材料与试剂

生物材料

感兴趣的细胞系获自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。在这项研究中，我们使用结肠癌细胞系 HCT116。

试剂

1.嘌呤霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P9620）
2.PBS（Sigma-Aldrich，目录号：D1408）
3.完全抗蛋白酶（Roche，目录号：11836145001）
4.奶粉（Régilait，目录号：304934416704）
5.牛血清白蛋白（BSA）（Roche，目录号：10735094001）
6.DC 蛋白测定试剂盒（Bio-Rad，目录号：5000111）
7.预染蛋白梯（Euromedex，目录号：06P-0111）
8.Immobilion Forte 蛋白质印迹基质（Merck Millipore，目录号：WBLUF0500）
9.丽春红溶液（Sigma-Aldrich，目录号：141194）
10.小鼠抗嘌呤霉素抗体（克隆12D10）（Merck Millipore，目录号：MABE343）
11.小鼠抗微管蛋白抗体（克隆 DM1A）（Sigma，目录号：T6199）
12.HRP 缀合的抗小鼠二抗（Cell Signaling Technology，目录号：7076）
13.剥离缓冲液（Thermo Scientific，目录号：21059）

解决方案

1.RIPA 蛋白裂解缓冲液 2 × （参见配方）
2.Tris 缓冲盐水-吐温 (TBS-T)（参见食谱）
a.TBS-T 5% BSA（参见配方）
b.TBS-T 5% 奶粉（参见食谱）
3.Laemmli 6 × （参见食谱）

食谱

1.RIPA 蛋白裂解缓冲液 2 ×
试剂最终浓度
Tris-HCl pH 7.2100毫米
氯化钠300毫米
乙二胺四乙酸10毫米
脱氧胆酸钠2%
十二烷基硫酸钠 20%0.1%
海卫一 100 ×2 ×
钠3 VO 44毫米
β甘油磷酸酯20毫米
氟化钠20毫米
完全抗蛋白酶2 ×
在 H 2 O中稀释至 1 × 。

2.Tris 缓冲盐水-吐温 (TBS-T)
试剂最终浓度
Tris-HCl pH 7.550毫米
氯化钠
吐温150毫米
0.1%
添加5% BSA 或奶粉，分别获得TBS-T 5% BSA 或5% 奶粉。

3.莱姆利 6 ×
试剂最终浓度
Tris-HCl pH 6.80.5M
甘油1%
十二烷基硫酸钠 20%2%
数码地面电视0.6M
溴酚蓝0.4%

实验室用品

1.6 孔或 10 cm 直径组织培养板
2.无菌刮刀
3.微量离心管
4.保鲜膜

设备

1.组织培养装置（组织培养罩、CO 2培养箱等）
2.移液器和微量移液器
3.真空泵
4.离心机（4℃）
5.冷室
6.加热块
7.Western blotting仪器（SDS-PAGE电泳盒、电源、摇床、转膜盒、硝酸纤维素膜等）
8.ChemiDoc 成像系统（Bio-Rad，目录号：12003153）

软件和数据集

1.斐济（国立卫生研究院）

程序

A.嘌呤霉素体外掺入

1.实验前一天接种 HTC116 细胞，并维持在 37°C 和 5% CO 2下，以允许附着到组织培养板。在图 2 所示的实验中，6 孔板中每孔接种 200,000 个细胞。
2.实验当天，将研究的处理方法应用于细胞所需的时间。
3.收获前和处理结束前 15 分钟，将细胞暴露于直接在培养基中稀释的 5 μg/mL 嘌呤霉素。所有样品必须与相同浓度的嘌呤霉素一起孵育相同的时间。

B.蛋白质提取物

1.与嘌呤霉素孵育 15 分钟后，除去培养基并用冷 PBS 冲洗细胞一次。
2.将组织培养板置于冰上，与含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 1 × RIPA 蛋白裂解缓冲液（参见配方）（1 体积的 1 × RIPA 对应 1 体积的细胞沉淀）孵育 20 分钟。
3.刮下细胞并收集在微量离心管中。
4.以 13,000× g离心 20 分钟以除去细胞碎片。
5.将上清液收集到新的微量离心管中，并添加适当体积的 Laemmli 6 ×（参见配方）。
6.根据制造商的说明，使用 DC 蛋白质测定试剂盒定量提取蛋白质。
7.添加适当体积的 Laemmli 1 ×以标准化所有样品中的蛋白质浓度，并通过在 95°C 下加热 5 分钟来变性。

