材料与试剂

生物材料

1.HEK293T（ATCC，目录号：CRL-3216）适用于无血清培养基；或者，向通讯作者索取BalanCD HEK293 无血清培养基适应的HEK293T 细胞 (1F11S)
2.pAdΔF6 辅助质粒（ Addgene ，目录号：112867）
3.pAAV2/9 Rep/Cap 质粒（ Addgene ，目录号：112865）
4.AV0-EF1-N-cG（对照 AAV 转移质粒）（ Addgene ，目录号：192888）或 AV0-EF1-N-tdT （ Addgene ，目录号：192889）
5.脱氧核糖核酸酶I （Sigma-Aldrich，目录号：DN25-1G）
6.RNase A（ Thermo Fisher Scientific，目录号：BP25391）
7.正向 qPCR 引物，例如 WPRE 或其他载体特异性引物（Sigma-Aldrich，WPRE-172 核苷酸序列：TTTATGAGGAGTTGTGGCCC）
8.反向 qPCR 引物，例如 WPRE 或其他载体特异性引物（Sigma-Aldrich，WPRE-392 核苷酸序列：CAACACCACGGAATTGTCAG）

试剂

1.BalanCD HEK293 介质液体或粉末（Fujifilm Irvine Scientific，目录号分别：91165 或 94137）
2.GlutaMAX （ Thermo Fisher Scientific，目录号：35050061）
3.100 × Pluronic F-68（ Thermo Fisher Scientific，目录号：24040032）
4.VirusGEN AAV 转染试剂盒（Mirus Bio，目录号：MIR 6750）
5.1 M Tris-HCl pH 8.0（ Thermo Fisher Scientific，目录号：AAJ22638AP）
6.氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：BP35810）
7.MgCl 2 Sigma-Aldrich，目录号：442611-500GM）
8.KCl （Sigma-Aldrich，目录号：1049360250）
9.1 M DTT（ Thermo Fisher Scientific，目录号：11-101-3992）
10.甘油（ Thermo Fisher Scientific，目录号：J62399.AP或同等产品）
11.脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：D6750）
12.HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3784）
13.Sarcosyl （VWR，目录号：D719-500G）
14.EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
15.PEG8000（Sigma-Aldrich，目录号：P2139-2KG）
16.OptiPrep密度梯度（ Thermo Fisher Scientific，目录号：NC1174452）
17.酚红（Sigma-Aldrich，目录号：P0290-100ML）
18.DPBS（ Gendepot ，目录号：CA008-300或同等产品）
19.HyPure 分子生物学级水（ Thermo Fisher Scientific，目录号：SH3053802 或同等产品）
20.SYBR Green SuperMix （VWR，目录号：101414-168）
21.碳酸氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S6014-500G）
22.台盼蓝（ Thermo Fisher Scientific，目录号：15250061）

解决方案

1.完整的BalanCD HEK293 介质 (c- BalanCD HEK293) （参见配方 1）
2.DNase I 溶液（参见配方 2）
3.RNase A 溶液（参见配方 3）
4.2 M MgCl 2 （参见配方 4）
5.5 M 氯化钠（参见配方 5）
6.2.5 M 氯化钠（参见配方 6）
7.40% PEG8000/2.5 M NaCl（参见配方 7）
8.TMN（参见配方 8）
9.HBS（参见配方 9）
10.5% 脱氧胆酸钠（参见配方 10）
11.PBS-MK（参见配方 11）
12.PBS-NMK（参见配方 12）
13.DPBS/Pluronic F-68（参见配方 13）
14.BalanCD HEK293 介质 — 重构粉末（参见配方 14）

食谱

1.c- BalanCD HEK293 媒体
试剂最终浓度数量
BalanCD HEK293 [或BalanCD HEK293 — 重构粉末（参见配方 14）]不适用97毫升
100 × 谷氨酸最大4毫米2毫升
100 ×普朗尼克 F-681 ×1毫升
全部的不适用100毫升
将此溶液储存在 2–4 °C 下。有关此配方的替代方案，请参阅一般注释 1。

2.DNA酶I溶液
试剂最终浓度数量
1 M Tris-HCl pH 7.620毫米2毫升
氯化钠50毫米0.2922克
甘油50%（体积/体积）50毫升
1M DTT1毫米100微升
脱氧核糖核酸酶I10毫克/毫升1克
水蒸气_ _不适用添加至 100 mL
全部的不适用100毫升
将 pH 值调整至 7.6（参见一般说明 2）。有关 ddH 2 O的更多信息，请参阅一般注释 3。将此溶液等分到 1.5 mL微量离心管中，并储存在-20 °C 下。

3.核糖核酸酶 A 溶液
试剂最终浓度数量
1 M Tris-HCl pH 7.510毫米1毫升
氯化钠15毫米87.66毫克
核糖核酸酶A10毫克/毫升1克
水蒸气_ _不适用添加至 100 mL
全部的不适用100毫升
将 pH 值调整至 7.5。将该溶液等分到 1.5 mL微量离心管中，并储存在-20 °C 下。

4.2M 氯化镁2
试剂最终浓度数量
氯化镁22M95.211克
水蒸气_ _不适用添加至 500 mL
全部的2M500毫升
为 0.22 µm 的过滤器进行过滤。将此溶液储存在室温下。

5.5M 氯化钠
试剂最终浓度数量
氯化钠5M292.2克
水蒸气_ _不适用添加至 1,000 mL
全部的5M1,000 毫升
为 0.22 µm 的过滤器进行过滤。将此溶液储存在室温下。

