录号： 631-1553）
2.玻璃烧杯（任何供应商）
3.针（21 G，120 mm）（Fisher Scientific，目录号： 10438881）
4.针（21 G，40 mm）（ Sterican ®安全针，目录号： Z118044）
5.塑料注射器 50 mL（任何供应商）
6.结晶皿（Pyrex，容量 1,200 mL）
7.Parafilm® （Sigma-Aldrich，目录号： P7543）
8.Falcon 管 50 mL（Sigma-Aldrich，目录号：T2318）
9.聚丙烯 384 孔板（Corning，产品编号：3656）
10.玻璃巴斯德移液器（VWR，目录号：612-1702p）
11.称重船（任何供应商）
12.手套箱（MBRAUN，德国）
13.微阵列打印头 16 针（ BioDot ，美国）
14.塑料卡扣（ GraceBio -Labs，目录号： 204830）
15.用于载玻片的 4 孔矩形板（ Thermo Fisher， Nunc TM ，目录号： 267060）

设备

1.玻璃漏斗（任何供应商）
2.支撑架（A 形框架）（任何供应商）
3.实验室夹具（任何供应商）
4.电炉（任何供应商）
5.用于载玻片的不锈钢架（Sigma-Aldrich，目录号： Z710989）
6.通风柜（任何供应商）
7.等离子蚀刻机（Diener，型号：Nano LFG40）
8.真空烘箱（ Thermo Scientific，型号： Vacutherm ）
9.超声波发生器（任何供应商）
10.浸涂机（ Holmarc ，型号：HO-TH-01 浸涂机）
11.水接触角测量仪（KSV Instruments，型号：CAM 100）
12.聚丙烯移液器吸头（任何供应商）
13.移液器（任何供应商）
14.电动移液器控制器（任何供应商）
15.体重秤（0.01 g 和 0.0001 g 灵敏度）（任何供应商）
16.抹刀（任何供应商）
17.针打印工作站（ BioDot ，型号：XYZ3200）
18.微阵列陶瓷针 500 µm（ LabNEXT Inc，型号： Xtend TM ）
19.紫外线灯（365 nm，任何供应商）
20.O 2传感器（Cambridge Sensotec ，型号： rapidox 1100）
21.光学轮廓仪（KLA，型号：Zeta TM -300）
22.多孔室（16孔ProPlate® ）（ GraceBio -Labs，目录号：244864）

软件和数据集

1.生物点 AxSys TM （ BioDot ，美国）
2.MicroLab专家（美国安捷伦）
3.Spectrus处理器（ACD 实验室，美国）
4.GraphPad Prism 软件（版本 10.0.2，美国）

程序

该方法由三个关键步骤组成： O 2 等离子蚀刻、功能化工艺优化和pHEMA浸涂。如前所述 [20] 进行玻璃基板浸涂pHEMA ，并进行一些修改，如此处详述。

第一部分. 基材准备

A.O 2 等离子蚀刻

1.将传统的 25 mm × 75 mm 玻璃侧面放入等离子蚀刻室中，并将其置于 O 2等离子体（P = 300 mbar，100 W）中 10 分钟。
2.为了确认载玻片被激发离子激活，请在等离子体处理之前和之后测量水接触角 ( WCA) [21] 。图1所示为一个例子；有机污染物的存在会增加水的接触角；因此，它的去除会导致观察到的接触角减小[22,23] 。

B.功能化过程

1.硅烷化过程之前，将分子筛 (4 Å)添加到 20% w/v 的甲苯中 24 小时，以得到无水甲苯。请参阅故障排除。
2.蚀刻步骤后，立即将载玻片浸入结晶皿中的 500 mL 无水甲苯中。
3.将反应容器放在设置为 50 °C 的热板上（请参阅故障排除）。
4.将反应置于氩气氛下，将漏斗放在反应容器上方，并将氩气连接到漏斗的颈部。
5.将 10 mL 的 GPTMS 添加到无水甲苯溶液中。
6.让该反应进行 24 小时以完成。您可以使用框架支架和夹子来固定反应物和氩气。
7.将载玻片冷却至室温，并用新鲜丙酮清洗三次，以除去任何未结合硅烷的残留物。
8.将载玻片在真空 (< 50 mTorr ) 下干燥 24 小时。
9.在官能化步骤后使用 WCA 测量以确保硅烷化已完全发生。功能化载玻片变得疏水，接触角更高，为 54° ± 1.11（图 1）。测量基材上的 WCA 是量化基材润湿性及其清洁度的常用方法。

