材料与试剂
生物材料
成年（ 7–8 周龄）雌性和雄性 C57BL/6J 小鼠（杰克逊实验室，库存号：000664）

试剂

1.多聚甲醛（PFA）（Sigma，目录号：441244）
2.盐酸氯胺酮（100 mg/mL）（ Covertrus ，目录号：071069）
3.盐酸赛拉嗪 (100 mg/mL) ( Rompun )
4.白蛋白-四甲基罗丹明异硫氰酸酯牛（白蛋白-TRITC）（Sigma，目录号：A2289）
5.0.9% 等渗盐水溶液（B. Braun，目录号：R5200）
6.猪皮明胶（Sigma，目录号：G1890）
7.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Gibco，目录号：21600-044）
8.尿素（Bio-Rad，目录号：161-0731）
9.Quadrol [N,N,N',N'-四（2-羟丙基）乙二胺]（Sigma，目录号：122262）
10.Triton-X 100（Sigma，目录号：T9284）

解决方案

1.4% PFA（参见配方）
2.80 wt % Quadrol （参见配方）
3.清除溶液（参见配方）
4.凝胶灌注液（参见食谱）
5.氯胺酮/赛拉嗪混合物（参见食谱）

食谱

1.4% PFA
试剂_最终浓度数量
粉煤灰4%40克
公共广播公司1×1,000 毫升
全部的4%1,000 毫升

2.80 wt %乙二胺
试剂_最终浓度数量
奎得罗80重量%500克
水分子_不适用125克
全部的80重量%625克

3.清算方案
试剂_最终浓度数量
80 wt %乙二胺80%156克
尿素不适用125克
水分子_不适用144克
海卫一X 100不适用75克
全部的80%500克

4.凝胶灌注液
试剂_最终浓度数量
猪皮明胶2%0.1克/5毫升
白蛋白-TRITC0.05%2.5毫克/5毫升
公共广播公司1 ×5毫升/小鼠
全部的不适用不适用

5.氯胺酮/赛拉嗪麻醉剂
试剂_最终浓度数量
氯胺酮150毫克/公斤体重不适用
盐酸甲苯噻嗪15毫克/公斤体重不适用
最终的不适用

实验室用品

1.铝箔（Fisher Scientific， Fisherbrand ，目录号：01-213-100）
2.微尺（精细科学工具，目录号：30086-30）
3.凹槽滤纸圈（ Fisher Scientific， Fisherbrand ，目录号： 09-790-14D）
4.2 mL Eppendorf 管（Eppendorf，目录号：022363352）
5.50 mL 锥形离心管（VWR，目录号：89039-656）
6.100 mL 玻璃烧杯（Pyrex，Corning，目录号：1000-100）
7.玻璃盖玻片（Fisher Scientific，目录号：1254588）
8.显微镜载玻片（Fisher Scientific， Fisherbrand ，目录号：12-550-15）
9.23 G 针（BD Biosciences，目录号：305193）
10.10 mL注射器（Henry Schein，目录号：570-2620）
11.1 L 圆形介质存储瓶（Pyrex，目录号：GL45）

设备

1.真空干燥器（ Thermo Scientific，目录号：08-642-5）
2.蠕动泵（Cole-Parmer， Masterflex ，目录号：07525）
3.涡旋混合器（VWR，目录号：BV1000-GM）
4.电炉搅拌器（Benchmark Scientific，目录号：H400-HS）
5.激光扫描显微镜（尼康，型号：C2 plus）
6.解剖显微镜（Zeiss，型号： Stemi 2000，目录号：SP-STEMI2000-TS2）
7.配备 3.3 GHz CPU（Intel 或 AMD）6-8 核、32-64 GB RAM、NVIDA Quadro RTX 4000 (8 GB) 和多个快速硬盘或 (SATA) SSD 的计算机（使用Imaris软件时推荐的系统）