6.2.5M 氯化钠
试剂最终浓度数量
氯化钠2.5M73.05克
水蒸气_ _不适用添加至 500 mL
全部的2.5M500毫升
将此溶液储存在室温下。

7.40% PEG 8000/2.5 M 氯化钠
试剂最终浓度数量
5 M 氯化钠（参见配方 5）2.5M500毫升
聚乙二醇800040%400克
水蒸气_ _不适用添加至 1,000 mL
全部的不适用1,000 毫升
在过滤 40% PEG 8000/2.5 M NaCl 溶液之前，用 2.5 mL 2.5 M NaCl 灌注0.22 µm 孔径过滤器。由于溶液的粘度，过滤需要一个多小时。室温保存。

8.TMN
试剂最终浓度数量
1 M Tris-HCl pH 8.050毫米50毫升
2M 氯化镁25毫米2.5毫升
氯化钠150毫米8.77克
水蒸气_ _不适用添加至 1,000 mL
全部的不适用1,000 毫升
将溶液 pH 调节至 8.0。使用孔径为 0.22 µm 的过滤器进行过滤。将此溶液储存在室温下。

9.哈佛商学院
试剂最终浓度数量
HEPES50毫米2.980克
氯化钠150毫米2.192克
肌酰基1%2.5克
乙二胺四乙酸20毫米1.46克
水蒸气_ _不适用添加至 250 mL
全部的不适用250毫升
将溶液 pH 调节至 8.0。使用孔径为 0.22 µm 的过滤器进行过滤。将此溶液储存在室温下。

10.5%脱氧胆酸钠
试剂最终浓度数量
脱氧胆酸钠5%28.2克
水蒸气_ _不适用添加至 500 mL
全部的5%500毫升
为 0.22 µm 的过滤器进行过滤。将此溶液储存在室温下。避光。

11.PBS-MK
试剂最终浓度数量
氯化镁22.7毫米263毫克
氯化钾2毫米149.1毫克
磷酸盐缓冲溶液不适用添加至 1,000 mL
全部的不适用1,000 毫升
为 0.22 µm 的过滤器进行过滤。将此溶液储存在2–4 °C 下。

12.PBS-NMK
试剂最终浓度数量
氯化钠1M29.2克
氯化镁22.7毫米131.5毫克
氯化钾2米74.55毫克
磷酸盐缓冲溶液不适用添加至 500 mL
全部的不适用500毫升
为 0.22 µm 的过滤器进行过滤。将此溶液储存在2–4 °C 下。

13.DPBS/0.001% Pluronic F-68
试剂最终浓度数量
1 × DPBS不适用500毫升
100 ×普朗尼克 F-680.001%50微升
全部的不适用500毫升
将此溶液储存在2–4 °C 下。

14.BalanCD HEK293 介质 — 粉末重构
试剂最终浓度数量
BalanCD HEK293 粉末不适用21.32克
碳酸氢钠2.20克
水蒸气_ _不适用添加至 1,000 mL
全部的不适用1,000 毫升
确保溶液的 pH 值在 6.7 至 7.4 之间，渗透压在 280 至 320 mOsm /kg 之间。使用孔径为 0.22 µm 的过滤器进行过滤。将此溶液在 2–4 °C 下保存长达一年。

实验室用品

1.Pipet-X 移液器控制器（ Rainin ，目录号： 17011733 或同等产品）
2.20 µL 移液器（ Rainin ，目录号：17008650 或同等产品）
3.200 µL 移液器（ Rainin ，目录号：17008652 或同等产品）
4.1000 µL 移液器（ Rainin ，目录号：17008653 或同等产品）
5.过滤的 20 µL 移液器吸头（ Rainin ，目录号：30389274 或同等产品）
6.过滤的 200 µL 移液器吸头（ Rainin ，目录号：30389276 或同等产品）
7.过滤的 1000 µL 移液器吸头（ Rainin ，目录号：30389272 或同等产品）
8.125 mL 带挡板的锥形烧瓶（Sigma-Aldrich，目录号：CLS431404-1EA）
9.250 mL 带挡板的锥形烧瓶（VWR，目录号：75993-572）
10.0.6 mL微量离心管（ Thermo Fisher Scientific，目录号：05-408-120）
11.1.5 mL微量离心管（ Thermo Fisher Scientific，目录号：05-408-129）
12.0.5 mL微量离心管（ Thermo Fisher Scientific，目录号：02-707-357）
13.微管架（ Thermo Fisher Scientific，目录号：22-313630）
14.Countess细胞计数室载玻片（ Thermo Fisher Scientific，目录号：C10228）
15.24孔聚苯乙烯微孔板（ Thermo Fisher Scientific，目录号：08-772-1）
16.15 mL 聚丙烯离心管（VWR，目录号：89039-666）
17.15 mL 钢丝架（ Thermo Fisher Scientific，目录号：3422306）
18.50 mL 钢丝架（ Thermo Fisher Scientific，目录号：FB147916A）
19.250 mL 聚丙烯离心管（ Thermo Fisher Scientific，目录号：05-538-53）
20.0.22 µm 瓶顶过滤器（Genesee Scientific，目录号：25-235）
21.10 mL 血清移液器（VWR，目录号：29443-047）
22.5 mL 血清移液器（VWR，目录号：29442-422）
23.Amicon离心过滤装置（Sigma-Aldrich，目录号：UFC910024）
24.5 mL无菌注射器（ Thermo Fisher Scientific，目录号：14955458）
25.20 G无菌皮下注射针（ Thermo Fisher Scientific，目录号：14-817-209）
26.薄壁聚丙烯离心管（Beckman Coulter，目录号：326823）
27.96孔qPCR板（Genesee Scientific，目录号：27-105）
28.qPCR 板带盖（VWR，目录号：ST401425）
29.细尖标记（ Thermo Fisher Scientific，目录号：19-166-600）
30.酒精湿巾（ Thermo Fisher Scientific，目录号：22-037790）

