材料与试剂
生物材料
1.人类诱导多能干细胞 (hiPSC) （内部生成[5]）
试剂
1.Essential 8 TM Flex 培养基套件（E8 Flex 培养基）（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：A28583-01） 2.Geltrex TM基质（Geltrex）（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：A1413301） 3.DMEM/F-12 +Lglut，+HEPES（DMEM/F-12）（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：11330032） 4.青霉素-链霉素（青霉素/链霉素）（5,000 U/mL）（ Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：15070063） 5.RevitaCell TM补充剂（100 × ）（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：A2644501） 6.DPBS，无钙，无镁（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：14190144） 7.IV 型胶原酶粉末（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：17104019） 8.SB431542（Tocris Bioscience，目录号：1614；产品规格：10 mM 乙醇溶液） 9.LDN193189（Stemgent，目录号：04-0074-02；产品格式：10 mM 溶液） 10.Neurobasal TM培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：21103049） 11.B-27 TM补充剂减去维生素 A (50 × )（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：12587-010） 12.N-2 补充剂（100 × ）（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：17502048） 13.L-谷氨酰胺（200 mM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：25030024） 14.Aqua ad iniectabilia（注射水）（B. Braun，目录号：2351744） 15.重组鼠 FGF-basic (FGF)（Peprotech，目录号：450-33；产品规格：10 µg/mL，溶于 DPBS） 16.重组人表皮生长因子 (EGF)（ProSpec，目录号：CYT-217；产品规格：100 µg/mL 注射用水） 17.Accutase ®溶液（Sigma-Aldrich，目录号：A6964） 18.胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：10270106） 19.二甲亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650） 20.MEM非必需氨基酸溶液（NEAA）（100 × ）（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：11140050） 21.L-抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号：A4403；产品规格：注射水中 200 µM） 22.重组人 IGF-1 (IGF)（Peprotech，目录号：100-11；产品规格：100 µg/mL 注射用水） 23.人激活素 A 重组蛋白 (A)（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：PHC9564；产品规格：10 µg/mL，溶于 DPBS） 24.重组人Heregulin β-1 (H)（Peprotech，目录号：100-03，产品规格：250 µg/mL 注射用水） 25.丙酮酸钠（100 mM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：11360070） 26.台盼蓝溶液，0.4%（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号： 15250061） 27.乙醇绝对含量 ≥ 99.8%（VWR，目录号：20821.296） 28.异丙醇，99.5%（Thermo Fisher Scientific，目录号：184130010）