软件和数据集

1.Imaris显微镜图像分析软件（ Bitplane ，Oxford Instruments，v10.0，RRID：SCR_007370） https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists
2.免费替代软件：FIJI/ImageJ（NIH，RRID：SCR_002285） https://imagej.nih.gov/ij/download.html ）
3.Excel（微软， https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0hr4r ?activetab=pivot:overviewtab ）

程序

A.4% PFA 制剂

1.在化学通风橱中，将 600 mL 的 PBS 加热至 65 ° C，同时在电炉搅拌器上搅拌。
2.添加 40 g PFA 并继续搅拌约 5 分钟。
3.搅拌的同时，调低热量并逐滴添加 1 M NaOH，直至溶液澄清。
4.立即将溶液在冰上冷却约 30 分钟。
5.根据需要用 1 M HCl 缓冲溶液以获得 7.4 的 pH 值。
6.添加 PBS 至 1 L；然后，使用槽纹滤纸过滤至1L玻璃瓶中。
7.储存于 4 °C 直至准备使用。

B.清算溶液制备

注：液体按体积和重量测量。 Quadrol是一种高粘度液体；因此，使用80 wt % 的工作溶液。
1.制备 80 wt % Quadrol ：
a.将 125 克 dH 2 O 添加到 500 克Quadrol中。我们建议在制备澄清溶液期间按重量测量液体。
b.搅拌至少 30 分钟。该溶液可以在室温下保存大约六个月。
2.将 125 g 尿素与 156 g 80 wt % Quadrol在 144 g dH 2 O中混合。
a.在中低温度下使用加热搅拌器。
b.一旦溶液均匀并完全溶解，将其从火上移开并在室温下继续搅拌。
3.添加 75 g Triton X-100 并继续搅拌〜1 分钟。
4.使用真空干燥器对溶液进行脱气 ~0.1 MPa，持续 ~30 分钟或直至溶液中消除气泡。
5.在室温下避光保存最多六个月。

C.凝胶灌注液的制备

注意：以下过程每只小鼠至少需要 5 mL 的 PBS。在确定要制作的明胶量时，最好考虑大约 10%–20%，以补偿重复注射。
1.计算样品所需的无菌 PBS、明胶粉和白蛋白-TRITC 缀合物的数量。
PBS 中明胶的浓度为 2%，而白蛋白-TRITC 浓度为明胶混合物体积的 0.05%。
2.将测量的白蛋白-TRITC 储存在 2 mL Eppendorf 管中，并置于 4 ° C 冰箱直至将其添加到步骤 7 中的溶液中。
用铝箔包裹管子以保护化合物避光。
3.准备 2% 明胶混合物。
将 PBS 转移至玻璃烧杯中并开始加热直至沸腾或微沸。盖上烧杯以防止加热时液体流失。
4.添加一个小搅拌棒，并在搅拌的同时开始逐渐添加明胶粉。
5.将火调小，继续搅拌约 5 分钟或直至粉末完全溶解。
6.将明胶混合物转移至 50 mL 锥形管中，并在热水浴中使温度稳定在 45 °C。
7.从锥形管中取出 1 mL 明胶混合物，将其添加到含有步骤 2 中的白蛋白-TRITC 的 2 mL Eppendorf 管中，使用涡旋混合器混合溶液，然后将混合物转移回 50 mL 锥形管中。
8.将 50 mL 锥形管放入 45 °C 热水浴中。

