材料与试剂

生物材料

动物
所有小鼠均处于 C57BL/6J 背景，并饲养在 PPAC（法国里昂癌症研究中心 (CRCL) 的特定无病原体动物设施中）。 RAG2-KO 小鼠获自 Charles River Laboratories，并在动物设施中饲养和饲养（无特定病原体）。用于实验的小鼠年龄超过 8 周。 CD4-Cre+ Smad4柔韧/柔韧 (SKO) 小鼠和同窝 CD4-Cre-Smad4 floxed/ floxed (WT)小鼠是骨髓细胞的供体。在肠道炎症发展方面，男性和女性之间没有观察到明显的差异。但同一实验中使用的小鼠应是相同年龄和性别的。

材料
1.移液器吸头 10 μL 、 20 μL 、 200 μL和 1 mL ( Starlab )
2.5 mL无菌注射器（BD，目录号：3095971）
3.50 mL 离心管（Falcon，目录号：352070）
4.15 mL锥形离心管（Falcon，目录号：352097）
5.培养皿（100 × 20 毫米）（FALCON，目录号 353003）
6.10 mL 血清移液器（SARTSTEDT，目录号：86.1254.001）
7.25 G 针（BD，目录号：300600）
8.BD U-100 胰岛素注射器，带 29 G 针头（BD，目录号：324891）
9.Neubauer 室（KOVA International，目录号：87144 F）
10.管 1 . 5 mL，高压灭菌（STARLAB，目录号：S1615-5500）
11.网眼尺寸为 70 μm的尼龙网（SEFAR NITEX，目录号：03-80/29），通过高压灭菌进行灭菌

试剂

1.表面消毒剂（ Anios 、SURFA'SAFE）
2.LD 色谱柱（米尔天尼 Biotec ，目录号：130-042-901）
3.抗CD8α BV605（克隆53-6.7）（ BioLegend ，目录号：100748）
4.抗CD8b Alexa 700（克隆YTS156.7.7）（ BioLegend ，目录号：126618）
5.抗 CD4 Brilliant Violet 711（克隆 RM4.5）（BD，目录号：563726）
6.抗CD3e Brillant Violet 650（克隆17A2）（ BioLegend ，目录号：100229）
7.抗CD45 APC-Cy7（克隆30-F11）（ BioLegend ，目录号：103116）
8.抗CD103 e450（克隆2E7）（ eBioscience ，目录号：48-1031-82）
9.抗Ly6g PE/Dazzle594（克隆1A8）（ BioLegend ，目录号：127648）
10.抗CD11b APC（克隆M1/70）（ BioLegend ，目录号：553312）
11.抗TCRgd FITC（克隆 GL3）（BD，目录号：553177）
12.LIVE/DEAD™ 可固定黄色死细胞染色试剂盒（Life Technologies，目录号： L34968）
13.InVivoMAb抗小鼠 CD8β（ Lyt 3.2）（克隆 53-5.8）（ BioXcell ，目录号： BE0223）
14.InVivoMAb大鼠 IgG1 同种型对照，抗辣根过氧化物酶（克隆 HRPN）（ BioXcell ，目录号： BE0088）
15.InVivoMAb抗小鼠 CD4（克隆 GK1.5）（ BioXcell ，目录号： BE0003-1）
16.InVivoMAb大鼠 IgG2b 同种型对照，抗匙孔血蓝蛋白（克隆 LTF-2）（ BioXcell ，目录号： BE0090）
17.胎牛血清（FBS）（Gibco® ，目录号：A5256701）
18.RPMI-1640 培养基， GlutaMAX ™ 补充剂（Life Technologies，Gibco，目录号：61870036）
19.HEPES缓冲溶液，1 M（Gibco，目录号：15630-080）
20.Hank 缓冲盐溶液（HBSS）（Gibco，目录号：14175-053）
21.磷酸盐缓冲盐水（PBS 10 × ）（Life Technologies，Gibco，目录号：14200-059）
22.乙醇70%（酒精 modifié COOPER ® ）用作防腐剂
23.无水乙醇（VWR Chemicals，目录号：20821.365）
24.CD3ε 微珠试剂盒，小鼠（ Miltenyi Biotec ，目录号：130-094-973）
25.台盼蓝溶液，0.4%（ Thermo Fisher，目录号：15250061）
26.牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
27.EDTA，pH 8.0（EUROMEDEX，目录号：EU0084）
28.异氟烷
29.庆大霉素（50 mg/mL）（Gibco，目录号：15750-037）
30.青霉素-链霉素（Life Technologies，目录号：15140-122）