解决方案
1.E8 Flex 介质（参见食谱） 2.Geltrex 涂层（参见配方） 3.IV 型胶原酶（10× 和 1× 溶液）（参见配方） 4.神经诱导介质（NIM）（参见食谱） 5.神经成熟介质（NMM）（参见食谱） 6.星形胶质细胞分化培养基 (ADM)（参见食谱） 7.星形胶质细胞成熟培养基 (AMM)（参见食谱）
食谱
1.E8 Flex 中号 TM Flex 培养基套件中冷冻的Essential 8 TM Flex 补充剂在室温下解冻约 1 小时或在 2–8 °C 下过夜解冻。避免光照，因为它对光敏感。轻轻翻转小瓶几次，混合解冻的补充剂，然后将 Essential 8 TM Flex 补充剂的全部内容物无菌转移至 Essential 8 TM Flex 基础培养基瓶中。旋转瓶子以混合。 E8 Flex 培养基可在 2–8 °C 下保存长达两周。试剂最终浓度体积 Essential 8 TM Flex 基础培养基98%500毫升 Essential 8 TM Flex 补充剂 (50 × )2%10毫升全部的100%510毫升
2.Geltrex 涂层在 Geltrex 涂层制备过程中，务必将所有组分保持在 ≤ 2–8 °C，以防止过早凝固。为了确保这一点，首先在 50 mL 锥形管中制备 24.75 mL 2–8 °C DMEM/F-12，然后从 -20 °C 收集 Geltrex 等分试样。从准备好的 50 mL 锥形管中转移约 0.5 mL 2–8 °C DMEM/F-12 至 Geltrex 等分试样中，上下移液以溶解冷冻等分试样，然后将约 0.75 mL 溶液转移回 50 mL锥形管。重复该过程几次，将 Geltrex 等份的全部内容物转移到 50 mL 锥形管中。搅拌均匀。 Geltrex 涂层可在 2–8 °C 下保存一周。试剂最终浓度体积 DMEM/F-1299%24.75毫升格尔特雷克斯1%250微升全部的100%25毫升
3.IV 型胶原酶（10 ×和 1 ×溶液）首先，制备储备浓度（10 × ）：将 1 g IV 型胶原酶粉末稀释在 100 mL DMEM/F-12 中并过滤灭菌。将 10 ×溶液等分为 10 mL/等份。接下来，制备工作浓度（1 × ）：用 90 mL DMEM/F-12 稀释 10 mL 储备浓度（10 × ），制成 1 ×溶液并过滤除菌。将 1 ×溶液等分为 12.5 mL/等份。 10 ×和 1 ×等分试样均可在 -20 °C 下保存≤ 6 个月。使用前将 IV 型胶原酶 (1 × ) 恢复至室温。试剂最终浓度数量或体积 DMEM/F-12100%100毫升 IV型胶原酶（粉末）10毫克/毫升（10 × ）1克 DMEM/F-1290%90毫升 IV 型胶原酶 (10 × )1 毫克/毫升 (1 × )10毫升
4.神经诱导培养基 (NIM)：d0-d6 准备约 500 mL 的 E8 Flex 培养基和 Pen/Strep 散装溶液，并过滤灭菌。 E8 Flex + Pen/strep 可在 2–8 °C 下保存两周。要准备 NIM，请制备E8 Flex + Pen/Strep 溶液当天所需体积的等分试样，并在使用当天新鲜添加SB431542和LDN193189 。使用前过滤灭菌并将 NIM 溶液恢复至室温。试剂最终浓度体积 E8 Flex 中号100%500毫升笔/链球菌1%5毫升 SB43154210微米看注释 LDN1931890.1微米看注释
5.神经成熟介质 (NMM)：d7-d15 准备 > 200 mL 的基本培养基（DMEM/F12、neurobasal 培养基、Pen/Strep、B-27 减去维生素 A、N-2 和 L-谷氨酰胺）的散装溶液并过滤灭菌。基础培养基可在 2–8 °C 下保存四个星期。要制备 NMM，请制备当天所需体积的基础培养基溶液等分试样，并在使用当天新鲜添加SB431542 、 LDN193189 、FGF 和 EGF。使用前过滤灭菌并将 NMM 溶液加热至 37°C。试剂最终浓度体积（200 mL 时） DMEM/F-1247.5%95毫升神经基础培养基47.5%95毫升笔/链球菌1%2毫升 B-27减去维生素 A2%4毫升 N-21%2毫升 L-谷氨酰胺1%2毫升 SB43154210微米看注释 LDN1931890.1微米看注释纤维生长因子10纳克/毫升看注释表皮生长因子10纳克/毫升看注释
