材料与试剂

生物材料

1.白色念珠菌BWP17（Wilson 等人，1999）
2.酿酒酵母BY4742（Winston 等人，1995）

试剂

1.硫磺素 T（Sigma-Aldrich，目录号：T3516-5g）
2.二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：276855-250 mL）
3.M-280 Dynabeads ，甲苯磺酰激活磁珠（ Thermo Fisher Scientific，目录号：14204）
4.牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9418）
5.伴刀豆球蛋白 A，Alexa Fluor TM 594 缀合物（ Thermo Fisher Scientific，目录号：C11253）
6.RNase A溶液（Promega，目录号：A7973）
7.Triton TM X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100-100ML）
8.蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389-500G）
9.10% Criterion TM XT Bis-Tris 蛋白质凝胶（Bio-Rad，目录号：3450112）
10.Bio-Rad 蛋白质测定染料试剂浓缩物（Bradford）（Bio-Rad，目录号：5000006）
11.聚-L-赖氨酸溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P8920）
12.Aclar ®包埋膜（TED PELLA, INC，目录号：10501-10）
13.Gibco TM RPMI 1640 培养基（ Thermo Fisher Scientific，目录号：10379144）
14.杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水（PBS）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：11590476）
15.无水乙醇（Merck，目录号：1009831011）
16.氯化镁（Sigma-Aldrich，目录号：208337-100G）
17.Nonidet P-40（Sigma-Aldrich，目录号：I8896）
18.cComplete ，不含 EDTA 蛋白酶抑制剂片（Roche，目录号：11873580001）
19.苯甲基磺酰氟（PMSF）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：36978）
20.甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516-100ML）
21.十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：62862）
22.二硫苏糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：D0632-1G）
23.Tris盐酸盐（ Thermo Fisher Scientific，目录号：15893661）
24.氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S9888-500G）
25.溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126-25G）
26.Bradford 试剂（Bio-Rad，目录号：500205）
27.Bacto TM酵母提取物（ Thermo Fisher Scientific，目录号：212750）
28.Bacto TM蛋白胨（ Thermo Fisher Scientific，目录号：211677）
29.葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D9434-1KG）
30.不含氨基酸的酵母氮基（Sigma-Aldrich，目录号：Y0626-1KG）
31.葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270-1KG）
32.精氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A5006-100G）
33.尿苷（Sigma-Aldrich，目录号：U3750-25G）
34.组氨酸（Merck，目录号：H3911）
35.不含尿嘧啶的酵母合成脱落培养基补充剂（Sigma-Aldrich，目录号：Y1501-20G）

解决方案

1.硫黄素 T 溶液 ( ThT )（参见食谱）
2.硫磺素 T 缓冲液（参见配方）
3.裂解缓冲液（参见配方）
4.淀粉样蛋白-朊病毒重悬缓冲液（参见配方）
5.淀粉样蛋白-朊病毒缓冲液 R （参见食谱）
6.YPD 培养基（参见食谱）
7.SD 完全培养基（参见食谱）
8.SC-Ura 培养基（参见食谱）

食谱

1.硫黄素 T 溶液 (3.3 mM)
试剂最终浓度数量
硫黄素T3.3毫米10.53毫克
无水乙醇不适用10毫升
全部的不适用10毫升
用铝箔保护硫代黄素 T 溶液避光，并将溶液在 -20°C 下保存长达六个月。

2.硫黄素T缓冲液
试剂最终浓度数量
Tris 盐酸盐（1 M，pH 8.0）20毫米200μL _ _
氯化钠 (5 M)150毫米300μL _ _
硫黄素 T (3.3 mM)40微米_121微升_
蒸馏水_ _不适用9.4毫升
全部的不适用10毫升
每次实验前新鲜制备硫代黄素 T 缓冲液。

3.裂解缓冲液
试剂最终浓度数量
Tris 盐酸盐（1 M，pH 7.5）50毫米750μL _ _
氯化钠 (5 M)150毫米450μL _ _
氯化镁 (1 M)5毫米75微升_
诺奈德P-400.1%15μL _ _
PMSF (200 mM)1毫米75微升_
完全蛋白酶抑制剂不适用2 粒
蒸馏水_ _不适用13.6毫升
全部的不适用15毫升
cOmplete蛋白酶抑制剂片剂）的裂解缓冲液在 4°C 下保存最多两个月。每次实验前新鲜添加蛋白酶抑制剂。