解决方案

1.RPMI 完整介质（参见食谱）
2.上皮内淋巴细胞富集缓冲液（参见配方）
3.MACS 缓冲区（参见食谱）

食谱

1.RPMI 完整介质
RPMI-1640 富含 10% 热灭活 FBS、 10 mM HEPES和青霉素-链霉素 (1,000 U/mL)。

2.MACS缓冲区
PBS 1 ×含 2 mM EDTA 和 2% BSA

设备

1.辐照器（Elekta Synergy® 或任何替代辐照器）
2.无菌细胞培养罩（ Thermo ，型号： HERAsafe KS 12 1.2m/41489710/2013）
3.QuadroMACS磁性细胞分离器（ Miltenyi Biotec ，目录号：130-090-976）
4.显微镜（蔡司，型号： Primovert ）
5.血清移液器[SARSTEDT，目录号：86.1253.001（5 mL）、86.1254.001（10 mL）和86.1685.001（25 mL）]
6.移液器控制器（INTEGRA，型号： pipetboy ）
7.手术剪刀和镊子（ Dutscher ，目录号：005064、005065、711198、005072）
8.冰桶（ Dutscher ，目录号：830116）
9.麻醉室（ Tem Sega® 或任何替代仪器）
10.称重天平（OHAUS®，型号：CS200）
11.饼形室（相当于Bioseb Lab Instrument® 的 X 射线照射饼笼的模型）
12.动物转移箱 [ InnoVive ，型号：M-BTM（底部）和 MSX4（盖子）]
13.LSRII 流式细胞仪（BD Biosciences，型号：LSR Fortessa HTS）
14.离心机（ Thermo Fisher，型号：Heraeus Megafuge ）

软件

1.FlowJo TM软件 (BD Biosciences) （v. 10.9，2023）
2.GraphPad Prism （v.10.1.2，2023）

程序

A.分离骨髓细胞用于植入受体小鼠

1.使用批准的方法对供体小鼠实施安乐死；在这里，我们使用CO 2吸入。一般来说，单个供体可以重建8 – 10 只小鼠。
2.用 70% 乙醇消毒手术区域。
3.用剪刀在股骨和胫骨上的皮肤上做一个小切口。收集股骨和胫骨并将其放置在 RPMI 完整介质中（参见食谱）。
4.在无菌培养罩下，通过将骨头浸入装有 70% 乙醇的培养皿中来启动该过程，以消除潜在的污染（30 秒）。尝试小心地从骨头上去除大部分肌肉和结缔组织。可以将
骨头长时间留在乙醇中，同时冲洗每根骨头，但建议小心，因为乙醇可能会渗入骨头，可能会损害活细胞。随后，将骨头重新定位到包含约 15 mL 的 RPMI 完整介质的新鲜培养皿中。
5.用无菌剪刀剪断股骨和胫骨两端，露出骨髓腔。
6.暴露骨髓腔后，用镊子小心地抓住骨头。使用 25 G 针，将完整介质装入 5 mL 注射器中，以进行提取过程。轻轻地将针头插入骨髓腔并推动注射器柱塞将骨髓细胞冲入培养皿中。反复重复此过程，直到骨骼从最初的红色转变为更苍白的白色外观，表明骨髓细胞已被提取（图 2）。

图 2. 骨髓细胞提取。使用装有 RPMI 完整介质的 25 G 针头的 5 mL 注射器提取骨髓细胞 (A)。将针头插入骨髓腔，推动注射器柱塞将细胞冲入培养皿中，然后重复，直到骨头从红色变为白色。小鼠胫骨照片 (B)。图 2A 是使用 BioRender.com 创建的。

