材料与试剂
1.果蝇[ Oregon K ( OK) 果蝇，购自印度迈索尔迈索尔大学国家果蝇库存中心，在含有蔗糖、酵母、琼脂和丙酸的食品培养基中饲养，并维持在果蝇环境室中并在当前的研究中使用[3,10,13,28]]。根据实验的性质，可以使用接受和/或不接受神经毒剂治疗的果蝇（散发性PD模型）和转基因果蝇模型。
2.灭菌的1.5 mL 离心管（ Tarsons ，目录号：500010）
3.Parafilm TM包装膜（Bemis，目录号：PM996）
4.锥形瓶（ Borosil ，目录号：5100）
5.磁力搅拌棒 #8 mm × 40 mm（ Tarsons ，目录号：4113）
6.SPINNOT TM数字磁力搅拌器加热板（ Tarsons ，目录号：6090）
7.消毒微吸头（ Tarsons ，目录号：521010）
8.Freshwrapp铝箔 9–11 μm （Hindalco，目录号： HV2241 ）
9.玻璃板（ Suwimut ，目录号：B08FRB2NTM）
10.指甲油（ FacesCanada ，目录号：CC4403）
11.玻璃垫片（ Borosil ，目录号：9115S01）
12.显微镜载玻片 #76 mm × 26 mm（ ReliGlas ，目录号：7101）
13.金密封盖玻片（22 mm 2 ）（电子显微镜科学，目录号：63765-01）
14.蔗糖（SRL，目录号：84973）
15.琼脂（ HiMedia ，目录号：GRM666）
16.耐糖酵母（Angel，目录号：5331A201908）
17.丙酸（默克，目录号：80060505001730）
18.Whatman TM滤纸（GE Healthcare，目录号：1001917）
19.多聚甲醛（PFA） pH 7.4 （Sigma-Aldrich，目录号：I58127）
20.磷酸盐缓冲盐水（PBS） pH 7.4 （ HiMedia ，目录号：ML023）
21.Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
22.正常山羊血清（NGS）（Vector Labs，目录号：S1000）
23.兔抗酪氨酸羟化酶（抗TH）多克隆初级抗体（Millipore，目录号：Ab152）
24.山羊抗兔 IgG H&L（TRITC 标记）多克隆二抗（ Abcam，目录号： Ab6718）
25.VECTASHIELD ®封固剂（Vector Labs，目录号：H1000）

解决方案

1.4% PFA 溶液 (50 mL)（参见配方）
2.0.1% PBST（磷酸盐缓冲盐水和 Triton X-100）（50 mL）（参见配方）
3.0.5% PBST (50 mL) （参见配方）
4.5% NGS 封闭缓冲液 (1 mL) （参见配方）
5.抗 TH 多克隆一抗溶液（参见配方）
6.TRITC 标记的多克隆二抗抗体溶液（参见配方）

食谱

1.4% PFA 溶液 (50 mL)
PFA 2克
1× PBS 50 mL
a.在锥形瓶中加入含 1× PBS 的 PFA，用封口膜覆盖，充分摇匀 10 分钟。
b.磁力搅拌器的烧瓶转移到电炉上用于加热/煮沸，温度范围为 80 °C 至 110 °C，并以 150 rpm 的速度适度搅拌。
c.将烧瓶放在电炉上，直到混浊溶液变得透明。
d.此后，关闭电炉，但保持搅拌 15 分钟。让溶液冷却，将其等分到 1.5 mL 离心管中，并储存在 -80 °C。
重要提示：溶液存放时间不要超过一周。
注意： PFA 是一种潜在的致癌物质；因此，整个过程应在通风橱下进行。在处理和制备 PFA 溶液时，请戴上手套并穿上实验室外套。

2.0.1% PBST（磷酸盐缓冲盐水和 Triton X-100）（50 mL）
10× PBS 5 mL
高压灭菌无酶水 45 mL
Triton X-100 50 μL
a.在 45 mL 高压灭菌的无酶水中添加 5 mL 10× PBS。
b.混合 50 μL Triton X-100 并涡旋 10 秒。该溶液在室温下可保存1周。

3.0.5% PBST (50 毫升)
10× PBS 5 mL
高压灭菌无酶水 45 mL
Triton X-100 250 μL
a.在 45 mL 高压灭菌的无酶水中添加 5 mL 10× PBS。
b.混合 250 μL Triton X-100 并涡旋 10 秒。该溶液在室温下可保存1周。

4.5% NGS 封闭缓冲液 (1 mL)
NGS 50 μL
0.5% PBST 950 μL
μL 0.5% PBST 中添加 50 μL NGS ，并通过涡旋10 s适当混合。该溶液可在室温下保存1-2小时。