设备

1.生物安全柜（ NuAire LabGard ，II 类，A2 型，目录号 NU-540-400UB10 或同等产品）
2.耐CO 2摇床平台（ Thermo Scientific，目录号：88881103 或同等产品）
3.安捷伦 qPCR 机（安捷伦，型号：MX30005P 或同等产品）
4.Countess 自动细胞计数器（Invitrogen，目录号：C10281 或同等产品）
5.伸入式 CO 2培养箱（Cell IQ，目录号：MCO-80ICL-PA 或同等产品）
6.Avanti J-15R 台式离心机（Beckman Coulter，目录号：B99517 或同等产品）
7.JS-4750 水平转子（Beckman Coulter，目录号：B77580 或同等产品）
8.直径 60 毫米的瓶子适配器（Beckman Coulter，目录号：392079 或同等产品）
9.18 mm 直径管适配器（Beckman Coulter，目录号：359473 或同等产品）
10.Avanti JXN-26 离心机（Beckman Coulter，目录号：B38619 或同等产品）
11.JA-25.50 定角转子（Beckman Coulter，目录号：363058 或同等产品）
12.JS-5.3 水平转子（Beckman Coulter，目录号：368690 或同等产品）
13.Optima XPN-90 超速离心机（Beckman Coulter，目录号：A99842 或同等产品）
14.SW32Ti 水平转子套件（Beckman Coulter，目录号：369694 或同等产品）
15.-80 ℃冷冻柜（ PHCbi ，型号：MDF-DU502VHA-PA）
16.水浴（ Thermo Fisher Scientific，目录号：FSGPD10或同等产品）
17.Microfuge 18 离心机（Beckman Coulter，目录号：BE-M18C 或同等产品）
18.试管摇杆（ Thermo Fisher Scientific，目录号：12-815-6Q 或同等产品）
19.（可选）Millipore Biopak抛光机（Sigma-Aldrich，目录号：CDUFBI001）
20.（可选） Millipak Express 20 过滤器（Sigma-Aldrich，目录号：MPGP02001）

软件和数据集

1.MxPro —Mx3005P（版本 4.10，2/15/23）

程序

A.除霜和电池维护

1.将细胞解冻到 30 mL 温热的 c- BalanCD HEK293 介质（参见配方 1）中，放入 125 mL 带挡板的锥形烧瓶中。
注意：如果您使用 HEK293T 细胞并自行适应无血清培养基，请查看补充信息 1，了解有关如何使细胞适应 c- BalanCD HEK293培养基的更多信息。
2.将烧瓶放在37 °C和 5% CO 2培养箱中的摇床平台上，转速为 120 rpm。
3.每隔一天计数细胞密度，并根据需要用 c- BalanCD HEK 293 培养基稀释细胞，以将细胞密度维持在 3 × 10 5活细胞/mL 和 3 × 10 6活细胞/ mL 之间。可能需要每周至少进行两次稀释（稀释到新的、干净的 125 mL 带挡板锥形烧瓶中）。按照后续步骤使用 Countess 自动细胞计数器（或同等设备）对细胞进行计数并检查细胞活力：
a.获得 0.6 mL 微量离心管 (MCT)。
b.将 10 µL 台盼蓝等分到 0.6 mL MCT 中。
c.从摇床平台上取下 125 mL 带挡板的锥形烧瓶。
d.旋转烧瓶，然后从 125 mL 带挡板的锥形烧瓶中取出 10 µL 等份细胞。
e.将 125 mL 挡板 Erlenmeyer 烧瓶中的 10 μL 等分试样添加到 0.6 mL MCT 中的 10 μL 台盼蓝中。
f.回流细胞/台盼蓝混合物。
g.将10 µL 细胞/台盼蓝混合物移至 Countess 细胞计数室载玻片上。
h.将室载玻片插入自动细胞计数器并记下活细胞计数和细胞活力。
注意：明智的做法是系统地记录这些细胞计数和细胞活力，以便您可以在整个细胞维护过程中监测细胞的生长和稳健性。
暂停点：细胞可以以这种方式持续维持，直到您准备好接种和转染。

B.接种烧瓶（第 1 天）

1.在 37°C 水浴中加热 c- BalanCD HEK293 介质。
2.用 1 接种到 250 mL 有挡板的锥形烧瓶中 × 10 6活细胞/mL，共 90 mL c- BalanCD HEK293 介质。
注意：细胞从最初的 30 mL 维持体积扩大到适合转染的更大的 90 mL 体积。
3.将 250 mL 带挡板的锥形瓶放在 37 °C 和 5% CO 2培养箱中的摇床平台上，转速为 120 rpm。

C.转染（第 2 天）

1.确保先前接种的 250 mL 带挡板锥形烧瓶的细胞密度达到 1.0–2 × 10 6活细胞/mL（接种后 1 天）。按照步骤 A3h 中的方法确定细胞计数。
2.将 0.5 mL 细胞悬液转移至 24 孔板作为阴性对照。
注意：对于包含荧光标记的 AAV 转移质粒，这是可选的。
3.VirusGEN中的 9 mL 复合物形成溶液和增强剂 (CFSE) AAV 转染试剂盒。至 15 mL 离心管。
4.将适量的质粒 DNA 添加到15 mL 离心管中的 CFSE 中，轻轻回流混合 10 s。表 1 显示 DNA数量转染混合物的每种成分都需要。

表 1. DNA 数量（ Challis 等人，2019）
质粒对于 1 mL 细胞对于 90 mL 细胞
辅助质粒 (AdΔF6)0.57微克51.3微克
AAV Rep/Cap 质粒1.13微克101.7 微克
AAV 穿梭载体0.30微克27微克
总DNA2微克180微克