7.使用 p1000 移液器彻底重悬骨髓细胞。此步骤对于确保骨髓细胞不形成任何聚集至关重要。
8.使用 70 μm无菌尼龙网，将溶液过滤到 50 mL 管中，以消除任何可能的团块。然后，在 4°C 下以 600 × g离心细胞5 分钟。
9.弃去上清液，将沉淀重悬于 500 μL MACS 缓冲液中（参见配方），并添加 50 μL CD3ε-生物素抗体。 4°C 孵育 15 分钟。 CD3e 生物素抗体将与 T 细胞结合，从而在方案的后续步骤中将其特异性消除。孵育期结束后，收回管并添加 5 mL MACS 缓冲液，并通过在 4 °C 下以 600 × g离心5 分钟来离心细胞。
10.用 500 μL MACS 缓冲液重悬沉淀，并添加 100 μL抗生物素微珠。充分混合并在 4°C 下孵育 15 分钟。
11.后，添加 5 mL MACS 缓冲液，并将细胞悬浮液加载到放置在QuadroMACS磁性细胞分离器上的 LD 柱中。使用 15 mL Falcon 管，收集通过的未标记细胞。
12.将收集的细胞在 4°C 下以 600 × g离心 5 分钟。将颗粒重新悬浮在 1 mL 的 PBS 1 ×缓冲液中。使用 0.4% 台盼蓝溶液、Neubauer 室和光学显微镜对活细胞进行计数。
13.调整细胞浓度，使 200 μL PBS 1 ×中的200 万个细胞可以移植到每只小鼠中。或者，如果细胞不足，可以移植 100 万个细胞。或者，为了防止潜在的污染，可以在制剂中添加庆大霉素 (50 μg /mL) 。然后，将细胞保持在 4°C 直至准备使用。

B.辐射和T细胞耗尽的骨髓移植

1.照射前一天，称重受体小鼠以获得起始体重。在照射前对小鼠进行标记（指定标记）以识别它们，并尽可能将对照小鼠和未来治疗的小鼠放在同一个笼子中，以尽量减少笼子效应。
2.当天，将小鼠放入馅饼笼中并转移到照射器中。该过程必须在幕后进行，并且所有材料都必须经过消毒。为了符合该设施的特定无病原体条件，应将小鼠转移到无菌转移箱中至辐照器。
3.为了消融受体小鼠的造血系统，进行单剂量的亚致死照射。这是通过用 6 Gy （600 拉德）的全身照射剂量照射 8-12 周龄的 RAG2KO 小鼠来实现的。
4.Anios对盒子外部消毒至少 10 分钟）。
5.照射后，在 6-12 小时内重建小鼠。为了重建受辐射的小鼠，使用 BD U-100 胰岛素注射器通过眼眶静脉静脉注射200 万个来自 WT 或 SKO 小鼠的 T 细胞耗尽的骨髓细胞，溶解在 200 μL PBS中。为了最大限度地减少小鼠的压力和不适，请在麻醉室中用异氟烷麻醉小鼠。
6.照射后，由于小鼠经历大量的免疫抑制，因此容易受到感染，因此应将这些动物饲养在无菌环境中。对于重组小鼠来说，在照射后的前 14 天内定期观察尤其重要，以识别任何疼痛或痛苦的迹象。如果动物因任何原因表现出痛苦的迹象（稀便、直肠出血或持续弯腰驼背的姿势），道德决定是对它们实施安乐死以减轻疼痛和痛苦。需要强调的是，重组小鼠故意不服用抗生素，因为这会对 SMAD4 缺陷重组小鼠 IBD 的发展产生不利影响(Igalouzene et al., 2022) 。
7.骨髓重建后等待 21 天，让供体造血细胞在受体体内建立，然后进行 T 细胞去除。
每周对小鼠称重两次，以确定它们相对于初始体重是否正在减轻。这客观地表明小鼠患有慢性肠道炎症。