D.灌注和血管标记

1.称重小鼠并腹膜内给予氯胺酮（150毫克/千克体重）和赛拉嗪（15毫克/千克体重）混合物（参见食谱）。使用脚趾捏反射确定动物是否被深度麻醉。
a.为每只成年小鼠准备 30 mL 的 1× PBS 和 100 mL PBS 中的 4% PFA（参见食谱）用于灌注，倒入玻璃烧杯中，并连接到泵（图 1A）。用 1× PBS 预填充管并除去任何气泡。
b.将鼠标放在解剖板上，并使用小销钉固定四肢（图 1A）。找到胸腔边缘并在腹腔中做一个小切口。在不损坏心脏的情况下，沿肋骨两侧切割打开胸腔。
c.将连接到 1× PBS 的 23 G 针插入左心室（图 1B 和 1C），在右心房做一个小切口，并开始以 10 mL/min 的速率灌注 3 分钟，以清除血液的脉管系统和红细胞。
关键：小心不要刺穿隔膜，因为这会导致灌注不良/无灌注和脉管系统标记。另外，在打开泵之前一定要切开右心房，以防止毛细血管塌陷或损坏。
d.用 PBS 冲洗后，暂停蠕动泵并将管道转移到冰冷的 4% PFA 中。以 10 mL/min 的速率恢复灌注 10 分钟。暂停可防止气泡进入管内。如果操作正确，注射固定剂（4% PFA）几分钟后，主体会变硬。

图 1. 小鼠灌注和凝胶灌注液注射。 (A) 灌注装置和深度麻醉成人的代表性图像鼠标固定在解剖板上。 (B) 小鼠心脏示意图。将注射器针头插入左心室（箭头）。在右心房做一个小切口后，打开蠕动泵并开始小鼠灌注。 (C) 如何将注射器针头插入成年小鼠左心室的代表性图像。右图：虚线所示区域的更高放大倍数。 (D) 在注射凝胶灌注液期间如何插入注射器针头的代表性图像。

2.当接近 8-9 分钟时，从热水浴中取出荧光凝胶灌注液。
将 5 mL 吸入 10 mL 注射器中，并将荧光凝胶灌注液放回水浴中。
3.10 分钟后，停止泵并快速将针从心脏中取出。使用 23 G 针，在 30 秒内将 5 mL 的荧光凝胶灌注液缓慢注入左心室（使用与之前相同的开口），以匹配固定灌注的速率（图 1D）。
完成后立即用止血钳夹住右心房。
4.将鼠标从解剖板上取出，并将其放在冰上 30 分钟，以进行凝胶聚合。
注意：在冰上放置塑料或疏水性覆盖物，以免鼠标被弄湿。
5.小心地取下止血夹并准备解剖。
4 °C下将动物后固定在约 50 mL 4% PFA 中可能有用过夜，具体取决于感兴趣的组织和固定质量。

E.组织分离和光学透明

1.开始解剖必要的组织。
在清除组织之前预先确定感兴趣区域。清除图像采集过程中可能遮挡视图的任何碎片，因为组织清理后很难看到。
注意：样品可以保存在 4 °C 的 1× PBS 中，直到需要清除为止。一旦样品已清除，请勿将其浸入其他液体中。这将改变组织内的折射率并妨碍最佳成像。
2.将样品放入适当体积的澄清溶液中（参见配方）并根据表 1 在 37 °C 下孵育。

表 1. 组织透明化（源自成年小鼠的神经元和非神经元组织）
组织孵化时间溶液体积
脑7天3.0毫升
脊髓24小时1.0毫升
背根神经节24小时0.5毫升
视神经和视交叉24小时0.5毫升
面神经24小时0.5毫升
坐骨神经24小时0.5毫升
肾上腺24小时1.0毫升
心48小时1.0毫升
肾48小时1.0毫升
肠子48小时1.0毫升
肌肉48小时1.0毫升

F.样品安装和三维成像

1.轻轻地从澄清溶液中取出样品并将其放在显微镜载玻片上（图 2）。如果使用配备传统光学器件且工作距离 < 4 毫米的共焦显微镜，则对厚组织样本（例如成年小鼠大脑）进行成像将需要切割一部分组织（2-3 毫米厚）。
将两块 Blu-Tack 卷成圆柱体。圆柱体应长约 2-3 厘米，并且比样品稍厚。

图 2. 使用直立式激光扫描显微镜进行三维成像的组织样本安装。透明的小鼠脊髓的代表性图像安装在显微镜载玻片上，并覆盖有由两块建模粘土固定到位的玻璃盖玻片（R：头端，C：尾端）。