5.将 270 µL Trans It-VirusGen转染试剂（每 1 mL 细胞 3 µL）添加到 CFSE/DNA 混合物中，轻轻回流以充分混合。
6.让转染混合物在室温下孵育 30 分钟。
7.孵育期结束后，轻轻回流转染混合物并直接添加到 250 mL 烧瓶中，同时手动旋转烧瓶。
8.将 250 mL 带挡板的锥形瓶放回37 °C和 5% CO 2培养箱中的摇床平台上，转速为 120 rpm。

D.72 小时后收获（第 5 天）

1.（可选）将0.5 mL细胞悬液转移至24孔板中，观察荧光蛋白表达（如果存在）。请参见图 1，了解具有荧光标记的转基因质粒的典型转染效率。

图 1. 通过荧光测量转染效率。该图像是使用 GFP 滤光片（左图）拍摄的，并覆盖有明场图像（右图）。

2.将 250 mL 带挡板的锥形瓶的全部内容物（这应该是大约 10 0 mL 细胞/介质悬浮液）转移到新标记的 250 mL 离心管中。
3.用 24 mL 的 DPBS 清洗烧瓶，并与细胞/介质悬浮液混合。
4.在室温下以 335× g离心细胞/培养基悬浮液10 分钟。请参见图2了解其外观。

图2. AV0-EF1-N-tdT 转染 72 小时后离心的细胞沉淀和上清液
E.消化（第 5 天）

1.小心地将上清液倒入新标记的 250 mL 瓶中，小心不要扰动细胞沉淀。
注意：上清液和细胞沉淀分别平行处理，因为两者都含有 AAV。该消化阶段期间的步骤（用于上清液的步骤E2 和用于细胞沉淀的步骤E3）将用于从细胞沉淀或上清液中提取病毒。经过平行处理后，来自细胞沉淀和上清液的粗制病毒最终将合并并加载到一个OptiPrep梯度上以进行进一步纯化/浓缩，因此需要同时处理/处理它们。
2.对于上清液，完成以下步骤：
a.向装有上清液的新 250 mL 瓶中添加 150 µL DNase I 溶液（参见配方 2）、150 µL RNase A 溶液（参见配方 3）和 200 µL MgCl 2 （参见配方 4）。
b.倒置离心管混匀，在37 ℃ 、5%CO 2培养箱中孵育1小时。
c.1 小时后，每 100 mL 消化上清液添加 25 mL 40% PEG 8000/2.5 M NaCl（参见配方 7）。
d.翻转瓶子至少 20 次以混合并储存在 4°C 下直至纯化。
暂停点：上清液在纯化之前可以在 4 °C 下最多停留两周。
3.对于细胞沉淀，请完成以下步骤：
a.将细胞沉淀重悬于 8 mL TMN 中（参见配方 8）。
b.将离心管底部敲击细胞培养罩的金属表面，松开沉淀。
c.使用移液器控制器将细胞沉淀重新悬浮在 TMN 中，并将混合物转移至 15 mL 离心管中。
d.添加 10%（体积）的 5% 脱氧胆酸钠（参见配方 3）并在室温下摇动 30 分钟。
e.添加 200 µL 2 M MgCl 2 、150 µL DNase I 溶液和 150 µL RNase A 溶液。
f.混合并在 37°C 水浴中孵育 1 小时。每 15 分钟涡旋一次管。
g.-80°C 冷冻直至纯化。
暂停点：细胞沉淀悬浮液在纯化之前可以保持在-80°C。

F.纯化准备（第 6 天）

1.准备纯化时，对上清液完成以下步骤：
a.4°C 冰箱中取出 250 mL 离心管，并在 4 °C下以 410× g离心30 分钟。
b.小心吸出上清液，确保底部的沉淀完好无损。
c.将 2.5 mL 的HBS（参见配方 9）添加到沉淀中。
d.将离心管底部敲击细胞培养罩的金属表面，松开沉淀。
e.使用移液器控制器将颗粒重新悬浮在 HBS 中，并将混合物转移到 15 mL 离心管中。
注意：用 HBS 均质时，沉淀可能会粘在 250 mL 离心管的底部。尽最大努力完全拾取沉淀，并确保沉淀的任何部分都不会粘在血清移液管上/内部。
f.涡旋 HBS/颗粒匀浆。
注意：此时颗粒不会在 HBS 内完全均质化，并且可能保持块状。这是可以接受的，因为颗粒应在下一步中溶解在 HBS 中。
g.将 15 mL 离心管放在摇床上并摇动，直到颗粒完全溶解在 HBS 中。这至少需要 2 小时，但可能会更长。
2.准备纯化时，对细胞沉淀完成以下步骤：
a.从-80°C冰箱中取出细胞沉淀悬浮液，并在37°C水浴中完全解冻。
b.解冻后，添加 100 µL DNase I溶液和 100 µL RNase A 溶液。
c.将悬浮液在 37°C 水浴中孵育 1 小时。
d.将细胞沉淀悬浮液在 4°C 下以 410× g离心 10 分钟。
3.小心地将澄清的细胞裂解液与溶解的 HBS/沉淀混合物混合。小心不要接触细胞沉淀溶液最初所在的 15 mL 离心管底部收集的任何细胞碎片。您现在应该有一个 15 mL 离心管，其中含有澄清的细胞沉淀悬浮液和HBS 混合物。
4.将此溶液立即放入 4 °C 冰箱中，直到形成纯化梯度，如下一步所述。