4.淀粉样蛋白-朊病毒重悬缓冲液
试剂最终浓度数量
Tris 盐酸盐（1 M，pH 7.5）50毫米350μL _ _
氯化钠 (5 M)100毫米140μL _ _
安全数据表 (20%)2%700μL _ _
二硫苏糖醇 (1 M)5毫米35微升_
甘油5%350μL _ _
完全蛋白酶抑制剂不适用1 片
蒸馏水_ _不适用5.4毫升
全部的不适用7毫升
将淀粉样蛋白-朊病毒重悬浮缓冲液在 4°C 下储存八周，不含二硫苏糖醇和蛋白酶抑制剂。二硫苏糖醇和蛋白酶抑制剂片剂均应在实验开始前添加。

5.淀粉样蛋白-朊病毒缓冲液R
试剂最终浓度数量
Tris 盐酸盐（1 M，pH 7.5）10毫米100μL _ _
安全数据表 (20%)0.4%200μL _ _
二硫苏糖醇（DTT，1 M）5毫米50μL _ _
蒸馏水_ _不适用9.7毫升
全部的不适用10毫升
淀粉样蛋白-朊病毒缓冲液R可以在室温下保存三个月。在开始实验之前添加二硫苏糖醇。

6.YPD培养基
试剂最终浓度数量
Bacto TM酵母抽提物1%10克
Bacto TM蛋白胨
葡萄糖
蒸馏水_ _2%
2%
不适用20克
20克
qs 。至 1 升
全部的不适用1升

7.SD完全培养基
试剂最终浓度数量
不含氨基酸的酵母氮碱0.67%6.7克
葡萄糖
精氨酸 (2 毫克/毫升)
尿苷 (4 毫克/毫升)2%
20毫克/毫升
40毫克/毫升20克
10毫升
10毫升
组氨酸 (2 毫克/毫升)20毫克/毫升10毫升
蒸馏水_ _不适用qs 。至 1 升
全部的不适用1升

8.SC-Ura培养基
试剂最终浓度数量
不含氨基酸的酵母氮碱0.67%6.7克
葡萄糖2%20克
不含尿嘧啶的酵母合成脱落培养基补充剂0.1%1克
蒸馏水_ _不适用qs 。至 1 升
全部的不适用1升

实验室用品

1.1.5 mL Eppendorf 管（Eppendorf，目录号：0030125207）
2.50 mL Falcon TM管（Fisher Scientific，目录号：10203001）
3.TPP® 96 孔板（Merck，目录号：Z707902-108EA ）
4.培养板12孔TPP（ Dutscher ，目录号：109212）
5.1.5 mL 螺旋盖微管（Fisher Scientific，目录号：11549924）
6.玻璃珠 0.5 mm，酸洗（Sigma-Aldrich，目录号：G8772-100 G）
7.培养皿 35 毫米（Greiner，目录号：P5112）
8.超速离心聚丙烯管（Beckman-Coulter，目录号：331372）
9.载玻片（Merck，目录号：S9027-1CS）
10.盖玻片（VWR，目录号：43210.KG）
11.离心瓶（Beckman-Coulter，目录号：C31600）
12.塑料比色皿 BRAND TM （Fisher Scientific，目录号：10566581）

设备

1.酶标仪（TECAN，型号：Infinite® 200 PRO）
2.微量离心机（Eppendorf，目录号：Z606235）
3.超速离心机 OPTIMA XPN（Beckman-Coulter，目录号：A94468）
4.正置共焦显微镜（蔡司，型号：LSM700）
5.ThermoMixer ® C（Eppendorf，目录号：5382000015）
6.Sorvall RC-5B 离心机（ Thermo Fisher Scientific，目录号：sorvall-RC-5B）
7.涡旋混合器（VWR，目录号：444-1372）
8.离心机 5810（Eppendorf，目录号： 5810000010)
9.显微镜（蔡司，型号：落射荧光ApoTome ）
10.分光光度计（GE Ultrospec TM 2100 pro，目录号：GE80211221）
11.Bullet Blender Storm Pro（Next Advance，目录号：152081）
12.2 L 锥形烧瓶（VWR，目录号：10545-844）
13.电泳电源（Bio-Rad，型号：200/2.0）
14.微型转移印迹电泳转移池（Bio-Rad，目录号：1703930）
15.水浴（Cole-Parmer，目录号：WB-300-15）
16.台式管旋转器RotoFlex （Cole-Parmer，目录号：120VAC）
17.Multitron摇床 ( Infors HT)