C.体内 CD8αβ+ 和 CD4+ T 细胞耗竭

1.骨髓重建后第 21 天，向每只小鼠腹腔注射 150 μg以下抗体之一（溶于 200 μL PBS 1×）：抗 CD8β 抗体（克隆 53-5.8）、抗 CD4 抗体（克隆 GK1.5 ））、大鼠 IgG1 同种型对照抗体（克隆 HRPN）或大鼠 IgG2b 同种型对照抗体（克隆 LTF-2）（图 3）。

图 3. 实验组。该图是使用 BioRender.com 创建的。

2.每周重复注射一次，直到 SMAD4 缺陷小鼠的体重减轻约 15% – 20%，并且必须被安乐死并进行分析。经过照射和重建后，SKO重建小鼠一般在5 ~ 7周后发病，出现稀便、腹泻、直肠出血、驼背、体重减轻15% ~ 20%。可以收获结肠、小肠和肠系膜淋巴结用于组织学或流式细胞术分析。
3.除了每周两次监测体重外，每周至少监测小鼠的健康状况三次，以便及时、合乎道德地进行干预。仔细检查小鼠是否有不适迹象，例如社交孤立、驼背姿势、不动、粪便中带血、粪便松散、外观皱褶或蓬乱。

数据分析

1.体重减轻表明肠道炎症的严重程度。在整个实验过程中，小鼠每周称重两次，并与初始体重相比计算体重减轻的百分比。读者可阅读Igalouzene等人的文章。 (2022)和本手稿的图 2，了解 CD8αβ+ T 细胞的消除如何防止骨髓移植的 SKO 小鼠发生严重的肠道炎症。需要提醒的是，出于道德原因，初始体重下降 20% 的小鼠在 24 小时内与相应的对照一起被安乐死。安乐死后，收集结肠、小肠和肠系膜淋巴结用于进一步分析。
2.结肠长度也是指示慢性炎症严重程度的参数。使用尺子确定冒号长度。与同龄和性别的小鼠相比，较短的结肠与严重的肠道炎症有关（ Igalouzene等人，2022 年和图 5）。

图 4. 结肠和小肠内特定删除的验证。代表性流式细胞术图显示用 WT 或 SMAD4 缺陷骨髓细胞重建并注射同种型或抗 CD8β（克隆 53）的受辐射 RAG2KO 小鼠结肠和小肠内 CD4+ 和 CD8αβ+ T 细胞和 CD8αα+ T 细胞的频率-5.8) 或抗 CD4（克隆 GK1.5）消耗抗体。

图 5.骨髓移植小鼠肠道炎症分析：结肠长度。用 WT 或 SMAD4 缺陷型骨髓细胞重建并注射同种型或抗 CD8β 或抗 CD4 消耗抗体的受辐射 RAG2KO 小鼠的结肠照片。结肠尺寸的减小是严重慢性肠道炎症的征兆。

3.炎症的组织学评估也可以按照 Erben 等人的建议进行。（2014）。简而言之，结肠和小肠用2%甲醛（VWR）处理固定，然后包埋在石蜡中并切片。对组织切片进行苏木精和伊红染色。我们使用基于以下标准的系统评分系统以盲法评估肠道炎症：结肠长度、炎症细胞浸润的程度和分布、隐窝增生、隐窝内中性粒细胞的存在、隐窝脓肿的发生、糜烂、肉芽组织的形成和绒毛变钝。请参阅Igalouzene等人。（2022）查看一些图像示例和 Erben 等人。（2014）如果您渴望了解有关该程序的更多信息。在Igalouzene等人中。 (2022)，组织学检查表明，用抗 CD8β 治疗的 SKO BM/移植小鼠中，免疫细胞浸润减少，并且没有增生和隐窝脓肿（ Igalouzene等人，2022，图 2D 和 2E，以及补充图 4B）。
4.可以进行流式细胞术分析。使用与体内消耗过程中应用的抗体克隆不同的抗体克隆。具体而言，可以采用抗CD8β（克隆YTS156.7.7）和抗CD4（克隆RM4.5）来标记细胞。为了分析指示炎症的中性粒细胞浸润，请使用抗 Ly6g 和抗 CD11b APC 抗体。使用流式细胞仪获取细胞。根据 FSC-A 和 SSC-A 对事件进行门控，然后对 FSC-A 和 FSC-H 进行门控以排除双峰。通过对 LIVE/DEAD 可固定染色呈阴性的细胞进行门控来消除死细胞。然后，重点关注与免疫细胞相对应的 CD45+ 细胞。例如，CD45+CD8αβ+T细胞代表CD8αβ+T细胞。 CD8αβ T 细胞的成功消耗通过抗 CD8β 治疗的小鼠中 CD8αβ T 细胞完全缺失来证明（见图 2）。重要的是，没有观察到其他群体（ TCR γδ + 和 CD8aa+ T 细胞）的消除，表明消除的特异性（图 4）。