6.星形胶质细胞分化培养基 (ADM)：d16-d25 制备 >200 mL 的基本培养基（神经基底培养基、Pen/Strep、N-2、NEAA 和 L-抗坏血酸）的散装溶液并过滤灭菌。基础培养基可在 2–8 °C 下保存四个星期。要制备 ADM，请制备当天所需体积的基础培养基溶液的等分试样，并在使用当天新鲜添加 FGF、IGF、A 和 H。使用前过滤灭菌并将 ADM 溶液加热至 37°C。试剂最终浓度体积（200 mL 时）神经基础培养基97%194毫升笔/链球菌1%2毫升 N-21%2毫升国家环境局1%2毫升 L-抗坏血酸 (200 µM)0.8微米800 µL 纤维生长因子10纳克/毫升看注释胰岛素样生长因子200纳克/毫升看注释 A10纳克/毫升看注释 H10纳克/毫升看注释
7.星形胶质细胞成熟培养基 (AMM)：d25+ 准备 500 mL 的基本介质（DMEM/F12、neurobasal 介质、Pen/Strep、N-2、NEAA、L-抗坏血酸、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和 FBS）的散装溶液并过滤灭菌。基础培养基可在 2–8 °C 下保存四个星期。要制备 AMM，请制备当天所需体积的基础培养基溶液的等分试样，并在使用当天新鲜添加 IGF、A 和 H。使用前过滤灭菌并将 AMM 溶液加热至 37°C。试剂最终浓度体积（500 mL 时） DMEM/F-1246.3%231.5毫升神经基础培养基46.3%231.5毫升笔/链球菌1%5毫升 N-21%5毫升国家环境局1%5毫升 L-抗坏血酸 (200 µM)0.8微米2毫升 L-谷氨酰胺1%5毫升丙酮酸钠1%5毫升胎牛血清2%10毫升胰岛素样生长因子200纳克/毫升看注释 A10纳克/毫升看注释 H10纳克/毫升看注释
实验室用品
1.细胞培养瓶，25 cm 2 ，细胞排斥表面（T25非贴壁烧瓶）（Greiner Bio-One，目录号：690980） 2.细胞培养多孔板（6孔板）（Greiner Bio-One，目录号：657160） 3.25 mL 无菌储液罐（Thermo Fisher Scientific，目录号：95128095）或 50 mL 无菌储液罐（InvitroLab，目录号：IV-6002） 4.细胞刮刀（TH Geyer，目录号：7696760） 5.15 mL 锥形管（TH Geyer，目录号：7696714） 6.50 mL锥形管（Greiner Bio-O ne ，目录号：227261） 7.150 mL 真空过滤装置，孔径 0.22 µm（Jet Biofil，目录号：FCF010004） 8.500 mL 真空过滤装置，孔径 0.22 µm（Jet Biofil，目录号：FPE204500） 9.2 mL 冷冻管（Maxxline，目录号：MLC2B） 10.5 mL血清移液器（Greiner Bio-One，目录号：606180） 11.10 mL 血清移液器（Greiner Bio-One，目录号：607180） 12.25 mL 血清移液器（Greiner Bio-One，目录号：760160-TRI） 13.无菌 PES 注射器过滤器（Thermo Fisher Scientific，目录号：15206869） 14.50 mL 3 部分注射器（Chirana T. Injecta，目录号：CH03050LL） 15.10 µL 移液器吸头（TH Geyer，目录号：7695881） 16.20 µL 移液器吸头（TH Geyer，目录号：7695882） 17.200 µL 移液器吸头（TH Geyer，目录号：7695884） 18.1,250 µL 移液器吸头（TH Geyer，目录号：7695887） 19.Countess TM细胞计数室载玻片（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：C10283）

设备
1.NordicSafe ® II 级生物安全柜（ESCO，目录号：NC2-L） 2.CellXpert ® C170i CO 2培养箱（Eppendorf，目录号：6734） 3.EVOS TM XL Core倒置显微镜（物镜：4 × 、10 × 、20 × ）（Thermo Fisher Scientific，目录号：AMEX1000） 4.带有用于 15 和 50 mL 锥形管的转子的实验室离心机（Biosan，目录号：LMC-3000） 5.水浴（37°C）（Julabo，目录号：TW8） 6.Finnpipette TM F2 GLP 移液套件 2（Thermo Fisher Scientific，目录号：11835850） 7.Pipetboy acu 2（Integra，目录号：1550179） 8.Mr. Frosty TM冷冻容器（Thermo Fisher Scientific，目录号：5100-0001） 9.Countess TM II FL 自动细胞计数器（Thermo Fisher Scientific，目录号：AMQAF1000） 10.架子 11.液氮（N 2 ）罐 12.冷冻室（-20℃） 13.冰箱（2–8°C）