软件和数据集

1.斐济 ImageJ 软件（ https://imagej.net/software/fiji/downloads ）

程序

A.目标蛋白质中淀粉样蛋白形成区域的鉴定和验证

1.Uniprot数据库 ( https://www.uniprot.org/ )下载目标蛋白的完整氨基酸序列。
2.将所研究蛋白质的一级序列复制并粘贴到 TANGO 淀粉样蛋白预测工具( http://tango.crg.es/ ) 上。该软件将预测一级序列中淀粉样蛋白形成区域的存在，从而预测蛋白质组装为淀粉样蛋白结构的潜力。
注意：TANGO为序列中的每个氨基酸提供了β聚集潜力。氨基酸的β-聚集潜力越高，它参与淀粉样蛋白结构形成的可能性就越大。此步骤将允许鉴定蛋白质一级序列内可能参与淀粉样蛋白形成的区域。在我们的研究中，我们选择了β聚集潜力等于或优于 30% 的区域。
3.订购与步骤 A2 中识别的区域相对应的肽。所有肽均从Thermo Fisher Scientific订购。
注意：所有肽的 N 末端和 C 末端必须分别具有乙酰基和酰胺基。这些修饰避免了在肽中引入带电基团以及其被外肽酶降解。
4.将肽以 18,000 ×离心 g 1 分钟，以确保所有粉末都位于管底部。将每个肽以 100 μM的浓度重新悬浮在 DMSO（储备溶液）中。
暂停点：方案可以在此步骤停止，并将肽溶液在 4°C 下保存长达一个月。
注意：确保粉末通过移液或涡旋充分重悬。
5.稀释至 5 μM的终浓度。将 100 μ L稀释肽一式三份分布在 96 孔板中。应将由 DMSO、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl 和 40 μM硫代黄素 T组成的溶液添加到板中作为阴性对照。
注意：硫磺素 T 以 3.3 mM 的浓度重悬于无水乙醇中。
6.将 96 孔板在 Tecan Infinite 读板器中于 37°C 孵育 16 小时。
注：设置参数以每小时记录硫代黄素 T 荧光，激发波长为 440 nm，发射波长为 496 nm 。

B.重组全长蛋白淀粉样蛋白结构组装的评价

1.表达并纯化感兴趣的重组蛋白。
关键点：重组蛋白纯化后应尽快使用，避免多肽链降解和/或随机聚集。
笔记：
a.由于存在多种表达和随后纯化重组蛋白的方法，我们不能推荐一种独特的途径来生产高纯度的目的蛋白。蛋白质表达和纯化对应于试错过程。如果蛋白质的行为未知，则应测试几种表达系统（大肠杆菌、毕赤酵母、杆状病毒表达系统、中国仓鼠卵巢哺乳动物细胞系）生产所需数量（1 mg/mL）重组蛋白的能力。我们使用 pET28a 表达 His 6 -Pga59 大肠杆菌洗牌应变（洛布斯坦等人，2012）。
b.应仔细设计适当的层析策略，以达到高达 95% 的蛋白质纯度。在我们的例子中，蛋白质用含有 6 M 盐酸胍的溶液从包涵体中溶解，通过透析重折叠，并通过亲和层析（ α -HIS 标签）纯化。强烈建议使用 MALDI-TOF 质谱分析来评估蛋白质的纯度。
2.将重组蛋白在透析缓冲液中稀释 10 倍（最终体积：100 μL ）。将稀释的蛋白质转移到石英比色皿中，并使用紫外分光光度法在 280 nm 处测量其浓度。
注意：由于重组蛋白是在单体形式下纯化的，因此蛋白浓度必须保持较低（5-10 mM），以避免不必要的随机聚集。
注：浓度根据比尔-朗伯定律 A = ε lc确定，其中 A 为 280 nm 处的吸光度， ε为摩尔消光系数，l 为光路长度，c 为浓度。 ε可以通过在Expasy中插入蛋白质的一级序列来计算 ProtParam工具（ https://web.expasy.org/protparam/ ）。如果蛋白质没有芳香族残基（色氨酸、组氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸），则应在 214 nm 处测量吸光度（肽键的吸光度）。
3.在 300 μL硫黄素 T 缓冲液中将重组蛋白稀释至 5 μM ，并将每种混合物一式三份( 3 × 100 μL )分布在 96 孔板中。
关键点：在开始硫黄素 T 染色测定之前，重组蛋白必须以单体形式存在。用混合物中预先存在的聚集体开始淀粉样蛋白生成会损害淀粉样蛋白的组装，从而损害硫黄素 T 染色的结果。
4.如步骤 A6 中所述，将板在 Tecan Infinite 读板器中于 37°C 下孵育 16 小时。每小时测量一次荧光以监测淀粉样蛋白生成。