2.将圆柱体安装在载玻片边缘附近，与载玻片的长轴平行（图 2）。
3.将组织样本放置在载玻片中间，与 Blue-Tack 圆柱体平行。
确保样品正确对齐，特别是当样品在成像时需要使用平铺功能时。
4.将一小滴澄清溶液 (~50 µL) 滴到样品上。确保溶液不接触腻子。
5.将玻璃盖玻片（厚度：1 号）放在样品顶部，并在腻子顶部轻轻施加压力。
按压时，确保压力足够大，以便在样品周围形成一个小池，并且盖玻片充分固定到位。注意不要过度压缩样品，因为这会在成像过程中使样品变形。
6.将样品放置在显微镜下，并使用低放大倍率、长工作距离物镜定位感兴趣区域。如有必要，切换到更高放大倍率的物镜（例如，20×，工作距离至少为 1 mm，数值孔径高）并选择成像区域。
7.使用 544 nm 的激发波长和 570 nm 的发射波长对充满白蛋白 TRITC 的血管网络进行成像（图 3 和 4）。 TRITC 是一种亮橙色荧光染料，最大激发波长为 557 nm。
关键：请务必检查激光扫描显微镜的规格，以确定 557 nm 激发最大值是否远离您的激光线。或者，考虑使用白蛋白-FITC（激发峰 490 nm）代替白蛋白-TRITC。

图 3. 脉管系统追踪、组织透明化和三维成像可实现神经组织中脉管系统网络的可视化。 (A) 透明化前后整个器官和神经元组织样本的代表性图像。比例尺：2 毫米。小鼠内白蛋白-TRITC 填充的脉管系统网络的代表性荧光图像（最大强度投影）（B）体感皮层，（C）脊髓（低胸腰段），（D）腰背根神经节（DRG），（E） ) 面神经，(F) 坐骨神经，(G) 视神经和视交叉。所有图像均使用配备长工作距离空气物镜的传统激光扫描共焦显微镜获取（放大倍数：10×；工作距离：4 mm；数值孔径：0.45）。比例尺：200 µm。

图 4. 脉管系统追踪、组织透明化和三维成像可实现非神经元组织中脉管系统网络的可视化。 (A) 清除整个器官和非神经元组织样本图像之前和之后。比例尺：2 毫米。小鼠 (B) 肾脏、(C) 肾上腺、(D) 后肢肌肉（腓肠肌）、(E) 心脏和 (F) 肠道内充满白蛋白 TRITC 的脉管系统网络的代表性荧光图像（最大强度投影）十二指肠）。所有图像均使用配备长工作距离空气物镜的传统激光扫描共焦显微镜获取（放大倍数：10×；工作距离：4 mm；数值孔径：0.45）。比例尺：200 µm。

8.帧扫描模式并将图像尺寸设置为 1,024 × 1,024 像素。调整激光速度、激光功率和增益以获得高质量、高对比度和低背景的图像。如有必要，使用范围指示器调整采集参数并避免像素饱和。将线路平均调整为 2 以减少背景噪音。
9.选择 z 轴上的成像深度（< 1.5–2 mm，具体取决于感兴趣的组织）并相应地调整步长。使用 10× 物镜时，z 步长应为 4–5 µm。