通过使用该方案，我们确定 CD8αβ+ T 细胞是 SMAD4 缺陷小鼠中驱动肠道严重炎症的重要效应器（Igalouzene 等人，2022），为 T 细胞群在这种复杂疾病中的作用提供了新的见解。传统 CD8αβ+ T 细胞的消耗减轻了炎症的发生（体重减轻、结肠长度减少），这可以通过上皮内中性粒细胞 (CD11b+Ly6g+) 募集的减少和结肠长度的减少来证明（图 5-6）（参见Igalouzene等人，2022 了解更多详情）。下面列出了一些示例，说明如何分析 T 细胞耗竭对炎症的影响；这些例子并不详尽。

图 6. 骨髓移植小鼠肠道炎症分析：中性粒细胞浸润。代表性流式细胞术图显示中性粒细胞 CD11b+Ly6g+ 在结肠和小肠上皮内动员的频率。

协议验证

对于包括体重减轻、结肠长度、组织学评分和细胞计数在内的代表性数据，我们建议读者参考Igalouzene等人 (2022) 的图 2 和 8 以及补充图 2、3 和 4。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

所有溶液、培养基、材料和缓冲液均应无菌并根据标准方案制备。必须在无菌条件下进行隔离程序以避免污染。此外，快速工作并始终将缓冲液和细胞悬浮液保持在 4°C，以防止细胞死亡。
骨髓移植小鼠模型的使用加速了肠道病理的发生，使研究人员能够在不需要长期治疗的情况下解决问题。这种方法显着减少了与长期抗体治疗相关的潜在副作用，因为病理学在短期内出现；因此，无需对小鼠进行长期治疗。此外，这促进了相似性别和年龄的小鼠慢性炎症发展的同步，从而提高了研究的精确度和可比性。
从供体骨髓细胞中消除 T 细胞是为了防止已在供体中条件化的 T 细胞转移，从而绕过移植小鼠体内自然引发的炎症，从而可能加速和加剧病理学。重组小鼠体内供体骨髓细胞中存在的干细胞将产生新的 T 细胞，从而提供炎症发作的更忠实的自然再现。
值得注意的是，为了精确耗尽传统 CD8αβ T 细胞，同时保留表达常见标记物 CD8α 的其他细胞类型，研究人员可以利用本方案中执行的 CD8β 耗尽抗体（克隆：53-5.8），这与其他细胞类型不同使用 CD8 α消耗抗体进行的研究可消耗大量非特异性免疫群体（图 4）。

致谢

这里描述的协议改编自我们之前发表的工作（ Igalouzene等人，2022）。这项工作得到了癌症研究协会 (ARC) (PJA20181207928-PJA20151203509-ARCDOC42020070002550) 的支持。感谢P-PAC动物平台对小鼠的照顾以及CRCL的流式细胞仪平台。

利益争夺

作者声明不存在竞争性经济利益。

道德考虑

实验按照欧盟动物护理指南（ARRIVE）进行，并得到当地动物伦理评估委员会（ CECCAPP ）和法国研究部的验证。

参考

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