C.粘附后完整真菌细胞上淀粉样蛋白结构的硫黄素 T 染色

1.将分离的白色念珠菌菌落接种于 4 mL YPD 培养基中，并在 30 °C 下摇动 (220 rpm) 孵育过夜。
注：根据目的蛋白，应构建适当的遗传背景来进行C部分的实验（如敲除细胞）。
2.白色念珠菌预培养的同一天，用 PBS 清洗 200 μL磁珠两次。
3.将珠子重新悬浮在 1 mL 热变性 BSA (1 mg/mL) 中，并在台式旋转器上于 37°C 孵育过夜。
注意：要使 BSA 变性，请将溶液在 70°C 水浴中孵育 1 小时。
4.第二天，将 20 μL培养物稀释在 980 μL YPD中。转移到 1 mL 塑料比色皿中并测量 600 nm 处的光密度 OD (OD 600 )。
注意：如果细胞稀释液的 OD 600高于 1，则很可能位于分光光度计的线性区域之外。因此，为了准确了解细胞数量，应进一步稀释样品，使其 OD 600在 0.1 至 1 之间。
5.在 5 mL 新鲜 YPD 培养基中将过夜培养物稀释至 OD 600为 0.3。然后，在 30°C 摇动（220 rpm）下将细胞再孵育 4 小时。
ThT染色之前，细胞应处于对数中期（OD 600约为 0.8 或 1）。
6.将 10 8 个酵母细胞在 956× g下离心4 分钟，并用无菌 PBS 清洗两次。
注：细胞数量通过用分光光度计测量 OD 600来确定。 1 毫升 OD 600为 1 的白色念珠菌培养物对应于 2 × 10 7 个真菌细胞。
7.将真菌细胞重新悬浮在 1 mL 的 SD 完全培养基中，其中含有 25 μM的ThT和用热变性 BSA 处理的 10 6磁珠。将细胞在室温下在台式旋转器上孵育 1 小时。
注意：在此步骤中，可以在野生型菌株上评估淀粉样肽对真菌粘附的影响白色念珠菌。为此，完全按照步骤 C1–C5 中所述进行，但在步骤 C6 中在 SD 介质中添加 5 μM的感兴趣的肽。
8.将 10 μL真菌细胞滴在载玻片上，并在液滴顶部添加盖玻片。通过使用落射荧光显微镜的蓝色滤光片记录ThT信号来观察淀粉样蛋白结构的存在。