程序
A.神经感应
1.在 Geltrex 包被的 6 孔板（表 1）上将 hiPSC 铺在 2 mL/孔的 E8 Flex 介质中，并根据标准方案进行扩展。请参阅食谱 1 和 2。注意：整个实验过程中 Geltrex 的使用可以用 Matrigel 代替。 2.作为 iPSC 至少 7 天后，细胞系在达到 70%–90% 汇合（第 0 天）时准备进行神经诱导。笔记： a.每个细胞系使用一个完整的 6 孔板来开始一次分化。 b.为了避免周末工作过多，请从星期一开始第 0 天 (d0)。 3.除去用过的 E8 Flex 培养基，用 1 mL/孔的 DPBS 洗涤细胞一次，并与 1 mL/孔的室温 IV 型胶原酶 (1 × ) 一起在 37 °C、5% CO 2下孵育 10–20 分钟，直至分离殖民地。参见配方 3 。注意：准备好后，iPSC 集落将在边界周围升起并卷曲。较大的菌落可能需要较长的孵育时间。孵育 10 分钟后，每 5 分钟在光学显微镜下检查一次。最大 IV 型胶原酶 (1×) 孵育时间：60 分钟。 4.孵育后，除去用过的胶原酶，加入1 mL/孔的室温E8 Flex培养基，用细胞刮刀轻轻刮除松散的菌落，并使用P1000移液器将细胞悬液转移至单独的15 mL锥形管中。笔记： a.每个 6 孔板使用一根 15 mL 锥形管。 b.避免过度移液以维持菌落团块。 c.如果需要，使用 1 mL/孔的新鲜 E8 Flex 培养基轻轻冲洗孔的边缘以收集剩余的细胞。 5.将锥形管在37°C 下用 5% CO 2孵育15 分钟，以使簇沉淀。 6.孵育后，除去上清液。 7.通过上下吹打几次，小心地将细胞沉淀溶解在 10 mL 室温 NIM（参见配方 4）中，并将细胞悬浮液转移至 T25 非贴壁烧瓶中。关键：不要上下移液过多以维持细胞团块。注：标记为通道 0 (P0)。 8.在光学显微镜下检查细胞密度，并将烧瓶在37 °C、5% CO 2下孵育。 9.在第 1 天 (d1)、d2 和 d4 执行介质更换，每瓶 10 mL 室温 NIM。更换培养基时，将 T25 非贴壁烧瓶垂直放置在培养箱中的 25 或 50 mL 无菌储液罐中，让细胞沉淀 5-10 分钟（图 1A）。小心地将烧瓶以直立位置转移到生物安全柜中，并取出约 9 mL 的用过的培养基，以使细胞保持覆盖在少量培养基中。每个烧瓶中添加 10 mL 新鲜的室温 NIM。笔记： a.诱导开始三到四天后，拟胚体 (EB) 清晰可见（图 1B）。在最初的几天里，EB 的边界看起来不规则，但在诱导阶段会呈现出更圆的形状。 b.神经诱导过程中不需要细胞摇床。如果 EB 开始相互粘附，请在更换培养基时轻轻移液。如果 EB 附着在烧瓶底部，请参阅故障排除。

图 1. 星形胶质细胞分化过程中的细胞形态。 A. 图像显示使用无菌储液器作为烧瓶支撑，以允许培养基更换期间的拟胚体 (EB) 沉淀。 B. 星形胶质细胞分化过程中 EB、细胞形态和最佳融合的明场图像。比例尺：200 µm。 d+指星形胶质细胞成熟的天数。使用患者成纤维细胞生成 hiPSC 得到了鲁汶大学医院伦理委员会的批准（编号 S50354 和 S63792）。
表 1. 分化步骤和测定概述分化步骤/测定板材规格播种密度最佳播种时间点中等变化量Geltrex-包衣量解离/固定试剂体积（例如，accutase）差异化的开始6孔板70%–90% 汇合的 hiPSC第 0 天 (d0)2毫升/孔1毫升/孔1毫升/孔神经感应T25非贴壁烧瓶不适用第 0 天 (d0)10 毫升/瓶不适用不适用神经维护6孔板不适用第 7 天 (d7)2毫升/孔1毫升/孔1毫升/孔神经扩张/解冻6孔板70%–100% 汇合参见程序C 和 D2毫升/孔1毫升/孔1毫升/孔星形胶质细胞分化6孔板90%–100% 汇合第 16 天 (d16)2毫升/孔不适用不适用星形胶质细胞成熟/扩张/解冻6孔板70%–100% 汇合参见程序F–H2毫升/孔1毫升/孔1毫升/孔免疫细胞化学24孔板30–50,000 个细胞/cm 2固定前两天0.5毫升/孔0.5毫升/孔0.5毫升/孔透射电子显微镜24孔板50,000 个细胞/cm 2> 实验前 2 周0.5毫升/孔0.5毫升/孔0.5毫升/孔蛋白质提取6孔板50,000 个细胞/cm 2> 实验前 2 周2毫升/孔1毫升/孔1毫升/孔 RNA提取6孔板50,000 个细胞/cm 2> 实验前 2 周2毫升/孔1毫升/孔1毫升/孔代谢测定12孔板32,000 个细胞/cm 2实验前2-7天1毫升/孔0.75毫升/孔0.75毫升/孔