G.三维重建与分析

1.打开Imaris并选择Surpass >文件>打开以导入所需的文件。文件也可以拖放到 Arena 界面中。
a.选择Arena >观察文件夹，让软件识别文件夹。
b.将文件转换为 .双击文件即可打开ims 。
注意：这是一个非破坏性过程，将创建原始文件的副本。
2.选择“超越”以查看文件的三维视图。
3.“编辑” > “3D 裁剪”来裁剪文件。
a.确定样品的感兴趣区域 (ROI)，并将 ROI 框拖到该位置上。可以通过拖动框的角或输入尺寸来更改尺寸，如下所述。
b.Size的下拉框中输入所需的 x、y 和 z 平面尺寸。
c.可以通过左键单击并拖动框来移动 ROI，同时仍保持指定的尺寸。
4.单击蓝色球状按钮（左起第四个）开始曲面创建。
a.“创建/魔杖”按钮（左数第二个）打开表面向导（图 5A）。无需在第一个窗口中选择任何选项。
b.源通道窗口选择脉管系统通道（图 5A）。
c.选择背景扣除并将最大球体的直径调整为图像中找到的最大直径血管。
d.要测量血管的直径，请选择窗口顶部的“切片”按钮（位于 3D 视图的右侧）。
e.左键单击最大容器的每一侧以测量两点之间的距离。可以在右侧停靠窗口的“距离”下找到测量值。
f.通过拖动背景扣除阈值窗口内的条来调整阈值，直到脉管系统源信号被表面充分覆盖。该表面代表新掩模的体积。
注意：较大和较小的血管之间需要妥协，因为较小的血管可能会充血。确保准确地表示所需的脉管系统和连续血管。
g.根据需要调整过滤器以减少背景标签。通过单击下拉菜单，可以根据体积、大小或其他参数过滤表面。
h.允许表面渲染，然后遮盖脉管系统通道上的表面。
i.选择铅笔图标（左起第四个）并选择全部屏蔽...。
j.选择脉管系统的源通道，然后单击“确定” 。这将创建一个新的脉管系统通道，仅包含表面内所占据的部分。显示调整窗口中现在将有两个通道。

图5 .伊万里斯管道用于未切片器官和组织标本中脉管网络的卷积重建和分析。 (A) 小鼠脊髓的感兴趣区域 (ROI) 选择和Imaris内的三维裁剪。 (B) Imaris中的表面渲染（遮罩）步骤。 (C) 细丝追踪机器学习步骤，显示脊髓毛细血管网络的预测效果。 (D) 完成了毛细管网络的三维渲染以及导出对象统计数据和批处理文件的步骤。 (E) 导出统计数据并编辑批处理文件以进行多图像批处理。