D.酿酒酵母中淀粉样蛋白的异源表达

注意：如果目标蛋白与宿主生物体的其他蛋白之间出现过多冗余，则使用ThT染色观察表型可能非常困难。一种替代方案是在另一种微生物（例如酿酒酵母）中异源表达该蛋白质。

1.将分离菌落中的酿酒酵母接种到 4 mL SC-Ura 培养基中，并在 30°C 下孵育过夜。如步骤 C2 中所述准备磁珠。
2.第二天，将 20 μL过夜培养物稀释在 980 μL YPD中，将整个体积转移到塑料比色皿中，并测量 OD 600 nm 。
3.在 4 mL 的新鲜 SC-Ura 介质中将酿酒酵母细胞的预培养物稀释至 OD 600 0.5。在 30°C 下搅拌 (220 rpm) 孵育细胞 4 小时。
4.将酵母细胞以 956× g离心 3 分钟，并将所得沉淀重悬于 1 mL SC-Ura 培养基中。
5.6 BSA 包被磁珠和 25 μM ThT处理细胞悬浮液。将混合物在台式旋转器上室温孵育 1 小时。
注意：在此步骤中，可以添加针对特定细胞区室的荧光染料，以利用 ThT 生成的信号进行共定位实验。由于我们感兴趣的淀粉样蛋白在细胞壁中组装，因此我们使用 Concanavalin A Alexa Fluor 594 缀合物作为细胞壁标记物。
6.将细胞以 956× g离心 3 分钟，并用 1 mL PBS 洗涤沉淀两次。
7.在载玻片上添加一滴真菌细胞 (10 μL )，并盖上盖玻片。使用带有蓝色滤光片的落射荧光显微镜监测ThT信号。

E.从真菌细胞中分离淀粉样物质

淀粉样蛋白生成的影响，可以通过细胞分级分离完整的淀粉样蛋白材料（ Kryndushkin等人，2017），然后用硫黄素 T 染色。我们使用这种方法来显示淀粉样蛋白的形成粘附时白色念珠菌。

1.将真菌细胞接种到 50 mL 的 YPD 培养基中，并在搅拌（220 rpm）下将烧瓶在 30°C 下孵育过夜。
注意：如步骤 C2 中所述，用热变性 BSA 制备珠子溶液。
2.第二天，按照步骤 C3 中所述测量预培养物的OD 600 。
3.在 1 L YPD 培养基中将过夜培养物稀释至 OD 600为 0.3。将细胞在 30°C 下振荡 (220 rpm) 孵育 4 小时。
注意：为了确保真菌细胞良好的氧合，1 L YPD 培养应在两个 2 L (2 × 500 mL)的烧瓶中进行。
4.将培养物转移到 500 mL 离心瓶中，并以 956× g离心（ Sorvall离心机）真菌细胞10 分钟。
5.将沉淀重新悬浮在 50 mL SD 培养基中，并将细胞悬浮液转移到 50 mL Falcon 管中。将 1.25 × 10 7 BSA 包被的珠子添加到混合物中（阴性对照除外），并将 Falcon 管插入台式旋转器上。室温孵育细胞 1 小时。
6.将真菌细胞以956× g离心 4 分钟（Eppendorf 5810 R 离心机）。丢弃上清液并将颗粒储存在-80°C直至需要。
暂停点：冷冻颗粒可以在-80°C 下保存数月，然后进行淀粉样蛋白提取处理。
7.在冰上解冻沉淀并用冷 PBS 洗涤一次。 956× g离心4 分钟，弃去上清液。
8.用 4 mL 裂解缓冲液重新悬浮颗粒，并将整个体积分配到 1.5 mL 螺帽管中（每管 600 μ L ）。向每个螺旋盖管中添加 200 μL 0.5 mm 玻璃珠。
9.使用 Bullet Blender 珠搅拌器以全速运行 1 分钟，循环六次，以机械方式破碎酵母细胞。将蛋白质混合物在台式离心机中于 4°C 下以 800 × g离心 5 分钟。取出含有淀粉样物质的上清液，并将其转移到干净的 1.5 mL Eppendorf 管中。
注意：在每个循环之间，将裂解物在冰上孵育 1 分钟。
10.将蛋白质提取物与 RNase A (0.1 mg/mL) 在室温下孵育 10 分钟。添加 Triton X-100，终浓度为 0.5%，并在冰上孵育 10 分钟。将裂解液在 4°C 下以 2,000× g离心 10 分钟。丢弃沉淀并将上清液转移到新的 1.5 mL Eppendorf 管中。
11.将上一步的上清液加载到 2 mL 蔗糖层 (40%) 上。将样品在 4°C 下以 200,000 × g离心 2 小时。
注意：此步骤务必使用超速离心管，以避免塑料在 200,000 ×下塌陷 G 。
12.用移液器上下移液，将沉淀重新悬浮在 200 μL 淀粉样蛋白-朊病毒重悬缓冲液中。将混合物在ThermoMixer设备中 37°C 下孵育 10 分钟，无需摇动。
13.将溶液在台式离心机中以 5,000 × g离心 10 分钟。将所得上清液保存在 1.5 mL Eppendorf 管中并丢弃沉淀。
14.每 100 μL淀粉样蛋白制剂，添加 0.01% 溴酚蓝和 5% 甘油。充分混合并将溶液加载到 10% 聚丙烯酰胺凝胶上。首先在 70 V 下运行凝胶 15 分钟，然后切换至 200 V 运行 40 分钟。根据您的样品量使用尽可能多的孔。
15.将聚丙烯酰胺凝胶用蒸馏水清洗一次，然后用手术刀切掉堆积凝胶的顶部（3 mm）。将每个样品的所有凝胶部分汇集在 1.5 mL Eppendorf 管中，并在 -20°C 下冷冻凝胶方块至少 20 分钟。
16.随后向每个管中添加 200 μL淀粉样蛋白-朊病毒缓冲液 R，涡旋 10 秒，并在 98°C 孵育 15 分钟。然后，以 4,000 × g涡旋并离心1 分钟。取出上清液并将其滴入新的 1.5 mL 管中。重复此步骤两次。
注意：必须合并所有上清液。
17.使用经典布拉德福德测定法量化每个样品中的蛋白质。
暂停点：此时，可以停止方案，并将淀粉样蛋白储存在-20°C，直到进行硫黄素 T 染色测定。
18.在 300 μL硫黄素 T 缓冲液中稀释富含淀粉样蛋白的级分，终浓度为 100 μM 。将 100 μL淀粉样蛋白组分一式三份分布在 96 孔板中。由 DMSO、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl 和 40 μM硫代黄素 T组成的溶液应用作阴性对照。
19.将 96 孔板在 Tecan Infinite 读板器中于 37°C 孵育 16 小时。每小时记录ThT荧光。