5.抗TH多克隆一抗溶液
抗 TH 多克隆一抗 5 μL
5% NGS 封闭缓冲液 1,245 μL
取 1,245 μL 5% NGS 封闭缓冲液，添加 5 μL抗 TH 多克隆一抗（1:250 稀释）。缓慢翻转管子，轻轻混合，然后将其放在冰上直至使用。

6.TRITC 标记的多克隆二抗溶液
TRITC 标记的多克隆二抗 5 μL
5% NGS 封闭缓冲液 1,245 μL
取 1,245 μL 5% NGS，加入 5 μL TRITC 标记的多克隆二级抗体（1:250 稀释）。缓慢翻转管子轻轻混合，并将其储存在冰上直至使用。

设备

1.飞头胶囊处理物品，例如针 #31 G × 6 mm（ Tentabe BD，目录号：324902）
2.解剖细钳（EMS，目录号：78620-4B）
3.刷子（TEYUP，型号：SR-1013）
4.精致任务 Kim 雨刷（KIMTECH TM ，目录号：370080）
5.微量移液器，即1,000 μL 、50 μL 、10 μL 、2 μL （Gilson，目录号：30040）
6.无霜冰箱（惠而浦，型号：FF26 4S）
7.pH/mV计（Hanna Instruments，型号：HI2211-02）
8.-20 °C ES系列冰箱（ Thermo Scientific，型号：50616100444443250）
9.-80℃超低温冷冻柜（新不伦瑞克省Innova ，型号：U101-86）
10.立体变焦显微镜（ Carl Zeiss，型号： Stemi 305）
11.体视变倍显微镜（徕卡，型号：E24）
12.通风柜（BIOMATRIX，Telangana，印度）
13.BOD培养箱（Percival，型号：DR-36VL）
14.试管旋转器（ Tarsons ， Rotospin ，目录号：3070）和用于 24 × 1.5 mL 管的盘（ Tarsons ，目录号：3071）
15.Axio Imager M2 荧光显微镜配有 100 W 汞灯（Carl Zeiss，目录号：430004-9902-000）
16.AxioCam ICm1 单色相机（Carl Zeiss，目录号：426553-9901-000）

软件和数据集

1.ZEN 2012 SP2蓝色版，版本2.0.14283.302 （卡尔蔡司，德国耶拿）
2.Microsoft Office Excel 工作表 2007（美国华盛顿州微软公司）
3.GraphPad Prism，2007 年 3 月 7 日，版本 5.00（GraphPad Inc.，马萨诸塞州，美国）

程序

A.抗TH 整个果蝇大脑的免疫染色

1.将苍蝇整个头部组织固定在含有 0.5% Triton X-100 的 1 mL 4% PFA (pH 7.4) 中，在无菌1.5 mL 离心管中通过使用试管旋转器以恒定速度 (10 rpm)混合 2小时室温 (RT)。
2.固定 2 小时后，用 1 mL 0.1% PBST 清洗飞头组织3 次，每次 15 分钟，在 RT 下去除 PFA。
3.在 RT 的立体变焦显微镜下，使用细镊子和针去除头囊和连接组织，在 1 × PBS（pH 7.4）中对大脑进行解剖。
4.然后，在 RT 下用 0.1% PBST 清洗大脑五次，每次 15 分钟。
5.在 RT 下用 5% NGS 封闭缓冲溶液封闭大脑 120 分钟。
6.然后，孵化/探测大脑抗TH多克隆一抗溶液通过使用试管旋转器以恒定速度（10rpm）混合在4°C下持续72小时。
7.在 RT 下用 0.1% PBST 洗掉多余的一抗五次，每次 15 分钟。
8.以恒定速度 (10 rpm)与试管旋转器充分混合，在黑暗中用 TRITC 标记的多克隆二级 ab 溶液孵育大脑 24 小时（关键：用铝箔覆盖含有大脑的离心管）。
9.为了消除多余的二抗，在 RT 下再次用 0.1% PBST 清洗大脑五次，每次 15 分钟。
10.将大脑安装在 VECTASHIELD ®封固剂中，然后在顶部盖上盖玻片。
关键：在 VECTASHIELD ®封片剂周围放置玻璃垫片，以防止大脑被盖玻片压碎。
关键：以背腹方向扫描大脑。
11.使用透明指甲油密封边缘。
12.样品已准备好进行图像采集。

B.图像采集

采集果蝇大脑图像以量化DAergic神经元和 FI 的步骤如下：
1.在配备 40 倍物镜的荧光显微镜下观察染色的大脑（图 1）。

图1。果蝇整个大脑的扫描。扫描抗 TH免疫染色果蝇大脑使用 Carl Zeiss、 Axio Imager M2（40× 物镜）和ZEN 2012 SP2软件，可交互控制图像采集、图像处理和图像分析。