硅烷化工艺有效性的质量控制。玻璃基板的水接触角 (WCA) 测量以验证功能化。 O 2等离子体激活的载玻片显示出增加的亲水性，接触角非常低，< 10°，而硅烷化后，基材变得疏水，接触角更高，为 54° ± 1.11。

C.pHEMA浸涂

1.制备 4% (w/v) pHEMA溶液（95% v/v 在去离子蒸馏水中）。请参阅故障排除。
2.将浸涂机的设置设置为 9 毫米/秒的速度和 2 秒的浸渍持续时间，保留速度为 1 秒。
3.将载玻片夹到支架上，并将支架位置垂直调整到适当的高度。
4.将pHEMA溶液倒入 100 mL 烧杯中，并将环氧硅烷化玻璃载玻片浸入 4% pHEMA溶液中。
5.重复涂覆四次，并在两次浸渍之间留出足够的时间进行干燥（请参阅故障排除）。等待载玻片干燥时，盖上装有pHEMA的烧杯以防止蒸发。
6.在用于排列之前，将pHEMA包被的载玻片在大气条件下放置三天。
7.使用光学轮廓测定法评估玻璃基板pHEMA涂层的均匀性。图 2 说明了pHEMA涂层的阶梯高度结果的均匀性。

pHEMA涂层均匀度评估。 pHEMA涂层载玻片的光学轮廓仪图像和高度线扫描 (5 × ) 。 (A) pHEMA涂层载玻片的 2D 图像。箭头表示测量的距离；由于玻璃被镀了四次，因此玻璃基板侧面的浸渍线很明显。 (B) 表示 2D 图像 (A) 上突出显示的空间的图表，显示pHEMA涂层的均匀性，因为台阶高度变化最小。

故障排除

1.等离子处理已被证明是一种改变表面性质的简单技术，确保去除表面的杂质和有机污染物，这些杂质和有机污染物是通过弱静电/范德华力固定的[24] 。等离子体激发离子轰击载玻片表面促进羟基化（OH 基团）并生成 Si-OH 基团。
2.过量的水不利于硅烷化的程度；因此，根据溶剂的水含量按适当的比例使用分子筛至关重要[22] 。
3.将反应维持在 50 °C 对于通过破坏硅烷层中的氢键来降低弱键合硅烷分子的数量至关重要[25] 。
4.硅烷在载玻片和pHEMA涂层之间提供结合，因为 GPTMS 的甲氧基结合载玻片上的 -OH，而反应性环氧基团结合pHEMA中的 -CH [22,26] 。
5.为了加速pHEMA在目标溶剂中的溶解，在较大的容器中使用较小的量并进行超声处理是有用的。例如，在 50 mL 的 95% 乙醇/去离子蒸馏水中添加 2 g pHEMA ，盖上盖子，并将管留在超声仪中24 小时。超声波通常用于促进pHEMA粉末在乙醇中有效且快速的溶解。
6.湿的pHEMA在载玻片表面显得浑浊，并且在重复涂覆之间需要更长的时间才能干燥。
7.pHEMA溶液的密封容器非常重要，因为蒸发会导致浓度变化。因此，最好为每次包被准备新鲜的pHEMA溶液。
8.pHEMA涂覆玻璃基板可为排列不同的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯聚合物库提供固定点[ 4 , 9 ] 。由于pHEMA在大气水分存在下膨胀，它提供了在沉积的聚合物点和pHEMA之间形成互穿网络的可能性。这增加了它们在预处理洗涤步骤、灭菌过程和细胞培养条件中的稳定性。