F.白色念珠菌完整生物膜中淀粉样蛋白结构的存在

注意：白色念珠菌生物膜可以在塑料表面（ Aclar膜）上生长，然后用ThT染色，然后用共焦显微镜成像以观察淀粉样蛋白结构的存在。

1.将白色念珠菌细胞接种于 4 mL YPD 培养基中，并在 30°C 下孵育过夜。
2.用新鲜制备的聚-L-赖氨酸溶液 (0.1%) 在 37°C 下涂覆Aclar膜 30 分钟。用蒸馏水清洗Aclar薄膜两次，将其切成小方块（1 cm × 1 cm），最后在紫外灯下每面消毒 15 min。
3.第二天，用无菌 PBS 清洗酵母细胞两次，并在 RPMI 培养基中将真菌细胞稀释至 1.10 6 个细胞/mL。
注意： RPMI 介质在使用前应预热至 37°C。
4.将无菌Aclar薄膜方块放入 12 孔组织培养板的孔中。将 3 mL 稀释的细胞添加到每个孔中。
5.在Infors HT Multitron中将真菌细胞在 37°C 下孵育 1 小时，并适度摇动 (110 rpm) ，以使白色念珠菌粘附到塑料表面。然后，用 1 mL 无菌 PBS 清洗孔两次，去除非贴壁细胞，并用 3 mL 预热的 RPMI 介质（37°C）填充。
6.将培养板在 37°C、110 rpm 下孵育 48 小时。
7.用 PBS 清洗成熟生物膜一次，并用 2 mL 含有 25 μM ThT的PBS染色。
注意：为了防止生物膜从Aclar膜上脱落，应轻轻清洗真菌群落。
8.用 PBS 清洗生物膜两次，并将其转移到 35 mm 培养皿中。用 2 mL 的 PBS覆盖白色念珠菌生物膜，并使用共聚焦显微镜的蓝色通道进行图像。
临界点：显微镜的物镜将浸入培养基中。为避免任何损坏，请务必使用浸没物镜。
×浸没物镜在 LSM700 立式上记录 Z 堆栈。然后我们使用 Fiji ImageJ 软件重建体积。