2.使用带有罗丹明荧光滤光片的单色相机扫描并拍摄图像（图 2）。

图 2.图像采集和执行红点测试。对于图像采集，选择带有罗丹明滤镜的单色相机。对多巴胺能 ( DAergic ) 神经元的可见性进行红点测试，并使用大脑评估饱和度，对其他样本重复使用相同的曝光时间。

3.在采集面板中执行红点测试（从尺寸中选择范围指示器并从采集参数中设置曝光）以获取DAergic神经元的可见性并评估图像采集期间的信号饱和度。对所有大脑样本重复使用相同的曝光时间（图 2）。
4.μm的恒定间隔执行 Z 堆栈编程（图 3）。

图 3.图像选择和 Z 堆叠

5.要生成 2D 图像，请在方法列上使用 X-Y 平面的正交显示应用正交和最大强度投影( MIP) （图 4）。

图 4. 创建 2D 图像。要创建 2D 合并图像，请在“方法”列上选择“最大强度投影” (MIP)与XY 平面。

6.以 .jpg 格式导出大脑的 2D 图像以供演示（图 5）。

图 5. 将 2D 大脑图像导出为所需的格式

C.DAergic神经元的定量方法

1.从通过 Z 堆栈编程以恒定间隔获得的图像/扫描中识别簇（图 6）。
2.放大图像以显示细胞体/结构（图 6）。

图 6. 多巴胺能 ( DAergic ) 神经元数量和荧光强度 (FI) 的定量。为了量化DAergic神经元数量和 FI，选择具有大脑区域的 Z-Stack 3D 图像/扫描； PAL、PPL1、PPL2、PPM1/2 和 PPM3（PAL ：原大脑前外侧；PPL ：原大脑后外侧；PPM ：原大脑后内侧）。

3.以公正的方式确定/计算每个簇中DAergic神经元的数量。

D.DAergic神经元FI 的表征方法

1.果蝇大脑的PAL、PPL1、PPL2、PPM1/2、PPM3 和 VUM（可量化DAergic神经元簇）区域（图 6）。
2.放大大脑图像以查看清晰的神经突（图 7）。

图 7.荧光强度 (FI) 量化的详细信息。放大图像以看到清晰的神经突，选择适当的工具，从图形中绘制样条轮廓并在神经元周围画一条线，并显示强度平均值和面积。

3.选择适当的图形工具，绘制样条轮廓，并绘制一条线来包围神经元，给出强度平均值和面积（图 7）。
4.选择更多测量选项，然后通过右键单击神经元内部选择强度总和（图 8）。
5.从面板左侧的“测量”选项卡中，选择“列表” 、 “所有视图”和“创建文档” （图 9）。
6.以 .xml 格式记录每个神经元图像的面积和 FI 总和（图 10）。
7.每次扫描的间隔为 1.08 μm （累积宽度为 11.88 μm ）（图 11）。
8.簇中所有神经元的强度总和给出了该特定区域（簇）的总 FI。
9.总 FI 是属于所有DAergic神经元簇的所有神经元的 FI 之和。

图 8. 测量荧光强度 (FI) 总和。通过选择更多测量选项来选择强度总和（软件在右键单击神经元时提供像素值）。

图 9. 荧光强度 (FI) 编译。从测量选项中选择列表、所有视图，然后创建文档。

图 10. 以 .xml 格式测量神经元每次扫描的 FI 总和

图 11 .单个神经元和簇中所有神经元的荧光强度 (FI) 的汇编。为了表征单个神经元的 FI，总共考虑了11 次扫描，每次扫描的间隔为 1.08 μm （累积宽度为 11.88 μm ）。取平均值并找出标准误差。对所有多巴胺能 ( DAergic ) 神经元遵循相同的方法/步骤。特定簇中所有神经元的强度总和给出了该特定区域的总 FI（按簇）。总 FI 是属于所有DAergic神经元簇的所有神经元的 FI 之和。

E.注意事项和建议

1.头部组织固定至关重要，应正确进行[使用恒速（10 rpm）试管旋转器轻轻彻底地固定头部组织]。如果抗体（初级抗体）的工作出现任何问题，工作人员应首先检查固定是否彻底且正确，然后再投入时间确定抗体的效率。
2.应使用恒速 (10 rpm) 的试管旋转器孵育一抗和二抗。
3.关键：为了防止大脑被压碎，在用盖玻片安装大脑时应使用玻璃垫片。
4.盖玻片边缘应用指甲油彻底密封，以避免大脑干燥。
5.图像采集应在同一天完成，以避免漂白。
6.应注意从具有相同方向的样品中捕获图像。
7.红点测试应仔细进行。
8.应重复使用相同的设置来捕获不同样本的图像/扫描。
9.执行 Z 堆栈编程时应小心，以免扫描中遗漏任何神经元。