第二部分。聚合物井的制造

A.聚合溶液的制备

1.通过吹扫方法在氩气下对单体脱气 30 分钟。
a.首先，将所需量的单体添加到闪烁玻璃瓶中，并使用橡胶塞密封瓶盖。
b.在瓶盖区域周围添加一层封口膜，以确保小瓶密封。
c.将短针（21 G，40 mm）插入盖子以启用脱气过程。
d.插入较长的针（21 G，120 mm），使氩气通过单体。确保连接到氩气源的针浸入单体中，同时脱气针远离单体。
2.称重 DMPA，并在聚丙烯或玻璃小瓶中用 DMF 配制 2% (w/v)。
3.通过在手套箱中在氩气条件下将 50%（v/v 对于液体，w/v 对于固体）单体在 DMF 和 1% DMPA 中混合来制备聚合溶液，O 2水平 < 2,000 ppm。请参阅故障排除。
4.将 40 μL每种聚合溶液转移至源板（例如 384 孔聚丙烯板）。
5.将源板放置在印刷机台上的适当位置。

B.聚合物沉积和原位紫外线固化

1.将室内打印条件设置为 O 2 < 2,000 ppm。请参阅故障排除。
2.用异丙醇清洗针并插入微阵列打印头。
3.关闭打印机室以保留打印环境设置。
4.启动软件（ BioDot AxSys TM ) 用于打印机平台和打印头。重新校准 X、Y 和 Z 定位。请参阅表 1 了解包括打印头行进速度和接触时间在内的仪器因素。

表 1. 载物台和针座移动的仪器设置
从源板加载样品
保存在单体溶液中提款速度
4秒25毫米/秒
单体溶液沉积在基材上
每次接触的总接触时间提款速度
10毫秒175毫米/秒
Z轴速度
6.531毫米/秒
真空清洗间隔
真空保存提款速度
10 秒（3 × ）175毫米/秒

5.pHEMA涂层基材上之前，在等离子蚀刻玻璃载玻片上预点四次。印迹图案可以是每个位置两个触点，以从销钉外部去除多余的聚合溶液。
6.开始打印过程。例如，对于要涂有丙烯酸酯聚合物的 7 mm × 7 mm 面积的 pHEMA 涂层载玻片，在 y 轴上打印 56 个距离为850 μm的点，并在x 轴。图 3A 说明了单个印刷聚合物点的明场图像。
7.以 40 秒长波 UV (365 nm) 间隔聚合沉积点，释放 DMPA 中的自由基离子，从而产生单体聚合。在此期间，在打印下一个聚合物之前，将针在 DMF 中清洗并干燥 3 次。
8.打印完所有聚合物后，在每个打印会话的完成点进一步添加 20 分钟的 UV 曝光。
9.在点之间进行第二次打印之前，将打印的载玻片保持在 < 50 mTorr真空中 24 小时。
10.要在聚合物点之间打印以实现完全覆盖，请将起始位置增加 800 μm 。图 3B 显示了双打印点的覆盖范围。

印刷图案的明场 (5 × ) 图像比较。 A. 单次打印的聚合物斑点。 B. 双面印刷聚合物表面。目视检查表明第二次印刷后基材覆盖率显着增强。

11.重复步骤 B6。
12.最后，将打印的载玻片在 < 50 mTorr真空中保存至少 7 天，以确保提取残留溶剂和未聚合的单体。

故障排除

1.对打印前相分离引起的潜在问题保持警惕，这些问题可能与溶剂兼容性有关。
2.使用与溶剂兼容的移液工具最大程度地减少聚合溶液中的污染。例如，使用 DMF 作为溶剂时，避免使用聚苯乙烯移液头。
3.接触印刷需要考虑许多方面，以确保聚合物区域的一致性；其中一些问题可以通过优化腔室环境（例如湿度、温度和 O 2百分比）来解决。 O 2高于2,000 ppm会抑制自由基聚合； 30%–40% 的湿度可减少打印头移动的静电效应，并引起pHEMA膨胀，从而缓解形成的聚合物点的相互渗透[9,20,27] 。
4.尽管pHEMA提供了在沉积的聚合物点之间形成互穿网络的可能性，并且被认为是一种低污染材料[28] ，但已观察到它对细胞生物学有影响[29,30] 。这可能会影响细胞对打印聚合物行为的解释，因为它会降低信噪比。这可以通过在点之间重复打印来解决。
5.在这项工作中，惰性陶瓷毛细管针用于使用接触印刷技术进行聚合物沉积。图4A是接触式打印机机械头和打印步骤的示意图。这些销钉的超光滑表面和管状结构消除了样品交叉污染，并提高了点均匀性和沉积可重复性，同时打印大型化学库[31] 。
6.通过试验点间距（参见图 4B）优化印刷图案，以实现沉积聚合物点对表面的无聚结覆盖。
7.考虑聚合溶液的挥发性来调整打印时间。
8.值得一提的是，该平台可以灵活地利用喷墨打印作为接触式打印的替代方案。概念验证试验已经成功进行，涉及光斑图案调整、电压、脉冲和均匀性。这种方法对于在敏感和/或昂贵的表面上进行打印特别有利。