数据分析

对于 A-E 部分，每个实验的示例已发表在 Mourer 等人的文章中。（2023）。图1总结了分步协议。
I) 关于来自白色念珠菌的肽、重组蛋白或富含淀粉样蛋白的级分的体外测定（ A、B 和 E 部分），随着时间的推移，通过ThT荧光监测淀粉样蛋白结构的形成或存在。 ThT荧光越高，孔中形成的淀粉样蛋白结构越多。如果可能，添加无法形成淀粉样蛋白的肽或蛋白质作为空白的额外阴性对照。在每个实验结束时：
( i ) 计算每个样品三次重复的硫黄素 T 强度值的平均值。
(ii) 进行统计分析以检查差异是否相关。重复该实验三次，每种肽/蛋白质进行三次技术重复。使用学生t检验对样本进行两两比较。

图1。评估蛋白质形成淀粉样蛋白的倾向必须连续遵循的方案步骤摘要。该方案还将评估淀粉样蛋白在体内的相关性以及它们在生物膜形成中的参与。

II) 对于体内染色（C、D 和 F 部分），淀粉样蛋白结构的存在由 ThT 发出的蓝色荧光指示。根据所研究的蛋白质或酵母菌株的基因型， ThT模式可能会发生巨大变化。我们建议遵循以下常规进行数据分析：
( i ) 首先使用 40倍物镜以相当低的放大倍数观察真菌细胞，以评估某些蛋白质的丢失对淀粉样蛋白形成的影响，使用ThT荧光强度作为群体水平淀粉样蛋白含量的读数；事实上，荧光水平与细胞中产生的淀粉样蛋白的数量相关。
× )记录至少 100 个细胞的图片。
(iii) 计算每种条件下阳性细胞的数量。
(iv) 以独立方式重复实验至少三次并进行统计分析（使用学生t检验进行两两比较）。
(v)得出关于靶蛋白与体内淀粉样蛋白形成和生物膜形成的相关性的结论。
(vi) 然后，切换到 100 ×物镜观察细胞内淀粉样蛋白的精确定位。细胞区室特异的荧光标记可用于评估与ThT荧光的共定位，作为该特定区室中淀粉样物质存在的指示。实验必须用三个独立的生物重复进行。

III) 包含候选蛋白淀粉样蛋白形成区域的肽也可用于野生型菌株的体内ThT染色（C 部分）。遵循与 II 中所述相同的程序。
野生型和突变型肽的影响将通过ThT荧光强度进行监测。如果肽刺激淀粉样蛋白组装，则处理细胞中的ThT荧光将高于未处理对照细胞中的荧光。相反，用抑制淀粉样蛋白组装的肽（例如突变肽）处理细胞将导致比未处理的对照更低的ThT荧光。
最后，通过使用该协议，我们还可以评估淀粉样蛋白结构与生物膜建立的相关性。白色念珠菌生物膜可以很容易地用ThT染色，然后用共焦显微镜成像以记录完整生物膜的 Z 堆栈。根据酵母细胞的基因型，生物膜的形状和厚度都可以与构成生物膜的酵母细胞的淀粉样蛋白含量相关。将生物膜形状、厚度和ThT荧光强度与野生型菌株生物膜进行比较，将揭示给定的突变是否影响淀粉样蛋白的形成，从而影响生物膜的建立。图2显示了ThT生物膜染色的示例，我们可以在其中看到形状、高度和淀粉样蛋白（ ThT染色为白色）。实验应使用独立的生物复制品重复三次。在此步骤中，了解如何在您的研究所或大学提供的共焦显微镜上记录 Z 堆栈非常重要。此外，用户还需要了解如何使用 Fiji ImageJ 软件通过 Z 堆栈重建 2D 图像。

图 2. 硫黄素T ( ThT ) 完整真菌生物膜染色。让白色念珠菌细胞在Aclar薄膜上附着1 小时。然后真菌生物膜在 37°C 的 RPMI 中温和摇动下生长。 48小时后，用含有25mM ThT的PBS溶液对淀粉样蛋白结构进行染色。然后用共焦显微镜在蓝色通道中记录生物膜的 Z 堆叠。显示了生物膜的顶视图（左部分）和侧视图（右部分）。比例尺：10 毫米。