5.选择叶子图标（左起第六个）开始细丝追踪（图 5B）。
a.选择自动路径（循环），无体细胞，无脊椎（图 5B）。
b.如步骤 4b 和 4c 中所述测量切片视图内源通道的直径。
c.将源通道设置为新创建的屏蔽脉管系统通道。
d.选择多尺度播种点并使用切片视图输入最大和最小容器的近似直径进行测量（图 5B）。
e.调整种子点阈值，使种子点填充所需容器的中线，并减少空体积内的种子点。
注意：进入切片器视图可能有助于检查种子点放置的准确性。
f.可能需要通过 Ctrl + 左键单击手动添加或删除种子点。
g.根据种子点的填充方式和容器标签的匹配情况，将种子点分类为“保留”或“丢弃” 。使用右侧停靠窗口上的圆选择工具快速选择种子点组并对其进行分类。
注意：要保留选定的点，请按K；要丢弃它们，请按 D（图 5B）。
h.Cmd + 滚动鼠标来调整圆圈选择工具的大小。
i.要选择多个点，请按住 Ctrl/ Cmd + 左键单击/拖动到要选择的点上。对足够的种子点进行分类后，选择训练和预测以开始训练机器学习算法。
注意：我们发现每个类别中至少 50 个分类点就足够了，尽管这会根据图像内的信噪比而有所不同。
6.将骨架片段分类为“保留”或“丢弃” ，如先前步骤 5f-g 中所述。
注意：该算法倾向于桥接邻近的并行结构。检查高密度区域并根据需要对其进行分类。 “最大间隙长度”选项也有助于缓解此问题。
7.过滤灯丝段以纠正步骤 5e 中所述的错误（图 5C）。我们发现，过滤掉长度小于 2-4 µm 的片段有助于纠正桥接错误；但是，这会因图像而异。
8.使用特定于生成的文件和表面或灯丝的唯一标识符来识别将使用统计数据导出的每个层（表面或灯丝）。
重要：创建的曲面的默认名称是“Surface 1”。将其重命名为每个表面或灯丝的唯一 ID。如果不完成此步骤，则无法导出多个图像的统计信息。
9.批处理（可选）（图 5C）：
a.要在 Surpass 中保存新算法参数，请在“场景”文件夹下选择所需的表面或灯丝渲染。
注意：批处理的算法参数应针对每个渲染单独命名、保存和运行，例如，将表面创建参数保存为与灯丝跟踪参数分开的批处理文件，然后在所需文件上顺序运行批处理。
b.选择“创建” （棒）按钮，然后选择“存储批处理参数” 。这将在与包含算法的图像相同的文件夹中创建一个批处理文件。
c.在Arena中，确保该文件夹仅包含用于批处理的适当批处理文件和图像文件。右键单击批处理文件并选择“运行” 。
d.要在 Arena 中创建新算法，请选择“批处理”以打开算法向导。
e.从左上方面板中选择表面或细丝。
f.将图像文件拖放到打开的算法向导管道中并开始训练。
注意：训练批处理算法时，请确保通道和任何屏蔽通道与训练文件相同。
g.要将编辑保存到算法向导，请单击保存图标（软盘）。
严重：在向导中所做的编辑不会自动保存。如果在保存更改之前启动批处理，则算法向导将使用自上次保存以来创建的批处理文件，而不是自上次编辑以来创建的批处理文件。
10.通过 Arena 界面导出统计数据。
a.选择要分析的所有图像，然后选择窗口顶部附近的“新绘图” （图 5D）。每个具有唯一名称的渲染将显示在此处。
b.确保仅从列表中选择带有统计信息的导出渲染（图 5D）。
c.通过选择下拉菜单并滚动到所需的统计信息来更改显示的统计信息。
注意：由于存在循环结构，分支层次结构不是一个选项。
11.选择保存图标（软盘）将统计数据导出为 . xls文件（图 5E）。

H.未切片器官和组织标本中脉管系统网络的重建和分析（可选）

注意：开始之前必须下载并安装 FIJI/ImageJ 的 SNT 插件通过以下链接： https: //imagej.net/update-sites/neuroanatomy 。

1.打开 FIJI/ImageJ 并选择文件>打开（图 6A）。选择要分析的图像。
可选：如果源信号不是白色，请通过选择图像 > 调整 > 阈值将信号转换为二进制。
使用箭头按钮或手动，在右侧输入一个值并调整顶部（最小）阈值栏以找到可接受的水平（图 6B）。我们发现大约 80–110 (2.8%–3.6%) 的值有效，尽管该值因图像而异。

图 6. 斐济重建管道以及未切片器官和组织标本中脉管系统网络的分析。 (A) 将 3D 文件导入 FIJI。 (B) 调整二进制阈值以改进可视化和跟踪。 (C) 设置 ROI 并在 x 和 y 维度上裁剪文件。 (D) 在 z 维度上裁剪图像。 (E) 追踪血管信号并添加分支点，描绘叉点功能。 (F) 分析感兴趣的脉管系统和导出统计数据。