图 4. 接触印刷技术和优化印刷图案的示意图。 A) 接触印刷过程： 1) 从源板上拾取聚合溶液； 2）机器人头部运动至位置坐标； 3)通过接触基材表面沉积聚合溶液； 4) 通过暴露于紫外线进行原位聚合； 5）对销钉进行清洗和吸尘，以备下一种材料。 B. 优化打印图案以解决合并问题。图像显示试验 B、C、D 和 E，并通过xy轴调整最大限度地减少聚结，从而实现均匀的薄聚合物层（点 F）。

第三部分。为每种聚合物提供有限区域

A.微室的制备

ProPlate ®可重复使用，应在每次实验前后彻底清洁，以去除任何灰尘、颗粒或污染物，遵循制造商提供的说明并总结如下：
1.® 20 添加到 PBS 中制成洗涤溶液。
2.将腔室和夹子放入干净的容器中，在清洗液中浸泡 15 分钟。
3.用去离子蒸馏水冲洗 3 次。
4.在异丙醇中浸泡过夜。
5.使用前风干。

B.泄漏评估

进行初步泄漏评估，以验证上部结构组件的完整性，确保各个井之间不存在交叉污染或泄漏。通过以交替方式向孔中添加台盼蓝染料（参见图 5）并随后将其孵育 7 天或根据实验时间线，对板在指定孔内保留样品的功效进行定性评估。

图 5. ProPlate ®泄漏评估。通过向交替的孔中添加台盼蓝染料并孵育 7 天或根据实验时间表来评估样品保留情况，以确认上层结构的完整性。

C.在打印的聚合物载玻片上组装多孔室

该平台将接触印刷微阵列技术与高通量微量滴定板处理相结合。使用多孔结构组装具有聚合物方块的载玻片，为每种聚合物提供封闭区域，每张载玻片总共 16 个。图6示意性地表示了安装多孔室的步骤。

图 6. 打印聚合物载玻片上多孔室的组装步骤。 ProPlate ®的图像改编自GraceBio实验室网站 [32]。

数据分析

MicroLab专家（美国安捷伦）获取，并通过Spectrus Processor 进行分析。通过进行细胞毒性测定间接测量活力结果，并以对照的百分比表示（在本工作中，对照是商业 TCP）。通过将来自三个独立实验的比色读数 (OD) 外推到标准曲线 ELISA 来测量细胞因子的相应浓度，每个实验有两个技术重复。对于活力和分泌组数据，使用 GraphPad Prism 软件将图表绘制为平均值和标准差 (SD)。

协议验证

通过以下方法验证了基材表面上聚合物（使用该平台制造）的存在 ATR-FTIR。通过培养两种不同的原代细胞类型并评估细胞活力和细胞因子分泌，验证了该平台对细胞培养的适用性：