C.蛋白质印迹法

1.在 10% SDS-PAGE 凝胶上加载所有研究条件下的 20 μg 蛋白质。我们建议添加 5 μL蛋白质梯来估计可视化蛋白质的分子量。
2.分离后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，作为标准蛋白质印迹实验方案。电泳前用丽春红溶液染色以检查等量蛋白上样量。
3.TBS-T 5%奶粉在室温下封闭膜1 小时，并轻轻摇动。
4.用 TBS-T 在摇床上洗涤 5 分钟，重复操作两次。
5.将嘌呤霉素抗体以 1/10,000 稀释到 TBS-T 5% BSA 中，在温和摇床上于 4°C 孵育过夜。
6.用 TBS-T 在摇床上洗涤 5 分钟，重复操作两次。
7.将 HRP 标记的抗小鼠二抗（1/10,000 稀释度）加入 TBS-T 5% 奶粉中，室温孵育 1 小时。
8.用 TBS-T 在摇床上洗涤 5 分钟，重复操作两次。
9.用纸巾轻轻擦干膜，然后将其正面朝上平放在保鲜膜上。
10.直接将 Immobilion Forte Western 底物添加到整个膜上。
11.使用 ChemiDoc 成像系统检测化学发光（图 2）。涂片的强度取决于细胞掺入嘌呤霉素的能力，因此代表蛋白质合成率。
12.在 TBS-T 中冲洗膜并转移到 5 mL 剥离缓冲液中。
13.避光并充分搅拌 15 分钟。通过验证 ChemiDoc 成像系统上未检测到化学发光信号来检查所有结合的抗体是否已分离。
14.用 TBS-T 5% 奶粉在室温下轻轻摇动封闭膜 30 分钟。
15.将抗微管蛋白抗体稀释到 TBS-T 5% 奶粉中，室温孵育 1 小时。
16.用 TBS-T 在摇床上洗涤 5 分钟，重复操作两次。
17.将 HRP 标记的抗小鼠二抗（1/10,000 稀释度）加入 TBS-T 5% 奶粉中，室温孵育 1 小时。
18.用 TBS-T 在摇床上清洗 5 分钟，重复操作两次。
19.用纸巾轻轻擦干膜，然后将其正面朝上平放在保鲜膜上。
20.直接添加 1 mL Immobilion Forte Western 底物以覆盖整个膜。
21.使用 ChemiDoc 成像系统检测化学发光（图 2）。条带的强度与电泳前的蛋白质上样量成正比。
22.可以使用 Fiji 软件对嘌呤霉素和微管蛋白信号进行定量（请参阅数据分析部分）。

图 2. SUnSET 测定证明用 GCN2 激酶抑制剂治疗后蛋白质合成受到抑制。 HCT116 细胞用 GCN2 激酶抑制剂（GCN2i 也称为 TAP20）处理或不处理 24 小时，并在蛋白质提取前 15 分钟暴露于嘌呤霉素 (5 μg/mL)。使用抗嘌呤霉素抗体（Puro）通过蛋白质印迹分析评估蛋白质翻译率。微管蛋白在此作为加载对照提供。相应的分子量显示在蛋白质印迹的右侧。结果摘自 Piecyk 等人。（2023）。左侧数据的量化表示平均值±SEM (n = 3)。具有 p 值的不配对双尾 t 检验 (** p < 0.01)。