2.文件下的矩形工具确定图像内的 ROI （图 6C）。然后，单击鼠标左键并拖动到所需的大小。
编辑>选择>指定手动输入尺寸参数来精确更改 ROI （图 6C）。
3.选择“分析” > “工具” > “ROI 管理器”以保存当前的 ROI 选择。
4.“图像” > “裁剪”裁剪当前图像选择。
a.要在 z 维度上裁剪文件，请选择“图像” > “Hyperstacks” > “制作子集...” 。
b.输入将跟踪的堆栈范围（图 6D）。请注意，z 维度上的该距离将与成像时选择的步长相关。（例如，将步长为 4 µm 的图像裁剪为 50 个堆栈后，z 维度为 200 µm）。
5.选择插件>神经解剖学> SNT以开始追踪脉管系统。
Image 的下拉菜单下选择当前图像。
6.左键单击图像开始追踪脉管系统。首先从直径较大的血管开始，以跟踪痕迹和分支可能会有所帮助。
a.选择两个点后，单击Y保留或N放弃。
b.重复此过程，直到到达信号末尾。
7.完成路径后，按F保存并将其添加到路径管理器中。
8.按 Alt + 左键单击根据需要添加分支（图 6E）。通过将光标悬停在路径上并按G确保选择分支将要脱落的路径。所选路径将为绿色。
9.“分析” > “测量” > “测量路径”，通过“路径管理器”窗口导出统计数据（图 6F）。
10.从新窗口中，选择长度和分支点数量（图 6F）。
11.新窗口将提供指定的参数。突出显示这些值，复制它们，并将其粘贴到 Excel 电子表格中。

数据分析

我们的协议的实用性和可扩展性提供了生物医学各个领域的应用。整个过程可以由有能力的研究生或实验室技术人员来完成。应使用功效分析和历史实验室数据来估计群体规模。根据我们的经验，6-7 次生物学重复将产生可靠且可重复的结果。排除标准的例子包括小鼠灌注不良、脉管系统追踪不一致、解剖过程中的组织损伤或过度光漂白。值得注意的是，使用Imaris和 ImageJ对脉管系统网络进行三维重建和分析产生了类似的结果（表 2）。 ImageJ 与Imaris相比的一个主要限制是，处理相同 ROI 进行三维重建需要更长的时间。使用 Prism（版本 10.0.1，GraphPad）通过 Mann-Whitney 测试对白蛋白 TRITC 填充的脉管系统（ Imaris管道）进行统计分析（图 7B）。也可以使用其他统计分析软件（例如 SPSS、R 或 MATLAB）。对于进行的所有分析，显着性定义为 p < 0.05。生物重复的确切值和测量的定义显示在相应的图例中。实验数据的评估不受条件限制。

桌子。 2 Imaris与 FIJI 比较
伊马里斯斐济
分支点数7852
总长度（微米）5,7785,642

使用Imaris与 FIJI 进行血管追踪和分析的比较，使用相同的 ROI 对小鼠脊髓样本进行分析。

协议验证

为了验证我们协议的稳健性和可重复性，我们将经验丰富的用户（> 20年的研究经验）获得的结果与非经验用户（例如，没有小鼠灌注经验的一年级研究生）的结果进行了比较、组织透明化、三维成像和分析）。我们的分析证明了用户之间结果一致且可重复（图 7）。此外，该协议已在之前的出版物中采用（Tedeschi 等人，2022），该出版物利用血管追踪方法来评估成年小鼠中风后毛细血管网络的变化。之前的一项研究也描述了类似的方案（Di Giovanna 等人，2018）。组织透明化方法适应性强且可重复性高（Ueda et al., 2020）。我们在这里使用的清除协议基于先进的 CUBIC 协议，用于全脑和全身清除和成像（ Susaki et al., 2015）。

图 7. 通过比较有或没有研究经验的用户的结果，评估我们的脉管系统追踪、成像和分析流程的稳健性和可重复性。 (A) 成年小鼠脊髓中充满白蛋白 TRITC 的脉管系统网络的代表性荧光图像。感兴趣区域（ROI）被描述为最大强度投影和三维渲染（ Imaris ）。比例尺：200 µm。数据由经验丰富的用户（> 20 年研究经验）和非经验用户（例如，没有小鼠灌注、组织透明化、三维成像和分析经验的一年级研究生）生成。 (B) (A) 的量化。平均值和 SEM（Mann-Whitney 检验，ns：不显着；n = 6 个生物重复/用户）。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