B.神经维护
1.在 d7，用于神经玫瑰花结形成的板 EB：为每个 T25 非贴壁烧瓶准备一个完整的 Geltrex 包被的 6 孔板（表 1），并在 37°C 下用 5% CO 2孵育至少 30 分钟。注意：Geltrex 包被的板可以在前一天准备好，并在37 °C、5% CO 2下孵育过夜。 2.30 分钟后，取出用过的 Geltrex，并添加 1 mL/孔的 NMM（参见配方 5）。将板在37 °C、5% CO 2下孵育以备使用。 3.将用过的培养基中的 EB 转移到单独的 15 mL 锥形管（每个 T25 非贴壁烧瓶一根锥形管）中，并在 37 °C 下用 5% CO 2直立孵育5-10 分钟，以使 EB 沉淀。 4.孵育后，吸出用过的培养基，并将 1 mL/孔的 37 °C NMM 添加到锥形管中，无需上下移液。 5.将 1 mL/孔的 EB 悬浮液转移到准备好的 Geltrex 包被的 6 孔板中，其中含有 1 mL/孔的 NMM，使每个孔含有 2 mL 的 NMM。将板在 37°C、5% CO 2下孵育。注意：确保将 EB 均匀分布在不同的孔中，并通过小心摇动板以促进均匀 EB 分散来完成。 6.每天用 37°C NMM 更换介质，直到 d10。注意：在 d8–d9 时，将可见小菌落，每个菌落有 1–10 个含有 NPC 的神经玫瑰花结（图 1B）。 7.第 10 天，神经玫瑰花结清晰可见，准备传代 (P1) 和 NPC 扩增。 8.每 6 孔板准备一个 Geltrex 包被的 6 孔板，并在 37 °C 下用 5% CO 2孵育至少 30 分钟。注意：Geltrex 包被的板可以在前一天准备好，并在37 °C、5% CO 2下孵育过夜。 9.30 分钟后，取出用过的 Geltrex，并添加 1 mL/孔的 NMM + 5 µL/mL RevitaCell TM补充剂。将板在 37 °C、5% CO 2下孵育以备使用。 10.在37°C、5% CO 2下用 1 mL/孔室温 Accutase 孵育神经玫瑰花结 4 分钟，以分离含有 NPC 的神经玫瑰花结。 11.孵育后，添加 1 mL/孔 37 °C NMM 以灭活 Accutase。 12.用细胞刮刀轻轻刮擦细胞，并将细胞悬浮液转移至 15 mL 锥形管中。注意：由于不建议对 15 mL 锥形管进行体积低于 3 mL 的离心，因此如果需要，可通过添加更多 NMM 将体积增加到 3 mL 以上。 13.在室温下以 145× g离心 4 分钟。 14.去除上清液，加入 1 mL/孔 37 °C NMM + 5 µL/mL RevitaCell TM补充剂，并小心地上下移液以溶解细胞沉淀。 15.将 1 mL/孔的细胞悬液转移至准备好的 Geltrex 包被的6 孔板中，并加入 1 mL/孔的 NMM + 5 µL/mL RevitaCell TM补充剂，使每个孔含有 2 mL 的 NMM + 5 µL/mL RevitaCell TM补充剂。注意：为了均匀分布 NPC，请小心地左右摇动盘子。 16.在光学显微镜下检查细胞分布，并将板在 37°C、5% CO 2下孵育。 17.在第 11 天用 2-6 mL/孔的 37°C NMM 进行介质更换，然后每隔一天进行一次，直到第 16 天。注意：NPC 通常在第 11 天（星期五）达到 100% 汇合，但不需要传代。通过在第 11 天（星期五）给予 4-6 mL/孔 37 °C NMM，然后在第 14 天（星期一）进行传代 (P2) 和冷冻保存，可以避免周末工作。标准培养基更换量为每两天 2 mL/孔。暂停点：在 d12–d14，NPC 传代 (P2) 和/或冷冻保存一次。如果需要，可以在分化的这个时间点暂停并重新启动该协议。传代/解冻 NPC 后的第二天务必更换培养基。关键：在第 16 天更改为 ADM（参见配方 6）时，请确保 NPC 达到 90%–100% 汇合（图 1B）。 ADM 对细胞影响很大，会导致大量细胞死亡。 NPC 需要细胞与细胞接触才能在分化方案的第 16-25 天 (d16-d25/d+0) 中存活。
C.NPC扩展