数据分析

1.打开斐济软件。
2.单击“文件”菜单查找 SUnSET 实验的 ChemiDoc 图像。
3.使用矩形工具在第一个涂片周围绘制一个框架，以量化和定义感兴趣的区域。
4.在“分析”菜单中，选择“凝胶”并选择“第一泳道” 。
5.将部分移至下一个泳道，然后在“分析”菜单中选择“凝胶”和“选择下一个泳道” 。
6.对每个通道重复该操作。
7.在“分析/凝胶”菜单中选择“绘制泳道”以创建每个泳道剖面图。
8.直线选择工具为每个峰绘制基线，为每个泳道图定义一个封闭区域。
9.使用棒工具单击内部测量每个峰面积。
10.结果表中报告面积测量结果。
11.重复此过程进行微管蛋白信号定量。
12.归一化：对于每个泳道，计算 SUnSET 面积/微管蛋白面积的比率。
13.比较每个泳道中观察到的比率，以评估研究条件对蛋白质合成率的影响。

协议验证

该协议改编自原始文章：Schmidt 等人。（2009）。 Chaveroux博士小组（Sarcinelli 等人，2020 年；Piecyk 等人，2021 和 2023）以及文献中其他团队（例如 Martineau 等人， 2014；Mesclon 等人，2017；Arioka 等人，2020；Fong 等人，2021）。 SUnSET 原理已适用于体内和离体应用（Goodman 等人，2011 年；Morral 等人，2020 年），并且在单细胞水平上与流式细胞术结合，由 Pierre 博士的团队进行能量代谢评估（ Argüello ）等人，2020）。

致谢

这项工作得到了 Cancéropôle CLARA (CVPPRCAN000174、CVPPRCAB000180 和 CV-2021-039)、奥弗涅罗讷 - 阿尔卑斯地区 (19-010898-01)、国家癌症研究所 (PLBIO22-227)、Projets 基金会和 Aide 博士 (R16173CC) 的支持，ARCMD-Doc22021020003295），来自 ARC、国家癌症防治联盟 (R17167CC、R19007CC)、弗朗索瓦·拉伯雷融合研究所 (17IA66ANR-PLASCAN-MEHLEN) 和 IPR（创新制药与研究）计划。图 1 是使用 BioRender.com 创建的。该协议改编自原始文章：Schmidt et al., 2009。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

Arguello，RJ，Combes，AJ，Char，R，Gigan，J-P，Baaziz，AI，Bousiquot，E，Camosseto，V，Samad，B，Tsui，J，Yan，P 等。（2020）。 SCENITH：一种基于流式细胞术的方法，以单细胞分辨率对能量代谢进行功能分析。细胞代谢32(6):1063–1075.e7。 https://doi.org/10.1016/j.cmet.2020.11.007
Arioka, Y.、Shishido, E.、Kushima, I.、Suzuki, T.、Saito, R.、Aiba, A.、Mori, D. 和 Ozaki, N. (2020)。染色体 22q11.2 缺失导致多巴胺能神经元 PERK 依赖性脆弱性。 EBioMedicine 63： 103138
Fong MY、Yan W.、Ghassemian, M.、Wu, X.、Zhou, X.、Cao, M.、Jiang, L.、Wang, J.、Liu, X.、Zhang, J.等等人。（2021）。癌症分泌的 miRNA 调节氨基酸诱导的 mTORC1 信号传导和成纤维细胞蛋白合成。 EMBO 报告22(2)：e51239。 https://doi.org/10.15252/embr.202051239
Goodman, CA、Mabrey, DM、Frey, JW、Miu, MH、Schmidt, EK、Pierre, P. 和 Hornberger, TA (2011)。一种新的非放射性体内技术揭示了对骨骼肌蛋白质合成调节的新见解。 FASEB J 25(3): 1028–1039。 https://doi.org/10.1096/fj.10-168799
Martineau, Y.、Azar, R.、Müller, D.、Lasfargues, C.、El Khawand, S.、Anesia, R.、Pelletier, J.、Bousquet, C. 和 Pyronnet, S. (2014)。胰腺肿瘤通过 4E-BP1 缺失逃脱翻译控制。 Oncogene 33(11)：第 11 条。https://doi.org/10.1038/onc.2013.100
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Piecyk, M.、Triki, M.、Laval, P.-A.、Duret, C.、Fauvre, J.、Cussonneau, L.、Machon, C.、Guitton, J.、Rama, N.、Gibert, B.，等人。（2023）。应激传感器 GCN2 根据营养状况差异性地控制结肠癌中的核糖体生物合成。摩尔安科尔。 https://doi.org/10.1002/1878-0261.13491
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