G.净化（第 6 天）

1.准备四种不同密度的溶液，用于创建OptiPrep纯化密度梯度。表 2 描述了这些溶液所需的OptiPrep 、PBS-MK（参见配方 11）或 PBS-NMK（参见配方 12）以及酚红的量。
OptiPrep溶液使用 PBS-NMK ，对于 25% OptiPrep和 40% OptiPrep溶液使用 PBS-MK 时要非常小心。

表 2. OptiPrep梯度组分
%优化准备60%优化准备缓冲酚红
15%4毫升12 mL PBS-NMK不适用
25%6.7毫升9.3 mL PBS-MK40微升
40%10毫升5 mL PBS-MK不适用
60%10毫升不适用25微升

2.向无菌薄壁聚丙烯离心管中，首先向管底添加 7 mL 15% OptiPrep （参见表 2）。
3.小心地将 5 mL 25% OptiPrep （参见表 2）铺在 15% OptiPrep层下方。
注意：小心移液，以免气泡扰乱先前存在的层。
4.小心地将 5 mL 40% OptiPrep （参见表 2）铺在 25% OptiPrep层下方。请参见图3了解该衬垫的外观。
注意：小心移液，以免气泡扰乱先前存在的层。

图3.OptiPrep底层。 _左图展示了 25% OptiPrep如何位于15% OptiPrep层下方（左图）。右图显示了 25% OptiPrep 层下方 40% OptiPrep的底层。

5.最后，小心地将 4 mL 60% OptiPrep （参见表 2）铺在 40% OptiPrep层下方。请参见图4 ，了解成功创建的渐变应该是什么样子。
注意：小心移液，以免气泡扰乱先前存在的层。

图4.完整梯度。每层的离散分离应该是可见的。顶部→底部：15%、25%、40% 和 60%

6.使用细尖标记勾勒出 40% OptiPrep层的顶部和底部界面，作为提取过程中的参考点。
7.从 4°C 冰箱中取出与 HBS/颗粒混合物混合的澄清细胞颗粒悬浮液。
8.将合并溶液的 15 mL 离心管在 4°C 下以 5,000× g离心 10 分钟。
9.小心地将组合溶液覆盖在OptiPrep梯度上。小心不要移出可能积聚在 15 mL 离心管底部的任何细胞碎片。请参见图5 ，了解组合解决方案叠加在顶部时的渐变效果。
注意：不要干扰您创建的密度梯度。调整移液速度，确保最上面的 15% OptiPrep层和您要覆盖的组合溶液之间的界面处不会出现任何干扰。

图5.超速离心前粗制病毒的梯度。该图显示了超速离心前加载的密度梯度管。顶层含有裂解物的 AAV 与 25% 层保持分离。

10.将薄壁聚丙烯离心管转移至超速离心机中的 SW32Ti 吊桶转子。
11.g离心15 小时（过夜离心）。
注意：确保您已充分平衡离心机以进行适当的纯化并防止设备故障/潜在的伤害。

H.带提取（第 7 天）

1.超速离心机停止后，从转子上取下薄壁聚丙烯离心管。
2.从适配器上取下薄壁聚丙烯离心管并将其放入支架中。超速离心后的梯度如图 6所示。

图6. 超速离心后的梯度。该图显示了超速离心后的离心管。每层的分离不再是离散的。

3.在架子上准备 50 mL 离心管。
4.将 20 G 无菌皮下注射针连接到 5 mL 无菌注射器。
5.使用酒精湿巾对穿刺位置（之前标记的40% OptiPrep层的底部界面）进行消毒。
6.OptiPrep层底部界面处施加均匀的压力并刺穿薄壁聚丙烯离心管。有关穿刺管位置的指导，请参见图7 。
注意：即使压力也很重要。管子不应泄漏任何东西，因为您会丢失病毒，也不应用力刺破薄壁聚丙烯离心管的另一部分。

图7.条带提取。该图显示了针应刺穿管子的位置。这代表 AAV 应该带状的 40%–60% 界面。

7.提取 4–4.5 mL 的OptiPrep溶液，小心不要意外提取任何可能在梯度中以不同密度沉淀的碎片。
8.将注射器中的内容物倒入预先准备好的 15 mL 离心管中。在将针头和注射器丢弃到适当的锐器容器中之前，请务必挤出尽可能多的提取溶液。
9.添加 45 mL 的DPBS/0.001% Pluronic F-68（参见配方 13）至 50 mL 离心管的 50 mL 标记，并置于4 °C。

I.病毒浓度（第 7 天）

1.将 15 mL 的DPBS/0.001% Pluronic F-68 添加到Amicon离心过滤器装置中，并使其在室温下平衡 15 分钟。
2.将Amicon过滤器在 20 °C 下以 2,096× g离心 2 分钟。大多数（但不是全部）DPBS/0.001% Pluronic F-68 应该流过收集池。
注意：最重要的是Amicon过滤器不会变干。否则，溶液将无法通过过滤器，病毒将无法浓缩。
3.将收集容器清空到废物桶中。
4.将 50 mL 离心管中稀释的 AAV 添加到Amicon过滤器中，并在 20°C 下以 2,096× g离心 A micon过滤器2 分钟。
5.在添加更多稀释的 AAV 之前，请清空收集池中的流通液。
6.重复前面的步骤 I3 和 I4。将稀释的 AAV 添加到Amicon过滤器中。在 20 °C 下以 2,096× g离心2 分钟，直至全部稀释样品均已应用于Amicon过滤器。
注意：您必须根据溶液过滤的速度来调整离心机的运行时间。不要让Amicon过滤器变干。
7.当稀释的 AAV 耗尽时，将 30 mL 的 DPBS/0.001% Pluronic F-68 添加到 50 mL 离心管中将其冲洗掉。
8.将 50 mL 离心管中的冲洗液添加至Amicon过滤器中，并在 20°C 下以 2,096× g离心2 分钟，直至冲洗液也耗尽。
9.2,096× g离心1 分钟，直至Amicon管中的液位达到 200 µL。
10.将整个 200 µL 纯化的 AAV 从Amicon过滤器转移到另一个管中，并在 4°C 下保存长达六个月。为了延长储存时间，将纯化的 AAV 等分成较小的数量并储存在 -80°C 下。