协议验证

开发该方案是为了评估真菌候选蛋白是否可以在体内和体外自组装形成淀粉样蛋白结构。如果是这样，则可以通过遵循本方案的 F 部分来评估蛋白质对于生物膜建立或维持的生理相关性。除了完整生物膜的ThT染色外，所有实验程序均在 Mourer 等人，2023 年的图 1C、2C、3C、4A 和 B、5B 和 7 中进行了验证（doi： 10.1038 /s41522-023-00371-x）。对于体内白色念珠菌完整生物膜的ThT染色，参见本手稿的图 2。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.应仔细确定对真菌细胞进行ThT染色的培养条件。事实上，经历浮游生长的白色念珠菌实际上不产生淀粉样蛋白结构。细胞应在淀粉样蛋白组装活跃的条件下培养，例如磁珠触发的细胞粘附。否则，所有用ThT对真菌细胞上的淀粉样纤维进行染色的尝试都将失败。
2.ThT荧光将在落射荧光或共聚焦显微镜的蓝色通道中记录。所得图像的信号很弱，有时难以分析。为了更好地可视化，请使用Fiji ImageJ 软件使用通道工具选项将图像颜色从蓝色切换为黄色。将此更改应用于所有显微图像。

故障排除

1.确保用于纯化重组蛋白的缓冲液在蓝色通道（B 部分）中不发出自发荧光。这会产生错误的结果。
2.淀粉样蛋白生成过程中重组蛋白的浓度应保持较低（B 节）。高浓度的蛋白质会干扰淀粉样蛋白的组装并产生无政府状态的聚集体。
3.纯化倾向于以单体形式聚集的蛋白质是一个繁琐的过程，可能会因缺乏进行实验的生物样本而导致项目失败。如果实验者在生产蛋白质单体时遇到困难，可以用六氟异丙醇（HFIP）处理纯化产物。该化合物将抑制无定形聚集体的形成，从而在开始体外硫黄素 T 测定之前使蛋白质保持单体形式（B 部分）。
4.体内染色淀粉样蛋白所需的ThT浓度可能会根据细胞模型而变化（C 部分）。根据所使用的微生物，淀粉样蛋白含量可能会发生变化，因此，应调整ThT浓度以实现有效染色。
5.E部分中从真菌细胞中提取了少量淀粉样物质。根据生长条件，白色念珠菌细胞可能难以裂解，因此在裂解步骤中从细胞中提取了少量蛋白质。如果发生这种情况，请勿跳过 -80 °C 的冷冻步骤（步骤 E6）。冷冻会在膜中产生冰晶，这将对细胞裂解产生积极影响。此外，为了提高细胞裂解效率，请在细胞上添加更多玻璃珠（400 μL而不是 200 μL ）。
6.一些淀粉样蛋白结构可能对含有 SDS 的缓冲液敏感，导致提取方案后淀粉样蛋白的回收量较低（E 部分）。如果淀粉样蛋白结构对 SDS 处理敏感，则应更换淀粉样蛋白-朊病毒重悬缓冲液以及淀粉样蛋白-朊病毒 R 缓冲液中的去污剂。我们建议将两种缓冲液中的 SDS 替换为 1% Sarkosyl 。
7.白色念珠菌细胞不能很好地附着在塑料表面，使得共焦显微镜成像变得复杂。为了解决这个问题，有两种解决方案：( i )增加步骤F2中聚-L-赖氨酸的量或(ii)选择另一种细胞外基质蛋白(例如纤连蛋白)来包被Aclar膜(步骤F2)。

致谢

研究所巴斯德-坎塔里尼博士后奖学金的获得者。这项工作得到了法国政府投资局的支持 d'Avenir计划（实验室新发传染病卓越综合生物学，ANR-10-LABX-62-IBEID）。图形概述和图 1 是使用 BioRender.com 创建的。 Mourer 等人已使用该协议。 (2023)， doi ：10.1038/s41522-023-00371-x 。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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