1.化学表征： ATR-FTIR 光谱用于验证接触印刷和原位 UV 聚合后基材表面上特定化学成分或官能团的存在。通过以4 cm -1分辨率从600至4,000 cm -1扫描样品（254次扫描）并在每次扫描后减去背景（空气）来获得光谱。与pHEMA相比，对打印聚合物光谱的分析表明存在显着差异。具体来说， pHEMA光谱中存在的O-H拉伸（3,550–3,200 cm -1 ）不再明显，并且指纹区域（400–1,500 cm -1 ）的聚合物光谱中出现了明显的新峰。例如，ATR-FTIR 分析清楚地证实了丙烯酸乙氧基乙酯 (EOEA) 单体转化为聚合物 ( pEOEA )。在聚合物光谱中，单体特征性的 1,640 cm -1处的 C=C 拉伸峰消失，同时存在典型的丙烯酸酯聚合物峰（例如，1,720 cm -1处的 C=O 拉伸），表明成功聚合如图7A和B所示。

pHEMA和丙烯酸乙氧基乙酯 (EOEA) 单体（红色）及其相应的印刷聚合物（蓝色）的衰减全反射傅里叶变换红外光谱 (ATR-FTIR) 光谱。 A. pHEMA光谱显示 O–H 伸缩（3,550–3,200 cm -1 ）、C–H 伸缩、相应的 CH 2脂肪族伸缩振动（3,000–2,840 cm -1 ）和 C=O 伸缩（1725 cm -1 ） 1 ）。 B. 聚合物光谱中1,640 cm -1峰的消失（蓝色）表明EOEA单体中的C=C双键已经聚合，导致结构变化。 1,720 cm -1 （C=O 酯基）和 2,960/2,880 cm -1 （CH 基）处的特征峰仍然存在。此外， pHEMA结构的O-H 伸缩（3,550-3,200 cm -1 ）峰未出现在pEOEA光谱中，表明表面完全覆盖。

2.活力评估：细胞在聚合物表面孵育24小时后，使用ToxiLight TM测定法，通过测量受损细胞释放的腺苷酸激酶来评估细胞活力。为了展示该平台的适用性，测量了两种不同细胞类型的活力结果：单核细胞衍生的树突细胞 ( moDC ) 和单核细胞衍生的巨噬细胞 (MDM)。通过该平台制造的聚合物支持的细胞活力等于或高于组织培养塑料对照 (TCP)，如图 8 所示。

图 8. 可行性评估。使用微室平台与pEOEA孵育 24 小时后，检查了两种不同的原代细胞类型。图表描绘了两次独立实验的平均值±SD 结果，证明聚合物支持细胞活力。 MDM：单核细胞来源的巨噬细胞； moDC ：单核细胞衍生的树突状细胞。

3.分泌组分析：即使无法进行多重检测，使用该平台进行细胞培养后获得的上清液体积也足以测量多达七种不同的可溶性蛋白介导物并进行重复。使用高结合 384 孔板和ELISA DuoSet ®试剂盒检测上清液中的不同细胞因子和趋化因子，包括 TNF-α、IL-10、TGF-β1、CCL-18、IL-6 和 IL-12 。 moDC和 MDM的代表性示例如图 9 所示。使用该平台测量各种可溶性因子的能力可以作为所制造聚合物表面卓越完整性的令人信服的证据。事实上，这表明该系统能够有效地适应多种化学物质。

图 9.与pEOEA孵育后两种原代细胞类型的分泌组分析。热图是具有两次技术重复的三个独立实验的细胞因子 ELISA 结果的代表性平均值。 TCP、M0、M1 和 M2 是仅供比较的内部对照。 TCP：组织培养塑料控制。
数据可用性声明：支持本研究结果的数据可在诺丁汉大学数据存储库中公开获取，DOI：10.17639/nott.7362。

致谢

作者对诺丁汉大学卓越研究副校长奖学金（国际）表示感谢，并对沙特阿拉伯高等教育部卡西姆大学提供的博士奖学金表示感谢。这项工作还得到了工程和物理科学研究委员会（EPSRC）的支持（授权号：EP/X001156/1）。
作者贡献： SF 和 RAA 进行了实验并撰写了手稿。 MRA 和 AMG 监督了该项目并修改了手稿。 SF 和 RAA 对这项工作做出了同等贡献。

利益争夺

不存在利益冲突或利益竞争。

道德考虑

经伦理委员会批准 (2009/D055)，用于验证方案的单核细胞衍生细胞是从国家血液服务中心（英国谢菲尔德）提供的健康志愿者的血液样本中分离出的单核细胞产生的。

参考

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