J.QPCR 检测基因组滴度（第 8 天）

1.用分子生物学级水制备 AV0-EF1-N-cG 标准储备液 (100 ng/μL) 的系列稀释液，覆盖 0.1 ng/μL（-1 稀释度）至 0.0001 ng/μL（-5 稀释度）。
2.用分子生物学级水制备 AAV 的系列稀释液，从 1:100（-2 稀释度）开始，到 1:100,000（-5 稀释度）结束。
3.使用 80 μL 分子生物学级水、10 μL 正向底漆和 10 μL 反向底漆制备底漆混合物。涡旋良好。
4.使用下表 3 中所示的比例准备预计孔数的 qPCR 混合物。

表 3. qPCR 反应混合物成分
试剂对于一个反应
2 × SYBR 绿色SuperMix10微升
底漆混合物1微升
分子生物学级水4微升
全部的15微升_

5.移液器 5 µL H 2 O 用于一式两份的非模板控制。
6.移取 5 µL 标准品，一式两份。
7.移取 5 µL 每种 AAV 病毒稀释液。
8.将 15 µL qPCR 反应混合物移至每个孔中。
9.将条形盖盖在每个孔上。确保盖子密封良好。
10.将 qPCR 板以 1,087× g离心 2 分钟以去除任何气泡（请参阅一般说明 4）。
11.将 PCR 板放入 qPCR 机中。
12.运行 qPCR 循环。
注意：对于此分析，安捷伦 qPCR 机器使用的 qPCR 循环是 40 个循环的标准预编程方法。每个循环包括以下内容：95 °C 30 秒（变性）、65 °C 1 分钟（退火）和 72 °C 1 分钟（延伸）。

数据分析

qPCR 循环运行后，您应该分析数据。在MxPro软件中，首先确保标准曲线的RSq尽可能接近1.000。如果不是，请移除使RSq远离 1.000的标准孔，直到该值尽可能接近 1.000。导出文本数据并使用 Deng 和 Oka (2020) 第 3.5.1 节（步骤 8）中的公式计算物理滴度：滴度 (vg/mL) = [ 1 × 10 12 × （以 ng/μL 为单位的浓度qPCR 软件）×（稀释因子）]/3.222 ng。请参阅一般注释 5，了解此公式将如何根据标准质粒的大小而变化。有关详细信息，请参阅补充信息 2。

协议验证

我们按照上述方案进行了五次独立的 AAV9 制备。下面的表 4 显示了每种制剂的相关信息。

表 4. AAV9制剂
矢量名称血清型转染时的细胞密度（活细胞/mL）转染时的活力90 mL 细胞悬浮培养物的滴度 (vg/mL)90 mL 细胞悬浮培养物中的总颗粒（vg）
AV0-EF1-N-cG腺相关病毒91.6×10 6 97%8.24×10 131.65×10 13
AV0-EF1-N-cG腺相关病毒91.3×10 697%1.04×10 142.08×10 13
AV0-EF1-N-cG腺相关病毒91.3×10 697%6.15×10 131.23×10 13
AV0-EF1-N-tdT腺相关病毒91.4×10 686%6.18×10 131.23×10 13
AV0-EF1-N-tdT腺相关病毒91.1×10 687%6.23×10 131.25×10 13
从该表中可以看出，每个制备滴度约为 5 × 10 13至 1 × 10 14 vg/mL 范围，总颗粒范围约为 1.2 × 10 13至 2.1 × 10 13 vg。

额外的质量控制检测

方案 1： SDS-PAGE 分析衣壳蛋白

实验室用品

1.NuPAGE 4–12%，Bis-Tris 凝胶，1.5 mm × 15 孔（ Thermo Fisher，目录号：NP0336BOX）
2.PageRuler Plus预染色蛋白梯，10–250 kDa （ Thermo Scientific，目录号：PL26620）
3.NuPAGE LDS 样品缓冲液（4×）（ Thermo Fisher，目录号：NP0007）
4.NuPAGE MES SDS 缓冲液套件（用于 Bis-Tris 凝胶）（ Thermo Fisher，目录号：NP0060）
5.SimplyBlue SafeStain （ Thermo Fisher，目录号：LC6060）
6.2-巯基乙醇（ Thermo Fisher，目录号：21985023）

设备

1.Invitrogen PowerEase Touch 120W 电源和迷你凝胶槽（ Thermo Fisher，目录号：PSC120MB）或同等产品
2.Invitrogen iBright FL 15000 成像系统或任何其他凝胶成像系统

程序

A.样品制备（第一天）
1.补充有 β-巯基乙醇（1:20 稀释，0.25 µL）的 4× Laemmli缓冲液移入 0.5 mL 微量离心管中。
2.添加 AAV 样品（总共 1.0 × 10 11 vg）至 15 µL。
3.2 O补足 20 µL。
4.将样品在 100°C 下加热 5 分钟。这可以使用任何 PCR 机器来完成。

B.设置凝胶槽并进行电泳
1.2 O稀释 20 倍来制备电泳缓冲液。
2.从预制凝胶中取出梳子，并用 H 2 O 或电泳缓冲液冲洗孔。
3.撕掉凝胶底部的胶带。
4.将凝胶插入凝胶槽中的槽中，使集成的上部缓冲液室面向池的中心。
5.加载样品。
6.在室温下以 120 V 恒定电压运行凝胶 110 分钟，或直至染料前沿从凝胶上跑掉。