1.第 12 天至第 14 天，以 1:3–1:6 的方式将 NPC 传代一次，以增强细胞扩增 (P2)。注意：传代率取决于细胞汇合度和生长速率，因为在第 16 天内细胞汇合度达到 90%–100% 非常重要。对于完整的 6 孔板，作者建议以 1:3–1:6 传代其中一个孔，并冷冻保存其余 5 个孔（每孔一个冷冻管）。 2.准备 Geltrex 包被的 6 孔板（表 1）并在 37°C 下用 5% CO 2孵育至少 30 分钟。注意：Geltrex 包被的板可以在前一天准备好，并在37 °C、5% CO 2下孵育过夜。 3.后，取出用过的 Geltrex，并添加 1 mL/孔的 NMM + 5 µL/mL RevitaCell TM补充剂。将板在 37 °C、5% CO 2下孵育以备使用。 4.除去用过的NMM，用DPBS洗涤细胞一次，并与1mL/孔的室温accutase在37℃、5%CO 2下孵育4分钟。 5.孵育后，轻轻敲击板的侧面以检查细胞是否容易分离。注意：如果细胞不易分离，请再孵育一分钟并重复步骤 C5。 6.添加 1 mL/孔 37°C NMM 以灭活 accutase。 7.沿着孔的两侧轻轻冲洗，以分离剩余的 NPC，并将细胞悬浮液转移到 15 mL 锥形管中。笔记： a.如果与 Accutase 孵育 5 分钟后并非所有细胞都分离，请使用细胞刮刀收集剩余的细胞。 b.由于不建议对 15 mL 锥形管进行体积低于 3 mL 的离心，因此如果需要，可通过添加更多 NMM 将体积增加到 3 mL 以上。 8.在室温下以 145× g离心 4 分钟。 9.去除上清液并继续步骤 C10 进行传代或步骤 C11 进行冷冻保存。 10.对于传代： a.添加 1 mL/孔 37 °C NMM + 5 µL/mL RevitaCell TM补充剂，并小心地上下移液以溶解细胞沉淀。 b.将 1 mL/孔的细胞悬液转移至准备好的 Geltrex 包被的6 孔板中，并添加 1 mL/孔的 NMM + 5 µL/mL RevitaCell TM补充剂，使每孔含有 2 mL 的 NMM + 5 µL/mL RevitaCell TM补充。 c.为了均匀分布 NPC，请小心地左右摇动盘子。 d.在光学显微镜下检查细胞分布，并将板在 37°C、5% CO 2下孵育。 e.第二天，用 2 mL/孔的 37°C NMM 进行介质更换，然后每隔一天进行一次更换，直到 d16。 11.对于冷冻保存： a.添加 1 mL/瓶室温冷冻介质（90% FBS 和 10% DMSO），并小心地上下吹打以溶解细胞沉淀。 b.将 1 mL 细胞悬液转移至预先标记的冷冻管中，用异丙醇将小瓶转移至 Mr. Frosty 中，并在 -80 °C 下孵育过夜。 c.第二天，将小瓶转移至液氮储存处进行长期冷冻保存。
D.解冻 NPC
1.冷冻保存的 NPC (d12-d14) 应解冻并在分化方案的同一天继续进行。注意：例如，冷冻保存的 d14 NPC 在方案第 14 天解冻并继续。 2.准备 Geltrex 包被的 6 孔板（表 1）（一孔/冷冻管）并在 37°C 下用 5% CO 2孵育至少 30 分钟。注意：Geltrex 包被的板可以在前一天准备好，并在37 °C、5% CO 2下孵育过夜。 3.每个冷冻管，准备 15 mL 锥形管，其中含有 9 mL 37°C 基本 NMM（不含生长因子）。 4.30 分钟后，取出用过的 Geltrex，并添加 1 mL/孔的 NMM（含有生长因子）+ 5 µL/mL RevitaCell TM补充剂。将板在 37 °C、5% CO 2下孵育以备使用。 5.2储存中取出冷冻管，并在 37°C 水浴中解冻约 1 分钟，直至留下豌豆大小的小冰块。 6.将〜0.5 mL的37°C基本NMM（不含生长因子）从准备好的15 mL锥形管转移至冷冻管，上下移液以溶解剩余的冰，并将〜1 mL细胞悬浮液转移回15 mL锥形管。重复该过程几次，将冷冻管的全部内容物转移到 15 mL 锥形管中。 7.在室温下以 145× g离心 4 分钟。 8.去除上清液并添加 1 mL/孔 37 °C NMM（含生长因子）+ 5 µL/mL RevitaCell TM 补充并小心地上下吹打以溶解细胞沉淀。 9.将 1 mL/孔的细胞悬液转移至准备好的 Geltrex 包被板中，加入 1 mL/孔的 NMM（含生长因子）+ 5 µL/mL RevitaCell TM补充剂，使每孔含有 2 mL NMM（含生长因子） + 5 µL/mL RevitaCell TM补充剂。为了均匀分布 NPC，请小心地左右摇动盘子。 10.在光学显微镜下检查细胞分布，并将板在 37°C、5% CO 2下孵育。 11.第二天用 2 mL/孔的 37°C NMM（含有生长因子）进行介质更换，然后每隔一天进行一次更换，直到 d16。
E.星形胶质细胞分化
1.在 d16，将介质更改为 37°C ADM 的 2 mL/孔（参见配方 6），开始将 NPC 转化为星形胶质细胞祖细胞 (APC) 并诱导星形胶质细胞分化（图 1B）。 2.每隔一天更换一次 ADM，直到第 25 天 (d25/d+0)，此时预计会发生胶质细胞转变为星形胶质细胞。关键：在此期间不要传代细胞，以确保细胞层持续汇合。笔记： a.37 °C ADM，则可以避免在周末更换培养基。 b.在此期间预计可能出现细胞内空泡化和/或细胞死亡增加。如果在 d16–d25 期间发生细胞完全死亡，请参阅故障排除。