尽管选择每个组件是为了实现最佳图像质量和精确量化，但可以进行修改以扩展该协议的实用性。可以调整预缀合荧光团的选择，以避免在 IHC 或遗传报告基因等其他标记策略的情况下出现光谱重叠。选择荧光团时，要考虑的关键分子特性是激发和发射光谱、量子产率和荧光寿命。检查激光扫描显微镜的细节，并确认所选荧光团的最大激发波长在成像系统接受的范围内。我们选择的荧光团 TRITC 具有相对较高的量子产率和荧光寿命，而其激发光谱响应红移光，峰值位于 544 nm。该组件至关重要，因为较长的波长在厚样品中不太可能衰减，从而提供改进的信噪比和更深的样品成像（Belov 等人，2010 年； Im等人，2019 年）。可以调整光学透明方法以提高特定组织成分的透明度。决定使用水基还是有机溶剂基的透明方法主要取决于组织厚度和成分，尽管某些透明方法可能会损坏荧光团，应仔细评估。此外，组织清除的这两种分类有几种不同的方案，可以根据当前的研究问题进行定制。成像提供了多种合适的显微镜策略，包括 1P 和 2P 激光扫描以及光片荧光显微镜（Hilton 等人，2019 年；Tedeschi 等人，2016 年和 2022 年；Wang 等人，2018 年）。最后，可以使用Imaris或 ImageJ完成三维重建。请注意，ImageJ 的优点是它是一款免费的开源软件，并且计算要求较低。这可以用于密度较低的血管网络，例如周围神经（例如面部或坐骨神经）中的血管网络。
该协议的进一步改编允许研究中枢神经系统损伤（例如中风、创伤性脑和脊髓损伤）或疾病（例如阿尔茨海默氏病、多发性硬化症）中的血脑屏障/血脊髓屏障（BBB/BSCB）完整性。硬化等）模型。为了追踪血管，我们利用了 67 kDa白蛋白-荧光团缀合物 2% 明胶混合物。在此分子量下，缀合物不能从完整的毛细血管中漏出，但可以通过调整明胶的浓度来识别受损的屏障区域。将明胶的百分比减少到大约 0.5% 将降低粘度，使白蛋白-TRITC 能够通过受损区域泄漏，并说明体内 BBB/BSCB 损伤的程度。虽然其他血管追踪方法可以做到这一点，但我们的管道具有定量评估其他毛细管网络特征的并发变化的优势，这些变化可能伴随着屏障完整性的丧失。

故障排除

表 3. 故障排除
观察到的问题可能的原因解决方案
图像采集过程中荧光不良、不均匀或缺失灌注欠佳或荧光团在制备过程中受损•确保针不会刺穿左心房壁。
•调整针头，防止固定剂进入肺循环并从鼻或口排出。
•在重悬白蛋白-TRITC 之前，确保明胶温度稳定在 45 °C 。
图像采集过程中背景/噪声较高澄清孵育时间太短、样品太厚或样品的澄清方法不当•增加澄清孵化时间。
•考虑组织成分和大小，确定更适合的清除方法。
Imaris未在 Arena 中显示文件缓存过载•保存工作并重新启动Imaris 。
Imaris经常崩溃/无响应文件太大或电脑规格不够•减少投资回报率维度。
•通过管道运行较小的数据集。
•如果不需要对象到对象的统计，请在创建算法时取消选中该框。
FIJI/ImageJ 跟踪期间无法连接信号间隙启用光标自动捕捉•在 SNT 快照窗口中，取消选中启用捕捉范围：XY 。

致谢
感谢孙文静博士的批判性阅读和实验室全体成员的讨论。这项工作得到了国家神经疾病研究所的支持（拨款 R01NS110681）。

利益争夺

所有作者均声明不存在竞争利益。

道德考虑

上述方法和实验程序旨在限制可能影响结果解释的动物的不适和痛苦。所有实验均按照俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会批准的方案（方案＃2017A00000027-R2）进行，并遵守公认的道德最佳实践。

参考

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