C.凝胶染色
电泳结束后，将凝胶移至容器中，用去离子水洗涤凝胶3次，每次5分钟，以去除SDS和缓冲盐。
1.添加足够体积 (~20 mL) 的 SimplyBlue SafeStain以覆盖整个凝胶，并在室温下轻轻摇动或使用摇杆平台孵育 1 小时。
2.吸出或倾析染色溶液，并用 100 mL 去离子水加 20 mL 20% NaCl (w/v) 替换 1 小时。凝胶可以在该脱色溶液中放置过夜。
3.使用任意图像分析仪获取图像（参见图 8 中的示例）。

图8. SDS-PAGE。 1. AAV9-EF1-N-cG产生1F11贴壁细胞。 2.AAV9-EF1-N-cG。突出的 VP1、VP2 和 VP3 条带应可见。然而，可以观察到可能源自衣壳蛋白、铁蛋白或来源未知的小条带（Sen 等人，2013；Wang 等人，2016；Nass 等人，2018；Zolotukhin等人， 1999）。

方案 2：感染性测定
感染性 AAV 颗粒可以通过测量感染后细胞内载体基因组的存在来确定。虽然这种方法并不能准确反映生物活性（ François 等人。，2018），它可以适应任何类型的培养细胞和血清型。

实验室用品

1.HEK293T（ATCC，目录号：CRL-3216）
2.杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），高葡萄糖（VWR，目录号：MT10013CM）
3.胎牛血清（FBS）（VWR，目录号： MT35010CV）
注意：每批都需要测试细胞生长。
4.胰蛋白酶-EDTA（1×）（ GenDEPOT ，目录号：CA014-100）
5.抗生素抗真菌剂（×100）（ GenDEPOT ，目录号：CA002-100）
6.EZNA 组织 DNA 试剂盒（Omega，目录号：D3396-01）
7.24孔细胞培养板（Falcon，目录号：353047）
8.15厘米组织培养皿（Falcon，目录号：353025）

设备

1.NanoDrop分光光度计或同等设备，可测量小体积 DNA 的 OD

程序

将细胞维持在 15 cm 培养皿中，生长培养基由 DMEM/10% FBS/1 ×抗生素抗真菌剂组成，置于湿润 CO 2培养箱 (5% CO 2 ) 中，温度为 37 °C 。细胞每周分裂两次。

A.感染细胞的准备（第 1 天）
1.吸出介质。
2.用 10 mL 的 PBS 冲洗细胞。
3.吸出介质并覆盖 1 mL 的胰蛋白酶。
4.孵育 1-2 分钟或直至所有细胞变圆。
5.轻轻敲击培养皿的侧面以分离细胞。
6.添加 9 mL 的生长介质。
7.使用细胞计数器测量细胞密度（参见主协议的 A 部分）。
8.用生长培养基将细胞稀释至 200,000 个细胞/mL，并以 0.5 mL/孔等分至 24 孔板中，一式两份或一式三份。
注意：不要忘记控制孔（无感染控制）。

B.感染（第 2 天）
1.将 2 µL 系列稀释的 AAV 添加到每个孔中。
2.通过摇动盘子进行混合。

C.收获细胞用于 DNA 提取
1.二十四小时后，计数对照孔中的细胞数并确定/孔的细胞总数。
注意： HEK293T 细胞松散地附着在培养皿上。通过移入和移出即可轻松分离它们。如果不是，请考虑使用胰蛋白酶分离细胞，如步骤 A 中所述。
2.将细胞转移到 1.5 mL MCT 中。
3.用 0.5 mL 的 DPBS 冲洗孔并合并。
4.将细胞以 335 × g离心 1 分钟。
5.吸出上清液并用 1 mL 的 DPBS 洗涤细胞两次。
6.用 0.2 mL 的 PBS 重新悬浮细胞。
7.根据制造商的说明，使用 EZNA 组织 DNA 试剂盒从细胞中提取 DNA。
8.用 100 µL 洗脱缓冲液洗脱 DNA。
9.测量 OD 260nm以确定 DNA 浓度。
10.使用 5 µL 洗脱液执行 qPCR，如主协议 J 部分所述，以确定感染性。

数据分析

1 ng 基因组 DNA 中掺入 1 个载体 DNA 的量 = 1 ng × 6,424 bp（AV0-EF1-N-cG 作为标准）/6.37 × 10 9 bp （女性基因组 DNA）（Piovesan ）等人。 , 2019) = 1.0085 × 10 -6纳克。虽然AAV是单链DNA病毒，但第二链是在AAV被细胞摄取后合成的。
使用以下公式计算感染滴度：
感染滴度 ( ivg /mL) = (拷贝数/基因组) × (感染后 24 小时的细胞数) × 0.5 (使用 2 µL AAV) × 1,000 µL
=（qPCR 软件中的浓度（以 ng/μL 为单位））/（1.0085 × 10 -6 ng × DNA 浓度（以 ng/μL 为单位））×（细胞数）× 500。
注意：由于血清型特异性附着位点，各种 AAV 血清型的感染滴度在 HEK293T 细胞上有所不同(Weinmann et al., 2022) 。一般来说，用 2 µL 纯化的 AAV 感染细胞足以估计感染滴度。 HEK293 细胞上 AAV9 颗粒（基因组滴度）：感染性颗粒（感染滴度）的典型比率为 5,000–10,000:1。