F.星形胶质细胞成熟
1.第 25 天，星形胶质细胞开始成熟 (d+0)。此时有多种选择：暂停点：第25天（d25/d+0），可以冷冻保存星形胶质细胞。如果需要，可以在此时暂停并重新启动协议。首先，请遵循程序 G。 a.如果需要大量细胞样品（例如用于蛋白质和 RNA 提取），请在 AMM 中以指定的细胞密度（表 1）传代并培养一些细胞（参见配方 7），以使星形胶质细胞成熟 4 周。星形胶质细胞在此期间不会传代，因此变得非常汇合（~3D）。相应地调整 AMM 体积：每次更换培养基时（周一、周三和周五），每孔 4–6 mL。剩余的 d25/d+0 星形胶质细胞可以铺板用于扩增和/或冷冻保存。首先，请遵循程序 G。 b.创建星形胶质细胞库：按 1:6 传代 d25/d+0 星形胶质细胞以使其成熟和扩增。每 4-7 天，在 14 天的时间内以 1:6 的比例传代星形胶质细胞。两周 (d+14) 后，冷冻保存星形胶质细胞以供将来的实验使用（6 孔板的每个汇合孔 1-3 个冷冻管）。该协议可以在成熟期间的任何一天暂停和重新启动。对于未来的实验，解冻 d+14 星形胶质细胞，扩增一周，并根据推荐的细胞密度进行培养（表 1）。每隔一天更换一次培养基。首先，请遵循程序 G。笔记：我。对于免疫细胞化学实验，固定前两天将细胞铺板，以避免细胞过度增殖。电镀后第二天更换培养基。二.作者观察到星形胶质细胞增殖直至成熟第 6 周。三.星形胶质细胞标记物随着成熟 3-4 周的时间过程而增加。大约 95% 的星形胶质细胞在成熟第 4 周 (d+28) 呈星形胶质细胞标记物（SOX9、S100β、ALDH1L1 和 AQP4）阳性。参见图 2。

图 2. 使用免疫细胞化学验证星形胶质细胞成熟度。 A.人诱导多能干细胞 (hiPSC) 衍生的星形胶质细胞在成熟第 1-4 周时用星形胶质细胞特异性标记物 S100β、AQP4、ALDH1L1、GFAP、SOX9 和神经元标记物 MAP2 染色的代表性共焦图像。细胞核用 DAPI 染色（蓝色）。比例尺：75 μm。 B.成熟第 1-4 周期间抗体阳性细胞数量的定量。三个生物重复的平均值±SEM（n = 15 幅图像）。该图由 Stoklund Dittlau等人修改。[24]经知识共享署名 4.0 国际许可证 ( http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ) 许可。
G.星形胶质细胞的传代和冷冻保存
1.准备 Geltrex 包被的板（推荐的板格式参见表 1）并在 37 °C 下用 5% CO 2孵育至少 30 分钟。注意：Geltrex 包被的板可以在前一天准备好，并在37 °C、5% CO 2下孵育过夜。 2.30 分钟后，取出用过的 Geltrex，并添加一半体积的 AMM + 5 µL/mL RevitaCell TM补充剂（所需体积参见表 1）。将板在 37 °C、5% CO 2下孵育以备使用。 3.取出用过的 ADM/AMM，用 DPBS 洗涤细胞一次，并与室温 Accutase（所需体积参见表 1）在 37 °C、5% CO 2下孵育 4 分钟。 4.孵育后，轻轻敲击板的侧面以检查细胞是否容易分离。注意：如果细胞不易分离，请再孵育一分钟并重复步骤 G4。 5.添加 1:1 体积的 37°C AMM 以灭活 Accutase。 6.沿着孔的两侧轻轻冲洗，以分离剩余的星形胶质细胞，并将细胞悬浮液转移到 15 mL 锥形管中。笔记： a.如果与 Accutase 孵育 5 分钟后并非所有细胞都分离，请使用细胞刮刀收集剩余的细胞。 b.由于不建议对 15 mL 锥形管进行体积低于 3 mL 的离心，因此如果需要，可通过添加更多 AMM 将体积增加到 3 mL 以上。 7.在室温下以 145× g离心 4 分钟。 8.除去上清液。 9.对于传代： a.添加剩余一半体积的 37 °C AMM + 5 µL/mL RevitaCell TM补充剂（所需体积参见表 1），并小心地上下移液以溶解细胞沉淀。 b.将细胞悬浮液转移到准备好的 Geltrex 包被板中，并添加 AMM + 5 µL/mL RevitaCell TM补充剂。 c.为了均匀分布星形胶质细胞，请小心地左右摇动板。 d.在光学显微镜下检查细胞分布，并将板在 37°C、5% CO 2下孵育。 e.第二天用 37°C AMM 进行培养基更换，然后每隔一天进行一次。 10.对于冷冻保存： a.添加 1 mL/瓶室温冷冻介质（90% FBS 和 10% DMSO），并小心地上下吹打以溶解细胞沉淀。 b.将 1 mL 细胞悬液转移至预先标记的冷冻管中，用异丙醇将小瓶转移至 Mr. Frosty 中，并在 -80 °C 下孵育过夜。 c.第二天，将小瓶转移至液氮储存处进行长期冷冻保存。