数据分析

Z 堆栈扫描/图像分析，用于果蝇大脑中DAergic神经元的量化和 FI 的表征
1.这从 Z 堆栈图像/扫描中确定/计数DAergic神经元。以无偏的方式计算每个簇中DAergic神经元的数量。至少对 10 个大脑进行了DAergic神经元数量定量分析。使用合并的果蝇大脑 2D 图像进行演示（图12 ）。

图 12.果蝇整个大脑中多巴胺能 ( DAergic ) 神经元簇的演示。 A.果蝇大脑卡通图，显示不同DAergic神经元簇的位置。 B. 使用卡尔蔡司荧光显微镜的 ZEN 软件捕获并分析果蝇的全脑，使用针对一抗 TH 抗体的荧光标记二抗。果蝇大脑的每个半球大约有 140 个DAergic神经元，这些神经元排列成不同的簇。其中一些是 PAL（4-5 个神经元）、PPL1（11-12 个神经元）、PPL2（6/7 个神经元）、PPM1/2（8/9 个神经元）、PPM3（5-6 个神经元）和 VUM（3神经元）（PAL：原大脑前外侧；PPL：原大脑后外侧；PPM：原大脑后内侧）。图 1-12 改编自Ayajuddin等人的修改。 [28]。

2.为了表征单个神经元的 FI，总共考虑了11 次扫描，每次扫描间隔为 1.08 μm （累积宽度为 11.88 μm ）。然后，获得平均值和标准误差。所有DAergic神经元都遵循相同的方法/步骤。特定簇中所有神经元的强度总和给出了该特定区域的总 FI（按簇）。总 FI 是属于所有DAergic神经元簇的所有神经元的 FI 之和。
3.GraphPad Prism排列并绘制所有DAergic神经元的数据和所有DAergic神经元的 FI（图 13 ）。

图 13.数据分析和结果表示。 A.使用GraphPad Prism排列并绘制总多巴胺能 ( DAergic ) 神经元和所有神经元荧光强度 (FI) 的数据。 B. DAergic神经元的图形表示。 C.果蝇大脑中DAergic神经元标记的次级 ab（抗 TH）的总 FI 的图形表示。图 12 和 13 是使用 Adobe Photoshop CS 6.2 版本：13.0.1 准备的。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：
•阿亚朱丁等人。 [28]。基于荧光显微镜的敏感方法，用于量化帕金森病果蝇模型中的多巴胺能神经变性。正面。神经科学。（图 2，补充图 1-11）。

一般注意事项和故障排除

1.在解剖头囊时应格外小心，以避免损坏大脑，这可能会损坏某些神经元簇，从而影响 FI 定量（可能不会影响神经元数量的定量）。
2.将头部固定在 PFA 中时，务必注意并轻轻地彻底混合头部。
3.图像采集应在制备载玻片后立即进行，以尽量减少可能影响 FI 定量的信号漂白。
4.扫描位于背腹位置的大脑时应小心。
5.以不同方向扫描不同的大脑会产生 FI 信号水平的变化。

致谢

这项研究得到了印度生物技术部 (DBT) 的支持（研发拨款号：BT/405/NE/U-Excel/2013；BT/PR16868/NER/95/328/2015 和 BT/COE/34/SP28408） /2018）和印度科学技术部（DST）科学与工程研究委员会（SERB）（研发资助编号：EMR/2016/002375，2017年3月27日）授予SCY。这项工作的一部分已在 2021 年 12 月 13 日至 17 日举行的印度果蝇研究会议 ( InDRC )上发表，该会议由印度科学教育与研究学院 (IISER-K)、加尔各答RC 组织。 RC和MA获得DBT-JRF（初级研究奖学金）； RC获得DBT-SRF（高级研究奖学金）和ICMR（印度医学研究委员会）-SRF。
原始研究论文： Ayajuddin ., M, Chaurasia., R, Das., A, Modi., P, Phom., L, Koza., Z 和Yenisetti ., SC (2023)。基于荧光显微镜的敏感方法，用于量化帕金森病果蝇模型中的多巴胺能神经变性。正面。神经科学。 17：1158858 [28]。

利益争夺

作者声明不存在利益冲突。

参考

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3.Ayajuddin , M.、Phom, L.、Koza, Z.、Modi, P.、Das, A.、Chaurasia, R.、 Thepa , A.、Jamir, N.、 Neikha , K.、 Yenisetti , SC 等等人。（2022）。成人健康和过渡阶段特异性鱼藤酮介导的帕金森病果蝇模型：对迟发性神经退行性疾病模型的影响。正面。摩尔。神经科学。 15：e896183。 https://doi.org/10.3389/fnmol.2022.896183
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