方案 3：电子显微镜分析空的和完整的 AAV 颗粒

试剂、实验室用品和设备

1.佩尔科 EasiGlow放电套件（Ted Pella, Inc.，目录号：9100S）
2.Quantifoil 2/2 200Cu + 2 nm ThinC网格（ Quantifoil Micro Tools GmbH，耶拿，德国）
3.120 kV JOEL 1230 电子显微镜（JOEL Ltd，日本）或同等设备
4.干燥器（任意）
5.2% 乙酸双氧铀（Fisher Scientific，目录号：NC1085517）

样品制备

1.稀释 AAV (~0.5–1 × 10 9 vg/μL)。
2.打开Pelco EasiGlow持续 10 秒，电流值为 15 µA，真空度为 ~200 psig 。
3.将 5 µL 样品沉积到辉光放电Quantifoil 2/2 200Cu + 2 nm ThinC网格上。
4.将碳层孵育 3 分钟。
5.使用 Whitman 541 滤纸吸走多余的缓冲液。
6.清洗网格并用 20 µL H 2 O吸干两次。
7.用 20 µL 2% 乙酸双氧铀清洗并印迹。
8.滴加 20 µL 2% 乙酸双氧铀并在印迹前孵育 1 分钟。
9.将网格在干燥器中干燥至少 2 小时或过夜。

影像学

1.将网格放入电子显微镜中。
2.随机选择至少 10 个字段。

数据分析

1.下载 NIH ImageJ https://imagej.net/ij/index.html 。
2.将本机 .dm3 文件转换为 .tiff 文件。
3.计算完整和空衣壳的数量。含有载体基因组的 AAV 衣壳（完整衣壳）表现为没有深色中心染色的颗粒，而空衣壳则具有染色中心（图9）。

图9. 负染色透射电子显微镜图像。 A. 由悬浮 1F11S 细胞产生的 AAV9-EF1-N-cG。 B. 由贴壁 1F11 细胞产生的 AAV9-EF1-N-cG。黑色圆圈表示没有深色中心的完整衣壳。红色圆圈表示空颗粒，颗粒中心有深色污点。白色圆圈表示之前被鉴定为铁蛋白的杂质 (Grieger 等人。，2016）。比例尺：100 nm。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.如果无法从 Fujifilm Irvine Scientific 获得预配制的BalanCD HEK293 介质，则可以使用他们的BalanCD HEK293 粉末。这种粉末需要您自己重新配制；食谱可以在食谱14中找到。
2.pH 平衡溶液的首选方法是使用 3 M NaOH 提高 pH 值，使用 3 M HCl 降低pH 值。
3.确保您使用高质量的 ddH 2 O。我们首选的水净化系统是配备 Millipore Biopak抛光机和Millipak Express 20 过滤器的 Millipore 系统。但是，您可以考虑使用等效系统，前提是它能提供高质量的水过滤。
4.如果离心后 qPCR 板孔中仍然存在气泡，请用手指轻轻弹动孔底部以驱散这些气泡。完成此操作后，将板放回离心机中，以 1,087 × g离心 1 分钟，然后运行 qPCR 循环。
5.根据您用于 qPCR 的 AAV 标准品的不同，计算滴度的公式可能会略有不同。滴度公式的除数取决于 AAV 标准质粒的大小。在我们的例子中，质粒载体 AV0-EF1-N-cG 的基因组大小为 6,424 bp 长 (3.88 × 10 6 Da)。因此，要确定滴度公式的除数，您需要执行以下方程（您可以将自己的基因组大小输入到该方程中）： 1 × 10 9 AAV ssDNA 分子的质量 = (3.88 × 10 6 Da × 1 × 10 9 /(6.02 × 10 23 × 0.5) = 3.222 纳克。

故障排除（表 5）

表 5.故障排除
问题解决
细胞聚集/聚集更换有挡板的锥形瓶并完全更换培养基。监测细胞生长/聚集 3-4 天。如果没有改善，则丢弃电池并解冻新电池。
在有挡板的锥形瓶内形成细胞环将细胞/培养基转移至新的带挡板的锥形瓶中。然而，该环尚未显示出对生产质量有害，因此如果您愿意，您可以选择继续培养这些细胞。
细胞生长缓慢每天监测细胞生长，必要时更换培养基。如果细胞没有恢复，则丢弃细胞并解冻新细胞。
细胞生长太快BalanCD HEK293 培养基稀释细胞。始终保持细胞密度在 3 × 10 5活细胞/mL 和 3 × 10 6活细胞/ mL之间。
带有挡板的锥形瓶中的细胞受到污染（表现为细胞过度浑浊和/或细胞生长异常快速）丢弃细胞并解冻新细胞。确保适当丢弃任何疑似污染的旧培养基，并使用全新的带挡板的锥形瓶。您可以考虑向烧瓶中添加 1× 抗生素/抗真菌剂，但请注意，这可能会抑制细胞生长；适当的无菌技术应足以防止污染。
空衣壳污染该方案经过优化，可最大限度地提高完整衣壳的效价。如果您的特定应用认为空衣壳的存在是不可接受的，则可以使用常规质粒比例（辅助质粒：Rep/Cap 质粒：AAV 穿梭载体 = 2:1:1）来减轻这种担忧。

致谢

这项工作得到了贝勒医学院和先进技术核心的普通基金的支持。 TEM 数据在贝勒医学院CryoEM ATC 收集，其中包括在 CPRIT 核心设施奖 RP190602 支持下购买的设备。我们感谢 Fujifilm Irvine Scientific 提供BalanCD HEK293 培养基和悬浮细胞适应方面的技术援助，以及MirusBio提供的转染试剂。我们还要感谢 William Lagor 博士对本手稿的评论以及 Issac Foresster在 EM 方面的技术援助。

利益争夺

作者声明不存在竞争的经济利益。

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