H.解冻星形胶质细胞
1.关键：解冻星形胶质细胞时，在铺板进行实验之前，在 6 孔板中至少等待一周的恢复、传代和扩增。注意：作者建议在铺板实验前每 3-4 天传代细胞 1-2 次。传代可增强活力和培养物纯度。 2.准备 Geltrex 包被的 6 孔板（表 1）（一孔/冷冻管）并在 37°C 下用 5% CO 2孵育至少 30 分钟。注意：Geltrex 包被的板可以在前一天准备好，并在37 °C、5% CO 2下孵育过夜。 3.每个冷冻管，用 9 mL 的 37°C 基本 AMM（不含生长因子）准备 15 mL 锥形管。 4.30 分钟后，取出用过的 Geltrex，并添加 1 mL/孔的 AMM（含有生长因子）+ 5 µL/mL RevitaCell TM补充剂。将板在 37 °C、5% CO 2下孵育以备使用。 5.从液体 N 2储存中取出冷冻管，并在 37 °C 水浴中解冻约 1 分钟，直至留下豌豆大小的小冰块。 6.将〜0.5 mL的37°C碱性AMM（不含生长因子）从准备好的15 mL锥形管转移至冷冻管，上下移液以溶解剩余的冰，并将〜1 mL的细胞悬浮液转移回15 mL锥形管。重复该过程几次，将冷冻管的全部内容物转移到 15 mL 锥形管中。 7.在室温下以 145× g离心 4 分钟。 8.去除上清液，并添加 1 mL/孔 37 °C AMM（含生长因子）+ 5 µL/mL RevitaCell TM补充剂，并小心地上下移液以溶解细胞沉淀。 9.将 1 mL/孔的细胞悬液转移到准备好的 Geltrex 包被板中，并加入 1 mL/孔的 AMM（含生长因子）+ 5 µL/mL RevitaCell TM补充剂，因此每孔含有 2 mL AMM（含生长因子）+ 5 µL/mL RevitaCell TM补充剂。注意：为了均匀分布星形胶质细胞，请小心地左右摇动板。 10.在光学显微镜下检查细胞分布，并将板在 37°C、5% CO 2下孵育。 11.第二天用 2 mL/孔的 37°C AMM（含有生长因子）进行培养基更换，然后每隔一天进行一次。协议验证
该协议已在以下研究文章中使用和验证： •斯托克伦德·迪特劳等人。 [24]。 FUS -ALS hiPSC 衍生的星形胶质细胞通过毒性增强和支持丧失机制损害人类运动单位。分子神经变性（图 1、2、4-7，补充图 1-4 和 6-8，以及其他文件 3-6）。该方案是我们之前的 hiPSC 衍生星形胶质细胞方案的优化版本，在以下研究文章中使用并验证了该方案： •钱德拉塞卡兰等人。 [25] 自噬缺陷和代谢失败引发的星形胶质细胞反应性会导致 3 型额颞叶痴呆的神经毒性。干细胞报告（图 1-5 和补充图 1-5）。

一般注意事项和故障排除
一般注意事项
1.通过在周五更换培养基时增加培养基体积，可以避免周末工作（6 孔板为 4–6 mL/孔，12 孔板为 2–3 mL/孔，24 孔板为 1 mL/孔）。烧瓶不需要添加培养基。 2.传代和解冻细胞后的第二天务必更换培养基。 3.增加传代、冷冻保存和解冻时的传代次数。
故障排除
问题 1：EB 在 d4-d7 左右附着在 T25 低附着烧瓶的底部。可能原因：EB 可能稍大，或者 T25 低附着烧瓶的表面处理可能存在缺陷。解决方案：将新鲜 NIM 中的 EB 转移到新的 T25 低附着烧瓶中。转移时，上下移液 2-3 次以减小 EB 的大小。
至第 25 天期间细胞完全死亡。可能原因：d15 时的细胞密度太低。解决方案：目标是在第 15 天细胞汇合度 >90%。

致谢
作者要感谢VIB、鲁汶大学、科学技术创新机构、“法兰德斯科学研究基金”(FWO-Vlaanderen)、Target ALS、ALS Liga België、比利时政府（大学间吸引力极点） P7/16 计划由比利时联邦科学政策办公室、蒂埃里·拉特兰基金会和“比利时神经肌肉疾病防治协会”(ABMM) 发起。图形摘要是通过Biorender.com创建的。该协议改编自 Stoklund Dittlau 等人。 [24]，由 Chandrasekaran 等人修改。 [25] 和 Shaltouki 等人。 [23]。

利益争夺
作者声明他们没有利益冲突。
道德考虑
所有提供组织样本的受试者均获得了书面知情同意书。使用患者成纤维细胞生成 hiPSC 得到了鲁汶大学医院伦理委员会的批准（编号 S50354 和 S63792）。

参考
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